Способ повышения продукции секретируемого белка в культуре клеток

СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКЦИИ СЕКРЕТИРУЕМОГО БЕЛКА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК Данное изобретение относится к способу повышения продукции секретируемого белка в подпитываемой культуре клеток яичников китайского хомячка (СНО). Спрсоб включает трансфекцию линии клеток китайского хомячка вектором, содержащим полинуклеотид,кодирующий белок MDM2 с последовательностью SEQ ID NO: 2 и белок E1B19K с последовательностью SEQ ID NO: 6, и культивирование трансфицированной линии клеток СНО, сверхэкспрессирующей в результате трансфекции MDM2 и E1B19K, и гены, кодирующие секретируемый белок, где титр секретируемого белка составляет по меньшей мере 600 мг/л на 23 день культивирования клеток. Изобретение позволяет повысить эффективность производственного процесса путем увеличения выхода продукта. Дорэй Хайманти, Ли Селия, Соэрволд Макклейн Тина М. (US) Медведев В.Н. (RU)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: СЕНТОКОР ОРТО БАЙОТЕК ИНК. Область изобретения Данное изобретение относится к способу повышения жизнеспособности и продукции секретируемых белков в подпитываемых культурах эукариотических клеток. Предпосылки создания изобретения Культуры клеток млекопитающих являются системами, выбираемыми для производства многих рекомбинантных белков, благодаря их способности к синтезу белков с необходимыми посттрансляционными модификациями. С ростом потребностей в производстве возникает серьезная мотивация к повышению эффективности производственного процесса путем увеличения выхода продукта. Достижение выхода биологических действующих веществ порядка нескольких граммов на литр в коммерческом производственном процессе зависит от оптимизации как инженерных методов, так и методик культивирования клеток млекопитающих. Характерной проблемой существующих безбелковых культур клеток млекопитающих высокой плотности является проблема клеточной смерти, 80% которой в типичном подпитываемом биореакторе происходит путем апоптоза, возникающего в ответ на действие таких стресс-факторов, как нехватка питательных веществ и фактора роста, недостаток кислорода, накопление токсинов и напряжение при сдвиге (Goswami et al., Biotechnol. Bioeng. 62:632-640 (1999. Апоптоз лимитирует максимальную плотность жизнеспособных клеток, ускоряет наступление фазы гибели клетки и потенциально снижает выход гетерологичных белков (Chiang and Sisk, Biotechnol. Bioeng. 91:779-792(2005); Figueroa et al., Biotechnol. Bioeng. 73:211-222 (2001), Metab. Eng. 5:230-245 (2003), Biotechnol Bioeng. 85:589-600 (2004); Mercille andMassie, Biotechnol. Bioeng. 44:1140-1154 (1994. Апоптоз обусловлен действием сложной сети сигнальных путей, начинающихся как внутри клетки,так и во внешней среде, кульминацией которых является активация каспаз, играющих ключевую роль в протекании конечных стадий клеточной смерти. Существует опыт использования различных способов предотвращения апоптоза для поддержания жизнеспособности клеток в ходе длительных производственных циклов с использованием культур клеток млекопитающих (Arden and Betenbaugh, Trends Biotechnol. 22:174-180 (2004); Vives et al., Metab. Eng. 5:124-132 (2003. Изменение внеклеточной среды путем добавления к культуральной среде факторов роста, гидролизатов и лимитирующих питательных веществ приводит к повышению продукции белка и сокращению апоптоза (Burteau et al., In Vitro Cell Dev. Biol.Anim. 39:291-296 (2003); Zhang and Robinson, Cytotechnology 48: 59-74 (2005. Другие исследователи обращались к химическим и генетическим стратегиям с целью ингибирования сигнального каскада апоптоза изнутри клетки (Sauerwald et al., Biotechnol. Bioeng. 77:704-716 (2002), Biotechnol. Bioeng. 81:329-340(2003. Исследователи обнаружили, что сверхэкспрессия генов, обладающих повышенной активностью в раковых клетках, может продлить жизнеспособность клеток, выращиваемых в биореакторах, путем предотвращения апоптоза посредством воздействия на сигнальный каскад на этапах, предшествующих активации каспаз (Goswami et al., supra; Mastrangelo et al., Trends Biotechnol. 16:88-95 (1998); Meents et al.,Biotechnol. Bioeng. 80:706-716 (2002); Tey et al., J. Biotechnol. 79:147-159 (2000) and Biotechnol. Bioeng. 68:31-43 (2000. Антиапоптозные гены, функционирующие в митохондриальном апоптическом пути, можно разделить на три группы: 1) гены, действующие на ранних этапах данного пути, например члены семейства белков Bcl-2; 2) гены, действующие в середине пути и обуславливающие разрушение или ингибирование апоптосомного комплекса, например Aven; 3) гены, действующие на поздних этапах пути, например ингибиторы каспаз, XIAP. Функциональность большинства перечисленных генов исследовалась при помощи их сверхэкспрессии в экспрессионных системах млекопитающих, и в некоторых случаях был выявлен эффект комбинированной сверхэкспрессии двух или более генов, задействованных на различных этапах сигнального пути. Примерами могут быть 1) аддитивный эффект Bcl-XL и мутантного XIAP с делецией(XIAP) в клетках яичника китайского хомячка (СНО) (Figueroa et al., Metab. Eng. 5:230-245 (2003; 2)E1B-19K и Aven в клетках почек хомячка (BHK) (Nivitchanyong et al., Biotechnol. Bioeng. 98:825-841(2007; 3) Bcl-XL, Aven и XIAP (Sauerwald et al., Biotechnol. Bioeng. 81:329-340 (2003. Одним из основных активаторов апоптозного каскада является белок р 53. Вариантом механизма,посредством которого р 53 активирует апоптоз, является увеличение экспрессии группы генов проапоптозных белков, включая BNIP3 (Yasuda et al., J. Biol. Chem. 273:12415-21 (1998. Таким образом,повышение продукции р 53 может быть одним из основных факторов, запускающих апоптоз. р 53 может разрушаться в клетках посредством убиквитин-опосредованного пути деградации через MDM2 (Bond etal., Current Cancer Drug Target 5:3-8 (2005. Таким образом, сверхэкспрессия MDM2 потенциально может снижать уровень р 53 и, следовательно, ингибировать апоптоз. Ранее было показано, что в присутствии стрессовых сигналов клетки линии СНО, для которых характерна сверхэкспрессия MDM2, обладают способностью к более длительному выживанию в культуре в сравнении с диким типом СНО (в культуре полунепрерывного типа) (Arden et al., Biotechnol. Bioeng. 97:601-614 (2007. Описанные выше различные подходы, направленные на повышение продукции белка, применяются с различной степенью успешности. Тем не менее, существует постоянная необходимость в разработке способов повышения продукции белков, особенно в крупных промышленных масштабах. Краткое описание фигур Фиг. 1 - профили роста клеточных линий, полученных путем котрансфекции Bcl-2, MDM-2 иXIAP. Фиг. 2 - профили роста клеточных линий, полученных путем котрансфекции Bcl-XL, MDM-2 иXIAP. Фиг. 3 - профили роста клеточных линий, полученных путем котрансфекции E1B19K и MDM-2; А) плотность жизнеспособных клеток; В) интегрированная плотность жизнеспособных клеток; С) понижение активности каспазы 3/7. Фиг. 4 - профили роста клеточных линий, в которых проведена трансфекция MDM2D300A в культуре полунепрерывного типа во встряхиваемой колбе;A) хозяином при трансфекции являлись клетки 1013 А;B) хозяином при трансфекции являлись клетки С 1835 А. Фиг. 5 - профили роста клеток линии 1013 А, которым проведена трансфекция DM2D300A в культуре полунепрерывного типа во встряхиваемой колбе; А) плотность жизнеспособных клеток; В) % жизнеспособности. Фиг. 6 - титры антител в ходе культивирования клеток линии СНО в подпитываемой культуре. Краткое описание изобретения Одним из объектов изобретения является способ повышения продукции секретируемого белка в подпитываемой культуре клеток яичников китайского хомячка (СНО), включающий трансфекцию линии клеток китайского хомячка вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий белок MDM2 с последовательностью SEQ ID NO: 2 и белок E1B19K с последовательностью SEQ ID NO: 6, и культивирование трансфицированной линии клеток СНО, сверхэкспрессирующей в результате трансфекции MDM2 иE1B19K, и гены, кодирующие секретируемый белок, где титр секретируемого белка составляет по меньшей мере 600 мг/л на 23 день культивирования клеток. Согласно одному варианту указанного способа линия клеток СНО представляет собой СНО-K1. Согласно другому варианту указанного способа линия клеток СНО представляет собой CHO-K1SV. Согласно еще одному варианту указанного способа секретируемый белок содержит тяжелую цепь антитела и легкую цепь антитела. Подробное описание изобретения Все публикации, упоминаемые в данном описании, включая патенты и патентные заявки, но не ограничиваясь ими, включенные путем ссылок, являются частью настоящего документа, как если бы они были изложены непосредственно в настоящем документе. Используемые в настоящем описании и в формуле изобретения формы единственного числа указывают на множественные объекты, если иное не следует явно из контекста. Например, при употреблении понятия "полипептид" подразумевается один или несколько полипептидов, а также эквивалентные понятия, известные специалистам. Под обозначением MDM2 в настоящем документе подразумевается ген MDM2 человека (гомологMDM2 р 53-связывающего белка), имеющий полипептидную последовательность, занесенную в базу данных GenBank под номером NP002383 (SEQ ID NO: 1 и 2). Под обозначением Е 1 В 19K в настоящем документе подразумевается человеческий белок Е 1 В 19K,имеющий полипептидную последовательность, занесенную в базу данных GenBank под номеромNP004322 (SEQ ID NO: 5 и 6). Под понятием "апоптозныеR гены" в настоящем документе подразумеваются гены, кодирующие белки, которые при сверхэкспрессии в клетке обеспечивают повышенную устойчивость к клеточной смерти в сравнении с клетками, не подвергавшимися трансфекции. Типичными апоптознымиR генами являются антиапоптозные члены семейства Bcl-2, включая Bcl-2, Bcl-XL, Blc-w или Е 1 В 19K, ингибиторы каспаз, например семейство IAP (ингибиторы апоптоза), включая XIAP и XIAP, а также другие белки, принимающие участие в регуляции жизненного цикла клетки, например р 27 и MDM2 (Arden et al.,BioProcessing J. March/April 23-28 (2004); Sauerwald et al., Bioprocessing J. Summer 2002, 61-68 (2002);Arden et al., Biotechnol. Bioengineer. 97:601-614, (2007. Частота возникновения клеточной смерти может быть оценена хорошо известными в современной науке способами, например путем определения показателя плотности жизнеспособных клеток (VCD) и процента (%) жизнеспособности, а также путем расчета интегрированной плотности жизнеспособных клеток (IVCC). Активация апоптоза может быть оценена путем определения активности каспаз с использованием хорошо известных способов. Понятие "полипептид" обозначает молекулу, включающую в себя по меньшей мере два аминокислотных остатка, связанных пептидной связью. Малые полипептиды, содержащие менее 50 аминокислотных остатков, могут называться "пептидами". Полипептиды также могут носить название "белков". Понятие "полинуклеотид" обозначает молекулу, включающую в себя цепочку нуклеотидов, ковалентно связанных через сахарофосфатный остов или через другую эквивалентную ковалентную химическую структуру. Двухцепочечные и одноцепочечные молекулы ДНК и РНК представляют собой типичные примеры полинуклеотидов. Понятие "комплементарная последовательность" обозначает вторую изолированную полинуклеотидную последовательность, антипараллельную первой изолированной полинуклеотидной последовательности, и состоящую из нуклеотидов, комплементарных нуклеотидам первой полинуклеотидной последовательности. Как правило, такие "комплементарные последовательности" при контакте с первой изолированной полинуклеотидной последовательностью в соответствующих условиях способны к образованию двухцепочечных полинуклеотидных молекул, таких как двухцепочечные молекулы ДНК или двухцепочечные молекулы РНК. Понятие "вектор" обозначает полинуклеотид, способный к удвоению в биологической системе или к перемещению между такими системами. Полинуклеотиды-векторы, как правило, содержат элементы,такие как точки начала репликации, сигнал полиаденилирования или маркеры выбора, обеспечивающие дупликацию или сохранение таких полинуклеотидов в биологической системе. Примерами упомянутых биологических систем могут служить клетки, вирусы, животные, растения и реконструированные биологические системы, использующие биологические компоненты, способные к удвоению вектора. Полинуклеотидами, включающими в свой состав вектор, могут быть молекулы ДНК или РНК либо их гибриды. Понятие "вектор экспрессии" обозначает вектор, который может использоваться в биологической системе или реконструированной биологической системе для прямой трансляции полипептида, закодированного полинуклеотидной последовательностью, содержащейся в векторе экспрессии. В настоящем документе понятие "подпитываемая культура клеток" обозначает культуру клеток,выращиваемую на основе подачи лимитирующего рост питательного субстрата в культуру. Стратегия подпитки, как правило, используется в биопромышленных процессах для достижения высокой плотности клеток в биореакторе. Для повышения жизнеспособности и, в конечном итоге, продуктивности подпитываемых культур клеток было разработано множество стратегий. В настоящем изобретении описывается альтернативный подход, при котором используется сверхэкспрессия комбинации апоптозныхR генов в клетке-хозяине. Клетки, в которых благодаря биоинженерии осуществляется сверхэкспрессия какMDM2, так и E1B19K, продемонстрировали неожиданно высокий прирост производства секретируемых белков, учитывая опубликованные результаты, согласно которым экспрессия только MDM-2 позволяла повысить продуктивность максимум в 2 раза (Arden et al., Biotechn. Bioengin. 97:601-614, 2007), a экспрессия E1B19K, хотя и позволяла ингибировать апоптоз и улучшать показатели воспроизводства клеток, не приводила к повышению продуктивности синтеза секретируемых белков клеткой (WO 2007/124106 A2 of Betenbaugh). Кроме того, клеточные линии, выведенные в ходе исследований, описанных ниже в примерах, у которых наблюдалась сверхэкспрессия только E1B19K, характеризовались показателями роста ниже оптимальных и низкими уровнями экспрессии. Таким образом, настоящее изобретение демонстрирует заметное положительное влияние совместной экспрессии MDM2 и E1B19K на продуктивность синтеза секретируемых белков в клетках млекопитающих. Настоящее изобретение также описывает искусственный мутантный ген MDM2, нашедший применение в реализации способов, являющихся объектами изобретения. Одним из вариантов осуществления изобретения является способ повышения жизнеспособности клеток в подпитываемой культуре клеток млекопитающих, включающий культивирование линии клеток млекопитающих, сверхэкспрессирующей один или несколько апоптозныхR генов, и оценку жизнеспособности клеток. Способы, являющиеся объектом изобретения, полезны для повышения жизнеспособности подпитываемых культур клеток млекопитающих, таких как культуры клеток яичников китайского хомячка(СНО), культуры клеток миеломы или гибридомных клеток. В частности, способы, являющиеся объектом изобретения, полезны для повышения показателя интегрированной численности жизнеспособных клеток (IVCC) в культурах клеток СНО. Клеточные линии, применяемые при реализации способов, являющихся объектами изобретения, характеризуются экспрессией одного или нескольких апоптозныхR генов. В частности, могут использоваться гены, кодирующие MDM2 (SEQ ID NO: 1 и 2), MDM2D300A(SEQ ID NO: 3 и 4), E1B19K (SEQ ID NO:5 и 6), Aven (SEQ ID NO: 7 и 8), Bcl-LX (SEQ ID NO: 9 и 10),Bcl-2A (SE ID NO: 11 и 12), XIAP (SEQ ID NO: 13 и 14). Экспрессия апоптозныхR генов может быть достигнута с помощью методик трансфекции, известных специалистам. Создаваемые клеточные линии являются превосходными клетками-хозяевами для получения производственных клеточных линий, экспрессирующих необходимые белки, такие как пептиды, пептиды слияния, факторы роста, гормоны, антитела, сконструированные белки с анкириновыми повторами (DARPin) и другие полипептиды, используемые для решения терапевтических, диагностических и исследовательских задач. В число линий клеток СНО, используемых в реализации способов, являющихся объектами изобретения, входят линииCHO-K1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) и CHOK1SV (Lonza Biologies, Slough, UK). В число линий клеток миеломы, используемых в реализации способов, являющихся объектами изобретения, входят линии NS0 иSp2/0. В настоящем изобретении использование клеточных линий, сверхэкспрессирующих апоптозныеR гены, позволяет достичь значений показателя IVCC, приблизительно в два раза превышающего аналогичный показатель для контрольных клеток, увеличить длительность существования подпитываемых культур на срок до 7 дней и повысить продукцию секретируемых белков в 2-7 раз. Такое повышение продуктивности является значимым и может позволить снизить затраты на производство сложных биологических продуктов, при одновременном получении продукта более высокого качества благодаря отсутствию клеточного лизиса нежизнеспособных клеток, поскольку лизированные клетки могут высвобождать протеазы, ухудшающие качество продукта. Соответственно, эти линии являются превосходными клетками-хозяевами для получения производственных клеточных линий, экспрессирующих необходимые белки. Например, клеточная линия СНО,сверхэкспрессирующая MDM2D300A, позволяет достичь 2-кратного увеличения значений показателяIVCC и сохраняет жизнеспособность на 7 дней дольше в сравнении с контрольной клеточной линией. Другим вариантом осуществления изобретения является способ повышения продукции секретируемых белков в подпитываемой культуре клеток СНО, включающий культивирование клеточной линии СНО, сверхэкспрессирующей по меньшей мере один апоптозныйR ген, а также одного или нескольких генов, кодирующих секретируемый белок, с определением титра секретируемого белка. Особенно подходящими клеточными линиями для осуществления способов, являющихся объектами изобретения, являются линии СНО, сверхэкспрессирующие MDM2 и E1B19K, и клеточная линия, сверхэкспрессирующая только MDM2D300A. Использование этих клеточных линий при реализации способов, являющихся объектом изобретения, позволяет повысить титры секретируемых белков в 5-7 раз при применении подпитываемой культуры со сроком существования до 21 дня. Сверхэкспрессия белков в клетке как кратковременная, так и стабильная, может быть достигнута хорошо известными способами (Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 2nd ed., AppletonLange,Norwalk, CT, 1994; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001). В настоящем изобретении также представлены изолированные мутантные полинуклеотиды MDM2,векторы, включающие в себя эти полинуклеотиды, изолированные клетки-хозяева, полипептиды, которые могут быть получены при экспрессии данных полинуклеотидов, способы экспрессирования полипептидов, являющихся объектом изобретения, и способы использования полинуклеотидов и полипептидов, являющихся объектами изобретения. Соединения и способы, являющиеся объектами изобретения,могут использоваться в различных сферах. Полезность полинуклеотидов и векторов, являющихся объектами изобретения, обусловлена тем, что они кодируют мутантные полипептиды MDM2 и могут использоваться для экспрессирования этих полипептидов. Полезность мутантных полипептидов MDM2 обусловлена возможностью их использования для повышения жизнеспособности клеток и увеличения производства секретируемых белков клетками путем рекомбинантного достижения сверхэкспрессии или внедрения в клетки животного или ткани-хозяина иным способом. Одним из объектов изобретения является изолированный полинуклеотид, содержащий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3 или комплементарную последовательность. Полинуклеотидная последовательность, приведенная в SEQ ID NO: 3, кодирует полипептид, представляющий собой мутантный человеческий MDM2D300A. В MDM2D300A, предполагаемый сайт расщепления каспаз (AspValProAspCysLysLys), выявляемый у MDM2 дикого типа, был уничтожен для придания MDM2 большей устойчивости к распаду и, соответственно, достижения более высоких концентраций MDM2 в клетке в ходе культивирования. Полинуклеотиды, являющиеся объектом изобретения, могут быть получены путем химического синтеза, такого как твердофазный синтез полинуклеотидов, в автоматическом синтезаторе полинуклеотидов. Либо полинуклеотиды, являющиеся объектом изобретения, могут быть получены с использованием других методик, таких как ПЦР-дупликация, векторная дупликация или методики манипуляции ДНК с использованием рестрикционных ферментов. Методики производства или получения полинуклеотидов с заданной последовательностью хорошо известны в современной науке. Полинуклеотиды, являющиеся объектом изобретения, также содержат по меньшей мере одну некодирующую последовательность, такую как транскрибируемые, но нетранслируемые последовательности,сигналы терминации, сайты связывания рибосомы, последовательности, стабилизирующие мРНК, интроны и сигналы полиаденилирования. Полинуклеотидные последовательности также могут включать в себя дополнительные последовательности, кодирующие дополнительные аминокислоты. Такие дополнительные полинуклеотидные последовательности могут, например, кодировать маркер или метку, например гексагистидиновый пептид (Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86:821-284 (1989) или гемаглютининовую пептидную метку (Wilson et al., Cell 37:767-778 (1984, способствующие очищению составных белков, полученных путем слияния. Другим объектом изобретения является вектор, содержащий изолированный полинуклеотид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3. Векторы, являющиеся объектом изобретения, используются для сохранения полинуклеотидов, удвоения полинуклеотидов или управления экспрессией полипептидов, кодируемых вектором, в биологических системах, включая реконструированные биологические системы. Векторы могут иметь хромосомальное, эписомальное и вирусное происхождение, к ним могут относиться векторы, полученные из бактериальных плазмид, бактериофагов, транспозонов, эписом дрожжей, вставочных элементов, хромосомальных элементов дрожжей, бакуловирусов,паповавирусов, таких как SV40, вирусов коровьей оспы, аденовирусов, вирусов птичьей оспы, вирусов псевдобешенства, пикорнавирусов и ретровирусов, а также векторы, полученные из комбинаций указан-4 020610 ных выше элементов, такие как космиды и фагмиды. Векторы, являющиеся объектом изобретения, могут быть представлены в форме микрочастиц с вспомогательными веществам, липидами, буферными веществами или иными наполнителями в зависимости от конкретной сферы применения. В одном из вариантов осуществления изобретения вектор представляет собой вектор экспрессии. Векторы экспрессии, как правило, содержат элементы последовательности нуклеиновых кислот, которые позволяют контролировать, регулировать, активировать или допускать экспрессию полипептидов, кодируемых данным вектором. Такие элементы могут содержать сайты связывания энхансера транскрипции,сайты инициации РНК-полимеразы, сайты связывания рибосом и другие сайты, способствующие экспрессии закодированных полипептидов в данной экспрессионной системе. Такие экспрессионные системы могут быть клеточными или бесклеточными системами, хорошо известными в современной науке. Элементы последовательностей нуклеиновой кислоты и последовательностей исходного вектора, пригодные для использования в процессе экспрессии закодированных полипептидов, также хорошо известны в современной науке. Примером плазмидного вектора экспрессии полипептидов, являющегося объектом изобретения, может служить вектор, включающий в себя точку начала репликации из Е. coli, ген резистентности к канамицину за счет aph(3')-1a, промотор немедленного раннего типа с интроном А из генаHCMV, синтетическую полиА-последовательность и терминатор из гена бычьего гормона роста. Другим примером плазмидного вектора экспрессии может служить вектор, содержащий точку начала репликации из Е. coli, ген резистентности к канамицину за счет ant(4')-1a, длинные концевые повторяющиеся последовательности из вируса саркомы Рауса, промотор немедленного раннего типа из гена HCMV и позднюю полиА-последовательность SV40. Другим вариантом осуществления изобретения являются изолированные клетки-хозяева, имеющие вектор, являющийся объектом изобретения. В числе репрезентативных приборов клеток хозяина можно назвать клетки архей; бактериальные клетки, такие как Streptococci, Staphylococci, Enterococci, E. coli,Streptomyces, цианобактерии, В. subtilis и S. aureus; клетки грибов, таких как Kluveromyces, Saccharomyces, Basidomycete, Candida albicans или Aspergillus; клетки насекомых, таких как Drosophila S2 и Spodoptera Sf9; клетки животных, такие как СНО, COS, HeLa, C127, 3 Т 3, BHK, 293, CV-1, клетки меланомы Боуэса и миеломы; клетки растений, такие как клетки голосемянных и покрытосемянных. Клетки-хозяева для реализации способов, являющихся объектами изобретения, могут поставляться в виде индивидуальных клеток или популяций клеток. Популяции клеток могут представлять собой изолированные или культивированные популяции, либо клетки могут находиться в матриксе (ткани). Введение полинуклеотида, такого как вектор, в клетку-хозяина может быть произведено с помощью способов, хорошо известных специалистам (Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 2nd ed., AppletonLange, Norwalk, CT, 1994; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001). К этим способам относятся трансфекция с использованием фосфата кальция, трансфекция с обработкой DEAE-декстраном, микроинъекция, трансфекция через катионные липиды, электропорация, трансдукция, введение при соскабливании, баллистическое введение и инфицирование. Другим вариантом осуществления изобретения является изолированный полипептид, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4. Последовательность SEQ ID NO: 4 представляет собой полипептид, являющийся вариантом человеческого белка MDM2 с замещением D300A. Полипептиды, являющиеся объектом изобретения, могут быть получены путем химического синтеза, такого как твердофазный синтез пептидов, в автоматическом синтезаторе пептидов. Либо полипептиды, являющиеся объектом изобретения, могут быть получены на основе полинуклеотидов, кодирующих эти полипептиды с использованием бесклеточных экспрессионных систем, таких как экспрессионные системы на основе лизата ретикулоцитов, экспрессионные системы на основе пшеничных зародышей и экспрессионные системы на основе Escherichia coli. Полипептиды, являющиеся объектом изобретения, также могут быть получены путем экспрессии и изоляции из клеток-носителей нуклеотидной последовательности,являющейся объектом изобретения, с использованием методик, хорошо известных в современной науке,таких как рекомбинантная экспрессия легкоизолируемых полипептидов с аффинными метками. Существуют и иные методики получения полипептидов, являющихся объектом изобретения. Полипептиды, являющиеся объектом изобретения, могут включать в себя полипептиды слияния, представляющие собой полипептиды, являющиеся объектом изобретения, объединенные со вторым полипептидом. Таким вторым полипептидом может быть лидерная или секреторная сигнальная последовательность, пре-, про- или препробелковые последовательности, а также естественные или частично синтетические последовательности, полученные частично из естественных последовательностей или полностью синтезированные искусственно. Другим вариантом осуществления изобретения является способ экспрессии полипептидов, включающий стадии получения клетки-хозяина, являющейся объектом изобретения; культивирования клеткихозяина в условиях, достаточных для экспрессии по меньшей мере одного полипептида, обладающего последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4. Клетки-хозяева могут культивироваться в любых условиях, подходящих для поддержания или уве-5 020610 личения численности данного типа клеток и достаточных для экспрессии полипептида. Условия культивирования, среда и соответствующие способы обработки, достаточные для экспрессии полипептидов,хорошо известны в современной науке. Например, многие типы клеток млекопитающих могут культивироваться в аэробной среде при 37C с использованием соответствующей забуференной среды DMEM,тогда как клетки бактерий, дрожжей и некоторые другие могут культивироваться при 37C при соответствующих атмосферных условиях с использованием среды LB. Экспрессия полипептида в рамках способов, являющихся объектом изобретения, может быть подтверждена с использованием различных методик, хорошо известных в современной науке. Например,экспрессия MDM2A300D может быть подтверждена методом вестерн-блоттинга или путем оценки способности MDM2A300D к ингибированию каспаз. Ниже приведены примеры, описывающие настоящее изобретение, но не ограничивающие его. Примеры В следующих примерах был проведен анализ линий клеток СНО, сверхэкспрессирующих апоптозныеR гены в культурах во встряхиваемой колбе, определялась пиковая плотность жизнеспособных клеток, длительность существования культуры, активация каспаз 3/7 и повышение производства секретируемых белков. Материалы и способы. Культура клеток. Линия клеток CHOK1SV (Lonza Biologics, Slough, UK), взятая в качестве контрольной клеточной линии С 1013 А, и линия CHOK1 (American Type Culture Collection, Manassas, USA), взятая в качестве контрольной клеточной линии С 1835, культивировались в среде CD-CHO ( в каталоге: 10743-011, Invitrogen, Carlsbad, СА), содержащей 30 мМ глюкозы с добавкой 6 мМ L-глутамина (Invitrogen,в каталоге: 10313-021). В некоторых случаях использовалась иная животная безбелковая среда, содержащая различные вещества в различных концентрациях, включая 60 мМ глюкозы (высокоглюкозная среда). Эмбриональная бычья сыворотка была заказана в Hyclone Labs, Logan, UT ( в каталоге: SH30071.03). Культуры клеток подвергались анализу с помощью автоматического счетчика клеток Cedex (Innovatis,Germany). Интегрированная численность жизнеспособных клеток (IVCC, клеток в день/мл) вычислялась по следующей формуле:pBUDCE4.1, разработанный для конститутивной экспрессии E1B-19K (промотор EF-1a), отдельно или в соединении с Aven (промотор CMV) (Nivitchanyong et al., Biotechnol. Bioeng. 98:825-841 (2007. Был описан вектор, экспрессирующий XIAP (промотор CMV) (Sauerwald et al., Biotechnol. Bioeng. 77:704716 (2002. Вектор экспрессии MDM2D300A был получен путем мутагенеза in vitro из вектора экспрессииMDM2. Модельный вектор экспрессии антител (Ab1) был сконструирован путем клонирования тяжелой и легкой цепей кДНК в глутаминсинтазный (ГС) вектор экспрессии (получен из Lonza Biologies,Slough, UK, по исследовательской лицензии). Создание апоптозныхR клеточных линий. Была проведена трансфекция различных сочетаний векторов экспрессии в клетки экспоненциальной культуры CHOK1SV, как показано на табл. 1. Трансфектомы отбирались с использованием сочетания гигромицина 400 мкг/мл, гентицина 400 мкг/мл или зеоцина 300 мкг/мл. Около 200 полученных трансфектом были перенесены на 24-луночный планшет, затем была проанализирована активность каспаз 3/7 с помощью анализа APO-ONE (Promega, Madison, WI). Проводилось два измерения: a) в фазе раннего роста (3-й день после посева) после обработки стауроспорином, провоцирующим апоптоз; и b) позже в фазе роста (10-й день после посева), в этот момент субпопуляция клеток дикого типа перешла в фазу апоптоза. В обоих случаях была продолжена культивация трансфектом, снижавших активность каспаз 3/7, первые два-четыре клона были подвергнуты исследованиям профиля роста в условиях встряхивания полунепрерывной культуры. Линии клеток, продемонстрировавшие многообещающие результаты, были заморожены. Культуры отобранных линий во встряхиваемых колбах тестировались на снижение активности каспаз 3 методомBioscience;в каталоге: 68652 Х/550557). Отобранные клеточные линии были подвергнуты Скодированию и помещены в банк клеток. Эти линии клеток прошли от 10 до 15 этапов исследования стабильности в отсутствие антибиотиков, которые использовались как агенты отбора. Полученные клеточные линии перечислены в табл. 1. Для отобранного набора клеточных линий экспрессия каждого транс-6 020610 гена была подтверждена с помощью вестерн-блоттинга. Таблица 1 Культуры апоптозныхR клеток во встряхиваемых колбах. Отобранные апоптозныеR клеточные линии культивировались в полунепрерывном режиме в средеCD-CHO с добавкой 6 мМ глутамина и необходимых агентов отбора антибиотиков. Среда CD-CHO имела в своем составе 30 мМ глюкозы. Кроме того, избранные Ab-экспрессирующие линии клеток подвергались культивированию в специально созданной животной безбелковой среде с добавкой 6 мМ глутамина и 60 мМ глюкозы. Анализ активности каспаз 3/7. Был проведен посев приблизительно по 3105 клеток каждого клона в 1 мл питательной среды, на 24-луночном планшете. На 4-й день после посева (d4) около 1105 клеток было перенесено на 96 луночный планшет. К клеткам, инкубированным в течение 16 ч до проведения анализа активности каспаз 3/7 с использованием аналитического комплекта APO-ONE kit (BD Labs), был добавлен стауроспорин (2 мкМ fc). Процедура была повторена на 10-й день за исключением добавления стауроспорина. Клоны,имевшие значимо более низкую активность каспазы 3/7 в оба указанных дня, были перенесены во встряхиваемые колбы. АпоптозныйR характер отобранных клонов был подтвержден анализом методом проточной цитометрии (см. ниже). Анализ апоптозныхR клонов с помощью проточной цитометрии. Из каждой встряхиваемой колбы на 24-луночные планшеты было перенесено около 1106 клеток из экспоненциальных культур, проведена инкубация со стауроспорином (2 мкМ fc) в течение 16 ч, клетки отобраны и один раз промыты в фосфатно-солевом буферном растворе. Затем клетки были подвергнуты инкубации с CytoPerm ( в каталоге: 2075KK, BD BioScience) с целью достижения их фиксации и проницаемости. После отмывки в фосфатно-солевом буферном растворе клетки инкубировались с FITCмечеными антителами к каспазе 3 ( в каталоге: 68654, BD BioScience) перед анализом методом проточной цитометрии. Пример 1. Влияние MDM2 на линии клеток, экспрессирующие Bcl-2. Был проведен анализ профилей роста (встряхивание/полунепрерывная культура) линий ВМХ-13 и ВМХ-39, экспрессирующих Bcl-2, MDM2 и XIAP, а также дважды подвергнутых трансфекции линий клеток ВХ-61, экспрессирующих Bcl-2 и XIAP, В-31, экспрессирующих только Bcl-2, и контрольной линии С 1013 А. Пиковая численность жизнеспособных клеток (VCD) для контрольной линии клеток достигла величины 6106 клеток/мл, тогда как для клонов ВМХ этот показатель составил 1110 е 6 клеток/мл. Клеточные линии, экспрессирующие Bcl-2 и(или) XIAP, характеризовались промежуточными значениями VCD (фиг. 1 А). Клоны ВМХ обладали более высокими значениями показателя интегрированной численности жизнеспособных клеток (IVCC) в сравнении с В-31 или ВХ-61. Для ВМХ-39 наблюдалось превышение IVCC над контрольными значениями на 44%, в сравнении с 23% для В-31. Для XIAP не было отмечено повышения IVCC при использовании в сочетании с Bcl-2 (фиг. 1 В). Высокие показателиIVCC коррелируют с высокой жизнеспособностью клеток в длительно существующих культурах в биореакторе, что приводит к повышению выхода производимого продукта. Кроме того, биофармацевтические вещества, произведенные клеточными линиями, полученными от апоптозныхR клеток-хозяев, могут обладать более высоким качеством. Для клеточных линий ВМХ-13 и ВМХ-39 было отмечено снижение активности каспаз 3/7 в 10 раз и 16 раз соответственно в сравнении с контрольной линией С 1013 А, что подтверждает антиапоптозное влияние генов, включенных в линию клеток СНО. Линии В-31 и ВХ-61 характеризовались снижением активности каспаз в 12 и 6 раз. Пример 2. Влияние MDM2 на линии клеток, экспрессирующих Bel-XL. Была проведена оценка профилей роста трижды подвергнутых трансфекции линий BxMX-01,BxMX-11 и BxMX-25, экспрессирующих Bcl-XL, MDM2 и XIAP, в сравнении с Вх-51, экспрессирующей только Bcl-XL, а также с контрольной линией клеток С 1013. Пиковая численность жизнеспособных клеток (VCD) для контрольной линии клеток достигла величины 610 е 6 клеток/мл, тогда как для клоновBxMX этот показатель достиг величины порядка 1210 е 6 клеток/мл (фиг. 2 А). Клеточные линии, экспрессирующие только Bcl-XL, характеризовались промежуточными значениями VCD. Например, пиковое значение параметра VCD для клеточной линии Вх-51 составило 1010 е 6 клеток/мл. Клоны BxMX характеризовались более высокими значениями IVCC в сравнении с Вх-51, прирост IVCC относительно контрольного уровня составил 34%, в сравнении с 18% для Вх-51 (фиг. 2 В). Котрансфекция только BclXL и MDM2 (без XIAP) не привела к получению клеточных линий с повышенным значением VCD или с увеличенной продолжительностью существования культуры (данные не приводятся). Таким образом,вероятно, что XIAP и MDM2 действуют синергетически в отношении достижения высоких значенийIVCC, наблюдаемых для линий клеток BxMX-01, BxMX-11 и BxMX-25. Было показано, что активность каспаз 3/7 снизилась в 7, 5, и 8 раз для линий BxMX-01, BxMX-11 и BxMX-25, соответственно, в сравнении с контрольной линией С 1013 А. Пример 3. Влияние MDM2 на линии клеток, экспрессирующих E1B19K. На фиг. 3 показаны профили роста линий ЕМ-15 и ЕМ-70, экспрессирующих E1B19K и MDM2. Для сравнения, в отдельный эксперимент были включены клеточные линии, экспрессирующие E1B19K иAVEN (ЕА-167), либо экспрессирующие E1B19K, AVEN и XIAP (ЕАХ-197), а также линия клетокхозяев, С 1013 А. Пиковая численность жизнеспособных клеток (VCD) для контрольной линии клеток достигла величины 6106 клеток/мл, тогда как для клонов ЕМ эта величина составила от 1210 е 6 до 16106 клеток/мл. Максимальное значение VCD для ЕА-167 и ЕАХ-197 составило 13,6-13,9106 клеток/мл. Клоны ЕМ характеризовались более высоким значением IVCC в сравнении с ЕА-167 или ЕАХ 197. Для линии ЕМ-70 было отмечено 100% повышение IVCC относительно контрольного значения в сравнении с 23% повышением для ЕА-167. Эти данные, наряду с тем фактом, что клеточные линии, экспрессирующие только E1B19K, не могут обеспечить достижение высоких значений IVCC, наблюдаемых в данном эксперименте (Nivitchanyong et al., Biotechnol Bioeng 98:825-841 (2007, позволяют заключить,что MDM2 вносит вклад в повышение значения IVCC, наблюдаемое для линий клеток ЕМ-15 и ЕМ-70. Котрансфекция E1B19K, MDM2 и XIAP не привела к получению клеточных линий со сравнительно повышенными значениями VCD или IVCC (данные не приводятся). Активность каспазы 3/7 для линий ЕМ-15 и ЕМ-70 составила 13 и 30%, соответственно, относительно активности для контрольной линии С 1013 А. Для сравнения, ЕА-167 и ЕАХ-197 характеризовались активностью каспазы 3/7 37 и 20% относительно активности для контрольной линии С 1013 А. Данные по апоптозу были подтверждены анализомFLOW, описанным выше. 91% контрольных клеток дали положительный результат на каспазу 3/7, тогда как в линиях, экспрессирующих апоптозныеR гены, лишь 1-30% клеток были положительными на каспазу 3/7. Линии клеток с наименьшими значениями активности каспазы 3/7 (например, В-31) не обязательно демонстрировали наивысшие значения IVCC. Пример 4. Клонирование и экспрессия мутанта MDM2. Вектор, экспрессирующий полноразмерную кДНК человеческого MDM2 дикого типа (номер в базе данных Genbank: M92424.1), был получен в Университете Джона Хопкинса. Вектор, экспрессирующийMDM2D300A, был создан путем мутагенеза in vitro с использованием праймера мутагенеза 5' gctgaagagggcttt gatgtgccggcttgt aaaaaaactatagtg 3' (SEQ ID NO: 15), изменения заключались в замене А на С в позиции 899 и замене аспарагиновой кислоты на аланин в соответствующем белке MDM2D300A. Результат мутагенеза был подтвержден посредством секвенирования. Последовательность ДНК MDM2D300A приведена в SEQ ID NO: 3, аминокислотная последовательность теоретически рассчитанного для MDM2D300A белка приведена в SEQ ID NO: 4. Новый мутантный вектор так же, как и вариант дикого типа, использовался для кратковременных и стабильных трансфекций. Белки MDM2D300A и MDM2 дикого типа кратковременно экспрессировались в клетках HEK293. Анализ методом вестерн-блоттинга показал наличие высокого содержания MDM2D300A в клетках в сравнении с диким типом MDM2, что позволяет заключить, что мутантный белок является более устойчивым к протеолитическому распаду, чем дикий тип белка MDM2. Пример 5. Создание линий клеток, экспрессирующих MDM2D300A. Стабильные клеточные линии, сверхэкспрессирующие белок MDM2D300A или WT MDM2, создавались в соответствии с описанием, приведенным в примере 1. Использовались две линии клеток-хозяев: С 1013 А и С 1835 А. Список клеточных линий, использованных в исследованиях профилей роста, приведен в табл. 2. Пример 6. Влияние MDM2 на продолжительность существования культуры и жизнеспособность линий клеток-хозяев CHOK1. Профили роста и жизнеспособность (встряхивание/полунепрерывная культура) клеточных линийD6, В 1 и В 5, полученных на основе линий С 1013 А и С 1835 А и экспрессирующих ген MDM2D300A, показаны на фиг. 4. При использовании патентованной безбелковой среды Centocor пиковое значение плотности жизнеспособных клеток (VCD) для контрольной линии клеток С 1013 А составило 8106 клеток/мл, а для контрольной линии клеток С 1835 А - 5106 клеток/мл. Для клеточных линий, сверхэкспрессирующих MDM2D300A, было отмечено увеличение продолжительности существования культуры в сравнении с контрольными линиями. В подпитываемых культурах линии В 1 и В 5 сохранялись в культуре до 20 дней, тогда как клетки-хозяева, не подвергавшиеся трансфекции, а также клетки, полученные из общего пула после трансфекции MDM2D300A, утрачивали жизнеспособность на 14-й день культивирования(фиг. 5). Пример 7. Стабильность клеточных линий СНО, сверхэкспрессирующих MDM2. Линии клеток СНО D6 и В 5, полученные на основе линий С 1013 А и С 1835 А, демонстрирующие сверхэкспрессию MDM2D300A, были подвергнуты 15-этапному исследованию стабильности в условиях наличия и отсутствия агента отбора, генетицина. В начале и в конце исследования стабильности была рассмотрена кривая роста для каждой линии клеток, и отмечалось значение пиковой плотности жизнеспособных клеток (как показатель, характеризующий стабильность). Культуры без генетицина и при прохождении последних этапов исследования демонстрировали эквивалентные или более высокие значения VCD, что говорит о высокой стабильности в отсутствии реактива отбора (табл. 3). Пример 8. Исследования продуктивности с использованием линий клеток-хозяев, сверхэкспрессирующих MDM2. Линии клеток А 4, сверхэкспрессирующие MDM2, и В 1, сверхэкспрессирующие MDM2D300A, были подвергнуты трансфекции с использованием вектора экспрессии тяжелой и легкой цепи рекомбинантных антител. Вначале трансфекционная смесь была отобрана с использованием безглутаминовой среды, содержащей добавки глутаминсинтетазы и 25 мкМ MSX. Затем смесь была посеяна на среду Methocult для изоляции индивидуальных клонов. Около 100 полученных трансфектом на одну трансфекцию были перенесены на 24-луночный планшет, по прошествии 14 дней было проведено определение титра путем нефелометрии. Средний титр для линий MDM2 и MDM2D300A, экспрессирующих CNTO328, составил 90 мг/л, а для клонов, полученных из С 1013 А, этот показатель был существенно ниже и составил 21,3 мг/л. В отдельном эксперименте клетки CHOK1SV были подвергнуты трансфекции MDM2 и E1B19K, а один клон, ЕМ 70, стабильно экспрессирующий E1B19K и MDM2, был подвергнут трансфекции вектором экспрессии тяжелой и легкой цепи рекомбинантных антител (Dorai et al., Biotechnol. Bioeng.,103:592-608 (2009). Вначале трансфекционная смесь была отобрана с использованием безглутаминовой среды, содержащей добавки глутаминсинтетазы и 25 мкМ MSX. Для сравнения были взяты несколько других линий клеток, включая С 1013 А (контроль), С 1013 М, C1013J, C1013K, А 4, В 5, ВМХ 13. После массового отбора в течение 29 дней выжившие клетки исследовались в подпитываемой встряхиваемой культуре. Для линии ЕМ 70 титр антител на 23-й день составил 700 мг/л, тогда как титры для остальных линий не превышали 100 мг/л (фиг. 6). Экспоненциальная культура CHOK1SV была подвергнута трансфекции векторами, экспрессирующими E1B19K и MDM2. Через два дня был запущен протокол отбора под действием антибиотиков. На 29-й день все нетрансфекционные клетки были элиминированы, тогда как клетки, устойчивые к антибиотику (трансфекционный пул) выжили. Эти клетки были использованы для проведения исследования профиля роста в подпитываемой встряхиваемой культуре. Клетки в количестве 25 клеток/мл были высеяны в среду Mach-1, содержащую добавки. Начиная со 2-го дня, к культурам ежедневно добавлялась питательная смесь, содержащая глюкозу и аминокислоты. Ежедневно проводилось определение численности клеток и титра. Здесь приведено полное описание настоящего изобретения, из которого специалистам, обладающим обычными знаниями в данной области, будет ясно, что в описываемые объекты может быть внесено множество изменений и модификаций, не выходящих за пределы сущности и объема предлагаемой формулы изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ повышения продукции секретируемого белка в подпитываемой культуре клеток яичников китайского хомячка (СНО), включающий трансфекцию линии клеток китайского хомячка вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий белок MDM2 с последовательностью SEQ ID NO: 2 и белокE1B19K с последовательностью SEQ ID NO: 6, и культивирование трансфицированной линии клеток СНО, сверхэкспрессирующей в результате трансфекции MDM2 и E1B19K, и гены, кодирующие секретируемый белок, где титр секретируемого белка составляет по меньшей мере 600 мг/л на 23 день культивирования клеток. 2. Способ по п.1, в котором линия клеток СНО представляет собой CHO-K1. 3. Способ по п.1, в котором линия клеток СНО представляет собой CHO-K1SV. 4. Способ по п.1, в котором секретируемый белок содержит тяжелую цепь антитела и легкую цепь антитела.