Способ генетической идентификации личности на основе анализа однонуклеотидного полиморфизма генома человека с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа)

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Дата публикации и выдачи патента СПОСОБ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛИЧНОСТИ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ОДНОНУКЛЕОТИДНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНОГО БИОЛОГИЧЕСКОГО МИКРОЧИПА Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии, судебной медицины и криминалистики и касается способа генетической идентификации личности и определения его индивидуализирующих признаков (пол, группа крови и пр.) с помощью технологии гидрогелевых ДНК-микрочипов. Изобретение обеспечивает возможность по ряду генетических признаков определять вероятность происхождения биологического материала от того или иного подозреваемого, жертвы, участника преступного инцидента. Оно обладает тем преимуществом,что позволяет провести экспертизу в короткий срок и с небольшими (в сравнении с другими методами) материальными затратами. Другим преимуществом изобретения является возможность расширения спектра анализируемых локусов и, соответственно, повышения дискриминирующей силы экспертизы. Наседкина Татьяна Васильевна,Фесенко Денис Олегович, Митяева Ольга Николаевна, Лысов Юрий Петрович, Барский Виктор Евгеньевич, Заседателев Александр Сергеевич (RU)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА РАН (ИМБ РАН) (RU) 015913 Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к области молекулярной биологии, судебной медицины и криминалистики и касается способа генетической идентификации личности и определения его индивидуализирующих признаков (пол, группа крови и пр.) с помощью технологии гидрогелевых ДНК-микрочипов. Уровень техники Известен ряд способов генетической идентификации личности, использующих уникальность нуклеотидной последовательности ДНК каждого человека. 1. Анализ полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ-анализ) [П.Л. Иванов. Индивидуализация человека и идентификация личности: молекулярная биология в судебной экспертизе. Вестник РАН, т. 73,12, с. 1085-1097 (2003)]. Основан на определении длины полиморфных локусов ДНК, содержащих тандемные повторы. Количество повторов внутри такого локуса варьирует у разных людей. Анализ 12-16 подобных локусов позволяет получить генетическую характеристику, являющуюся уникальной в пределах популяции планеты. Метод требует амплификации ДНК в полимеразной цепной реакции с последующим гельэлектрофорезом. Преимуществом метода является высокая дискриминирующая способность, а недостатками - трудоемкость, высокие требования к квалификации персонала, дорогостоящее оборудование для капиллярного гель-электрофореза (ДНК-секвенаторы), в связи со значительной длиной STR-локусов(STR - short tandem repeats; локусы, содержащие короткие тандемные повторы) большое влияние на результат имеет степень деградации геномной ДНК (высокодеградированная ДНК нередко встречается в экспертно-криминалистической работе). 2. Анализ полиморфизма длины рестриктазных фрагментов ДНК (ПДРФ-анализ). В результате мутаций в геномной ДНК возникают новые или утрачиваются ранее существовавшие сайты рестрикции - места воздействия рестриктаз, расщепляющих цепь ДНК. Это, в свою очередь, обусловливает изменение длины получающихся рестриктазных фрагментов ДНК. Распределение фрагментов по длинам выявляется с помощью блот-гибридизации. Однако большинство полиморфных локусов имеют только два варианта: дикий тип/мутация, т.е. являются диаллельными. Ценность диморфных маркеров невелика, т.к. у многих людей может оказаться один и тот же вариант. Эта особенность, наряду с высокой требовательностью к количеству и сохранности исследуемой ДНК, являются основными недостатками метода, приведшими к его исчезновению из криминалистической практики [Joseph T., Kusumakumary Р., Chacko Р., Abraham A., Radhakrishna Pillai M. Genetic polymorphism of CYP1A1, CYP2D6,GSTM1 and GSTT1 and susceptibility to acute lymphoblastic leukaemia in Indian children. Pediatr Blood Cancer. 2004 Oct; 43(5):539-41]. 3. Секвенирование амплифицированных фрагментов ДНК, т.е. определение индивидуального генетического кода в заданном фрагменте ДНК. Самый точный и доказательный метод анализа индивидуальных генетических вариаций. Преимуществом является высокая точность и чувствительность метода, а недостатком - чрезвычайно высокая стоимость оборудования и анализа, что исключает широкое внедрение метода в экспертную практику как минимум в ближайшее десятилетие. 4. Выявление однонуклеотидного полиморфизма методом аллельспецифичной ПЦР (полимеразной цепной реакции). Аллельные варианты различаются за счт того, что 3'-концевой нуклеотид одного из праймеров в процессе ПЦР гибридизуется непосредственно с позицией SNP (т.е. если этот праймер комплементарен последовательности ДНК, то происходит наработка продукта). Метод достаточно сложен, т.к. в большой степени зависит от условий реакции и правильно выбранной последовательности праймера. Велико количество ложно-положительных результатов. Кроме того, невозможно данным методом анализировать более 3-5 мутаций в одном анализе. Несмотря на все приведенные недостатки, при грамотно подобранных условиях, анализ SNP занимает всего 3-4 ч [Murata M., Shiraishi T., Fukutome K., Watanabe M., NagaoM., Kubota Y., Ito Н., Kawamura J., Yatani R. Cytochrome P4501A1 and glutathione S-transferase M1 genotypes as risk factors for prostate cancer in Japan. Jpn J Clin Oncol. 1998 Nov; 28(11):657-60]. 5. Выявление однонуклеотидного полиморфизма методом гибридизации амплифицированного исследуемого образца с олигонуклеотидной матрицей. Данный метод предполагает предварительную мультиплексную амплификацию исследуемых фрагментов ДНК с использованием флуоресцентно меченных праймеров. В результате добавления избытка меченого праймера ПЦР достигается образование большого количества преимущественно меченого одноцепочечного продукта. Этот продукт гибридизуют с олигонуклеотидными зондами, иммобилизованными в определенном месте твердой подложки, либо в гелевых микрокаплях, закрепленных на подложке(такая матрица ДНК-зондов носит название биологического микрочипа или биочипа). Если последовательность анализируемой ДНК полностью комплементарна последовательности зонда, то образуется стабильный дуплекс (регистрируется флуоресцентный сигнал), если искомого фрагмента нет, или же в нем находится некомплементарное основание, то стабильного дуплекса не образуется (сигнал не наблюдается). Простота метода, низкая стоимость и возможность использования флуоресцентной метки позволяет легко автоматизировать процесс. Однако данный метод жестко связан с мультиплексной полиме-1 015913 разной цепной реакцией (ПЦР), а ее возможности ограничены. А именно в ходе одной реакции могут быть амплифицированы лишь 4-5 локусов ДНК. При таких ограничениях используемые в данный момент для криминалистических нужд системы SNP в силу своей диаллельности не будут иметь достаточной дискриминационной силы при использовании их на платформе биочипов [Wen S.Y., Wang H., SunGastroenterol. 2003, Jun; 9(6): 1342-6]. Ближайшим аналогом настоящего изобретения является способ 5, описанный выше. К существенным недостаткам способа можно отнести его низкую дискриминационную силу, обусловленную диаллельностью анализируемых полиморфизмов. Таким образом, все имеющиеся в настоящее время способы обладают теми или иными недостатками, и существует потребность в создании простого, недорогого, специфичного способа, позволяющего в ходе одной ПЦР-реакции амплифицировать несколько мультиаллельных локусов и выявлять полиморфизм в них, используя биочипы. Разработка способа, лишенного недостатков известных способов, позволит существенно расширить круг криминалистических лабораторий, которые смогут использовать данный способ в повседневной практике. Такой способ обеспечивается настоящим изобретением. Раскрытие изобретения Сущность изобретения заключается в обеспечении способа идентификации личности, в котором в ходе одной ПЦР амплифицируются высокополиморфные ДНК-локусы: AB0, HLA-DQA1, а также диаллельный локус AMEL, что позволяет разделить человеческую популяцию на 1350 групп. Способ основан на проведении оригинального варианта мультиплексной ПЦР в две стадии с последующей гибридизацией флуоресцентно меченного фрагмента ДНК на биологическом микрочипе, содержащем оригинальный набор дифференцирующих олигонуклеотидов, а также процедуры регистрации и интерпретации результатов. Одно лишь использование высокополиморфных локусов АВ 0 и HLA-DQA1 позволяет с помощью трех пар ПЦР-праймеров амплифицировать ДНК и получить разделение популяции на 675 групп, в отличие от способа 5 из уровня техники, позволяющего при трех парах праймеров получить разделение лишь на 8 групп. Использование в анализе диаллельного локуса AMEL позволяет удвоить дискриминационную силу, однако этот локус был применен в первую очередь в связи с тем, что он позволяет определить пол хозяина исследуемой ДНК, что немаловажно в следственной практике. Применение двухэтапной мультиплексной ПЦР и метода гибридизации на биочипах выгодно отличается от способов из уровня техники возможностью определения многих полиморфных вариантов с наименьшими затратами и наиболее специфичным способом за короткое время. Способ экономичен, не требует дорогостоящего оборудования и может быть введен в повсеместную экспертную практику. Данные, полученные с помощью способа настоящего изобретения, могут быть использованы для сужения круга подозреваемых лиц и в качестве предварительного этапа верификации принадлежности исследуемой ДНК подозреваемому лицу. Важной особенностью изобретения является то, что флуоресцентное мечение фрагмента гена осуществляют одновременно с амплификацией при проведении второго этапа ПЦР. Следующей особенностью изобретения является то, что идентификацию амплифицированных последовательностей осуществляют путем гибридизации полученного флуоресцентно меченного продукта амплификации с набором оригинальных олигонуклеотидных зондов, иммобилизованных на биочипе. Настоящее изобретение обеспечивает способ анализа генетического полиморфизма для целей генетической идентификации личности, включающий верификацию полиморфных вариантов последовательности в образце ДНК, предусматривающий следующие стадии:(а) амплификация полиморфных фрагментов генов методом мультиплексной гнездовой двухэтапной полимеразной цепной реакции (ПЦР), в которой в качестве матрицы для амплификации используют образец ДНК, с использованием набора праймеров с последовательностями, представленными в SEQ IDNO: 1-16, с получением на втором этапе ПЦР меченого ПЦР-продукта;(б) обеспечение биочипа для идентификации полиморфных фрагментов генов, содержащего набор иммобилизованных олигонуклеотидов с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 17-37;(в) гибридизация амплифицированного меченого ПЦР-продукта на биочипе;(г) регистрация и интерпретация результатов гибридизации. В одном из воплощений на втором этапе ПЦР для флуоресцентного мечения ПЦР-продукта используют флуоресцентно меченные по 5'-концу праймеры. В следующем воплощении биочип обеспечивают методом фотоиндуцируемой сополимеризации в гидрогеле. В еще одном воплощении используют условия гибридизации, обеспечивающие высокую степень дифференциации между совершенными и несовершенными гибридизационными дуплексами. В следующем воплощении регистрацию результатов гибридизации проводят с помощью устройства, способного регистрировать и записывать сигналы флуоресценции. В одном из предпочтительных воплощений регистрацию результатов гибридизации проводят с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой. В еще одном предпочтительном воплощении регистрацию результа-2 015913 тов гибридизации проводят с помощью флуоресцентного микроскопа, снабженного ПЗС-камерой. В еще одном воплощении интерпретацию результатов проводят визуально. В альтернативном воплощении интерпретацию результатов проводят с использованием программы автоматического анализа изображения. В своем следующем аспекте настоящее изобретение обеспечивает набор праймеров для амплификации полиморфных фрагментов генов в способе настоящего изобретения, где последовательности праймеров представлены в SEQ ID NO: 1-16. В еще одном своем аспекте настоящее изобретение обеспечивает набор олигонуклеотидов для идентификации полиморфных фрагментов генов, амплифицированных с помощью набора праймеров настоящего изобретения, с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 17-37. В своем следующем аспекте настоящее изобретение обеспечивает биочип для идентификации полиморфных фрагментов генов, амплифицированных с помощью набора праймеров настоящего изобретения, представляющий собой подложку с набором иммобилизованных на ней олигонуклеотидов с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 17-37. Перечень чертежей Фиг. 1 - схема биологического микрочипа; фиг. 2 - гибридизационная картина, полученная на биочипе, для анализа полиморфизма по генамAB0, HLA-DQA1 и AMEL. Осуществление изобретения Задача настоящего изобретения состоит в обеспечении способа экспресс-анализа генетического полиморфизма в образцах ДНК, аналогичных экспертным (полученным с мест преступлений и т.д.), с использованием олигонуклеотидного биочипа. Образец ДНК используют как матрицу в мультиплексной гнездовой двухэтапной ПЦР. На втором этапе ПЦР получают флуоресцентно меченный амплифицированный фрагмент. Меченый ПЦР-продукт используют для дальнейшей гибридизации на биочипе, содержащем иммобилизованные олигонуклеотиды, представляющие собой участки последовательностей генов, комплементарных как последовательности "дикого типа", так и вариабельной последовательности. Анализируемый фрагмент ДНК образует совершенные гибридизационные дуплексы только с соответствующими полностью комплементарными ему олигонуклеотидами. Со всеми остальными олигонуклеотидами анализируемый фрагмент ДНК будет образовывать несовершенные дуплексы, стабильность которых существенно ниже стабильности совершенных дуплексов. Дискриминацию совершенных и несовершенных дуплексов проводят после отмывки биочипа, сравнивая интенсивности флуоресценции соответствующих ячеек биочипа. Интенсивность сигнала в случае образования совершенного дуплекса выше, чем в случае несовершенного. Используя схему расположения олигонуклеотидов на биочипе, определяют, какие варианты присутствуют в том или ином образце. В качестве экспертного образца могут быть использованы образцы ДНК, выделенные из крови,слюны, волосяной луковицы, отпечатка пальца, содержащего частички эпителия, и других материалов,напоминающих реальные экспертные образцы. Для выделения ДНК можно пользоваться различными методами, например фенолхлороформенной экстракцией [И.В. Корниенко с соавт. Подготовка биологического материала для молекулярногенетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел. Под ред. П.Л. Иванова, 2001 г., Ростов-на-Дону], смолой Chelex-100 [Walsh P, Metsger D, Higuchi R. Chelex 100 asa medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques 1991; 10:506-13], готовыми наборами для выделения ДНК (фирм Qiagen, Stratagene, Arcturus Bioscience и др.). Полимеразная цепная реакция может быть проведена с использованием любого вида термостабильной полимеразы (Taq-полимераза, фрагмент Стоффеля, Tth-полимераза, Tfl-полимераза, Pfu-полимераза,Vent-полимераза, DeepVent-полимераза и т.п. без ограничения, которые коммерчески доступны от большого числа производителей (Novagen, Сибэнзим и проч.), работающей в соответствующем буфере. Для построения новой цепи в буфер добавляется смесь дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) в принятых концентрациях, но вместо дТТФ может быть использован дУТФ. Для проведения ПЦР могут быть использованы готовые коммерчески доступные наборы, содержащие все необходимые компоненты за исключением праймеров. В качестве праймеров для проведения мультиплексной гнездовой двухстадийной полимеразной цепной реакции используют праймеры с последовательностями SEQ ID NO: 1-16, приведенными в перечне последовательностей, а также в табл. 1. Существуют разнообразные химические подходы к синтезу олигонуклеотидных праймеров, например фосфодиэфирный метод, гидрофосфорильный метод и т.д., но наибольшее распространение в настоящее время имеет фосфорамидитный метод. Синтез праймеров осуществляют, используя автоматические ДНК/РНК синтезаторы, например, производства фирмы Applied Biosystems (США). В одном из воплощений мечение ПЦР-продукта на втором этапе ПЦР проводят с помощью праймеров, несущих флуоресцентную метку на 5'-конце. В качестве флуоресцентной метки может быть использован любой флуорохром (например, без ограничения, FITC, Texas red, Cy-3, Су-5 и т.д.), а также биотин. На второй стадии мультиплексной гнездовой двухэтапной ПЦР праймеры, входящие в состав одной пары, могут использоваться в эквимолярных количествах. Специалисту понятно, что образующийся при этом продукт амплификации будет, по существу, двухцепочечным, и для его эффективной гибридизации с олигонуклеотидами, иммобилизованными на биочипе, проводят предварительную денатурацию. Обычно денатурацию проводят непосредственно перед проведением гибридизации путем прогрева готовой гибридизационной смеси при 95 С в течение 5 мин с последующим быстрым охлаждением во льду. В предпочтительном воплощении изобретения вторую стадию мультиплексной гнездовой двухэтапной ПЦР проводят в асимметричном формате, т.е. флуоресцентно меченный праймер используют в молярном избытке по отношению к немеченому праймеру, например при молярном соотношении около 10:1 соответственно. Специалисту понятно, что образующийся при этом продукт амплификации будет представлен преимущественно одноцепочечной флуоресцентно меченной ДНК. С учетом возможности образования вторичных структур для эффективной гибридизации такого продукта с олигонуклеотидами, иммобилизованными на биочипе, при необходимости также проводится его предварительная денатурация. При подборе условий гибридизации создают условия, обеспечивающие наибольшую интенсивность флуоресценции совершенных дуплексов, специфичность взаимодействия и максимальную разницу в стабильности между совершенными и несовершенными дуплексами. Гибридизация может быть проведена в любом известном специалисту в данной области гибридизационном буфере, при необходимости содержащем реагенты, понижающие температуру плавления образуемых дуплексов и обеспечивающие специфичность взаимодействия между олигонуклеотидным зондом и ДНК-мишенью в диапазоне температур около 37 С. К таким реагентам относятся формамид, гуанидин гидрохлорид, гуанидин изотиоцианат и др. Гибридизация может проводиться и в отсутствии таких реагентов, но при более высоких температурах, соответствующих температурам плавления олигонуклеотидных зондов в используемом буфере. При подборе условий гибридизации и отмывки основное внимание должно быть обращено на специфичность прохождения гибридизации. Отмывка может быть проведена в любом известном в данной области техники буфере с добавлением соли (SSC, SSPE и т.п.) или в деионизованной воде, но за более короткое время (J.F. Sambrook and D.W. Russell, "Molecular cloning: a laboratory manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, vol. 2, pp. A10.10-12,14, 10.47-10.48, 10.6). Регистрация гибридизационной картины может быть произведена с помощью любой детектирующей системы, распознающей флуоресцентный сигнал (флуоресцентный микроскоп с ПЗС-камерой, лазерный сканер или портативный анализатор биочипов, доступные коммерчески от большого числа производителей, например портативный анализатор биочипов, производимый серийно ООО БиочипИМБ), и снабженной регистрирующим устройством (ПЗС-камерой, видеокамерой, фотокамерой. Анализ изображения может быть произведен как визуально, так и в автоматическом режиме с использованием специальной программы. При изготовлении микрочипа могут быть использованы олигонуклеотиды, несущие по 5'- или 3'-4 015913 концу активную группу, обеспечивающую иммобилизацию. Существуют разнообразные химические подходы к синтезу олигонуклеотидов, например фосфодиэфирный метод, гидрофосфорильный метод и т.д., но наибольшее распространение в настоящее время имеет фосфорамидитный метод. Синтез олигонуклеотидов осуществляют, используя автоматические ДНК/РНК синтезаторы, например, производства фирмы Applied Biosystems (США). Возможно использование широкого спектра групп для модификации иммобилизуемых олигонуклеотидов, таких как аминогруппа, тиол, гидразид, акриламидная группа, бензальдегид, тиофосфат и т.п. (Seliger H., Hinz M., Happ E. "Arrays of immobilized oligormcleotides - contributions to nucleic acids technology" Current Pharmaceutical Biotechnology, 2003, 4, 379-395). Модификация олигонуклеотида, имеющая целью введение активной группы, пригодной для последующей иммобилизации олигонуклеотида на биочипе, может быть осуществлена как в автоматическом режиме при синтезе с использованием широкого спектра модификаторов, которые коммерчески доступны, например, от GlenResearch (USA), так и постсинтетически в ручном режиме. Биочипы могут быть изготовлены путем создания на поверхности стеклянной подложки матрицы из ячеек полиакриламидного геля, активации ячеек и ковалентной иммобилизации в ячейках модифицированных олигонуклеотидов, несущих активные группы (Mirzabekov A.Kolchinsky A. MAGIChip:D.J., S.J. McCormack. Caister Academic Press, pp. 163-196). Также биочипы могут быть изготовлены методом химически индуцируемой или фотоиндуцируемой сополимеризации олигонуклеотида в акриламидном геле, как описано ранее (Vasiliskov, V., Timofeev E., Surzhikov S., Drobyshev, A., Shick, V.Mirzabekov, A. 1999. Fabrication of microarray of gel-immobilized compounds on a chip by copolymerization. BioTechnique, 27, 592-606; Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков СВ., Чернов Б.К Патент на изобретение 2175972 Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гидрогелях при формировании микрочипа. Приоритет от 28.12.1999). Также биочипы могут быть изготовлены любыми другими известными специалисту в данной области способами (Seliger H., Hinz M.,Happ E. "Arrays of immobilized oligonucleotides - contributions to nucleic acids technology" Current Pharmaceutical Biotechnology, 2003, 4, 379-395), а в качестве подложки помимо стекла может быть использован другой материал (пластик, металл, гибкие мембраны и т.д.). Также для изготовления микрочипов могут быть использованы активированные подложки, коммерчески доступные от различных производителейRes. 30: e30). Для изготовления биочипа настоящего изобретения используют набор олигонуклеотидов, имеющих последовательности SEQ ID NO: 17-37, приведенные в перечне последовательностей, а также табл. 2. В качестве контроля прохождения гибридизации в настоящем изобретении используют образец контрольной ДНК. Расположение конкретных олигонуклеотидных зондов на биочипе может варьировать и определяется только удобством для интерпретации результатов гибридизации. Таблица 2 Список олигонуклеотидов, иммобилизованных на микрочипе С помощью биочипа можно анализировать 9 групп аллелей гена HLA-DQA1: группа 101 объединяет аллели 0101 ХХ, 0104 ХХ, 0105, 0107; группа 102 - 0102 ХХ; группа 103 - 0103; группа 106 - 0106; группа 02 - 0201; группа 03 - 03 ХХХХ, группа 04 - 04 ХХХХ; группа 05 - 05 ХХХХ; группа 06 - 06 ХХХХ. Для простоты в дальнейшем группы аллелей 101, 102, 103, 106, 02, 03, 04, 05, 06 будем называть просто аллелями. Биочип позволяет анализировать четыре полиморфных участка во втором экзоне гена HLA-DQA1. На чипе каждый полиморфный участок представлен столбцом пар ячеек. Первый столбец имеет 4 строки, второй столбец - 2 строки, третий столбец - 3 строки, четвертый столбец - 2 строки. Первый полиморфный участок расположен между позициями 203 и 234. Первый вариант первого участка (первая строка первого столбца) отвечает за 101, 102, 103, 106 аллели, второй вариант первого полиморфного участка (вторая строка первого столбца) отвечает за 02 аллель, третий вариант первого полиморфного участка (третья строка первого столбца) отвечает за 03 аллель, четвертый вариант первого полиморфного участка (четвертая строка первого столбца) отвечает за 04, 05, 06 аллели. Второй полиморфный участок расположен между 134 и 152 позициями. Первый вариант второго полиморфного участка (первая строка второго столбца) отвечает за 101, 102, 106, 04, 05 аллели, второй вариант второго полиморфного участка(вторая строка второго столбца) отвечает за 103, 02, 06 аллели. Третий полиморфный участок расположен между 161 и 188 позициями. Первый вариант третьего полиморфного участка (первая строка третьего столбца) отвечает за 101 аллель, второй вариант третьего полиморфного участка (вторая строка третьего столбца) отвечает за 102, 103, 106, 04, 05 аллели, третий вариант третьего полиморфного участка (третья строка третьего столбца) отвечает за 04 и 06 аллели. Четвертый полиморфный участок расположен между позициями 191 и 207. Первый вариант четвертого полиморфного участка (первая строка четвертого столбца) отвечает за 101, 102, 103 аллели, второй вариант четвертого полиморфного участка (вторая строка четвертого столбца) отвечает за 106 аллель. Анализируя совокупность четырех полиморфных участков, можно определить генотип. В гене AB0 можно выявить 5 полиморфных вариантов гена АВ 0, сочетание которых дает 15 групп. Локус АВ 0 является высокополиморфным, и к настоящему времени опубликованы по нашим подсчетам около полутора сотен его аллелей. Подавляющее большинство из них встречаются крайне редко. Поэтому при выборе аллелей мы руководствовались, в первую очередь, частотой их встречаемости у белых европейцев, генетически наиболее близких к российской популяции. Для анализа были выбраны следующие группы аллелей: А, В, О 1, O1v и О 2, детерминирующие серологическую группу крови у подавляющего большинства белых европейцев. Сочетание анализируемых SNP позволяет определить аллели гена АВ 0, присутствующие в образце (табл. 3). В каждой из выбранных групп аллелей могут быть выделены аллели, различающиеся по другим SNP, но эти варианты редки и в подавляющем большинстве случаев серологически равнозначны между собой.-6 015913 Таблица 3 Однонуклеотидные вариации среди аллелей гена АВ 0 В качестве дикого типа принято считать аллель А Ген амелогенина расположен на половой хромосоме и позволяет определять пол индивидуума.AMELX характеризуется трехбуквенной делецией (позиции 5878-5880). На биочипе иммобилизованы два олигонуклеотида (AMELX и AMELY), позволяющие анализировать наличие или отсутствие делеции. Таким образом, разработанный биочип позволяет анализировать в целом 16 групп аллелей в трех генах. Далее изобретение иллюстрируется примерами, которые показывают применение способа экспрессанализа генетического полиморфизма. Следует, однако, понимать, что приводимые примеры служат исключительно для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема притязаний, выраженных в формуле изобретения. На основании настоящего описания специалист в данной области сможет легко предложить свои варианты и модификации осуществления изобретения, не отходя от общей концепции настоящего изобретения и без привлечения собственной изобретательской деятельности, так что должно быть понятно, что такие варианты и модификации также будут входить в объем настоящего изобретения. Пример 1. Амплификация фрагментов гена АВ 0 методом двухэтапной гнездовой мультиплексной ПЦР с целью наработки флуоресцентно меченного фрагмента гена, специфичного для каждого полиморфного варианта. От испытуемых были взяты окурки сигарет с фильтром. Со стороны фильтра стерильным инструментом отрезали 5-6 мм и удаляли бумагу. Для получения пропитанной потом бумаги, испытуемому предлагали слегка помять в руке лабораторную бумажную салфетку Kimberly-Clark. Также испытуемому предлагалось выпить воды из одноразового стакана, смыв с края стакана выполняли смоченной в стерильной воде салфеткой. Каждый из образцов помещали в 1,5-мл пробирку с 200 мкл стерильной воды,инкубировали 1-3 ч при температуре 23-25 С, после чего выделяли ДНК набором Qiagen. Для наработки интересующих фрагментов 6 и 7 экзонов использовали ПЦР-праймеры SEQ ID NO: 1-8. Мультиплексную ПЦР проводили на приборе MiniCycler (MJ Research, Inc., USA) в объеме 25 мкл реакционной смеси, составом для 1-го этапа: 1 буфер (67 мМ Трис-HCl, рН 8,6, 166 мМ (NH4)2SO4,0,01% Тритон Х-100), 1,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ каждого из dNTP (Силекс, Россия), 5 пМ каждого из 4 праймеров (SEQ ID NO: 1-4), 1 мкл геномной ДНК и 1,5 ед. акт. Taq-полимеразы (Силекс, Россия). ДНК денатурировали 5 мин при 94 С и проводили на первом этапе 35 циклов амплификации (94 С - 30 с,60 С - 30 с, 72 С - 1 мин), затем 7 мин при 72 С. Смесь второго этапа ПЦР отличалась составом и концентрацией праймеров: верхние праймеры (SEQ ID NO: 5, 7) брали в концентрации 5 пМ, а нижние (SEQID NO: 4, 6) -50 пМ. В смесь добавляли 2 мкл продукта из первого этапа и амплифицировали по схеме: 3,5 мин 94 С, 34 цикла (94 С - 30 с, 62 С - 30 с, 72 С - 1 мин), 7 мин при 72 С. Наличие и длину ПЦРпродукта выявляли электрофоретически в 2%-ном агарозном геле. Нижние праймеры 2-го этапа были предварительно помечены по 5'-концу флуоресцентным красителем Су 5 (возб./исп.: 640/657 нм). Пример 2. Олигонуклеотидный биочип для определения генетического полиморфизма в генах AB0,HLA-DQA1 и AMEL. Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе синтезируют на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer (Applied Biosystems, США) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. 5'- или 3'-конец олигонуклеотидов содержит спейсер со свободной аминогруппой, который вводят в состав олигонуклеотида при синтезе путем использования 3'-Amino-Modifier С 7 CPG 500 (GlenResearch, USA). Присоединение флуоресцентной метки к олигонуклеотидам по свободной аминогруппе осуществляют в соответствии с рекомендациями производителя. Олигонуклеотиды, меченные цианиновым красителем Су-3, очищают ВЭЖХ от олигонуклеотидов, не включивших флуоресцентный краситель, на колонке Hypersil ODS 5 мкм, 4,6250 мм (Sypelco Int, США). Биочип изготовляют методом сополимеризации олигонуклеотида в акриламидном геле, как описано ранее (патент на изобретение 2175972 Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гидрогелях при формировании микрочипа. Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков С.В., Чернов Б.К. Приоритет от 28.12.1999). Биочип содержит 21 тип иммобилизованных олигонуклеотидов (SEQ ID NO: 17-37), список которых представлен также в табл. 2. На фиг. 1. представлена схема биочипа для идентификации личности.-7 015913 Для примера определим генотип по гибридизационной картине, представленной на фиг. 2. Первый полиморфный участок: положительный сигнал наблюдается в первой и четвертой строках, следовательно, присутствует аллель из группы 101, 102, 103, 106 и аллель из группы 401, 501, 601. Далее второй полиморфный участок: положительный сигнал наблюдается в первой строке, следовательно, присутствие 103 и 601 аллелей исключаем. Третий полиморфный участок: положительный сигнал наблюдается во второй строке, следовательно, исключаем наличие 101 и 401 аллелей. Четвертый полиморфный участок: положительный сигнал наблюдается в первой строке, следовательно, исключаем 106 аллель. В результате для рассматриваемого образца получаем генотип HLA-DQA1: 102/501. Рассмотрим область биочипа, ответственную за генотипирование гена AB0. Сопоставим результаты гибридизации с данными из табл. 3. Мутация по 261 позиции исключает все группы аллелей, кроме О 1 иO1v, т.к. образец является гетерозиготой по позиции 297, следовательно, в нем присутствуют обе аллели: О 1 и O1v, в противном случае мы имели бы дикую либо мутантную гомозиготу по этой позиции. Гетерозиготность позиции 646 и дикий тип позиции 657 также подтверждают генотип O1/O1v. Ген амелогенина представлен одной аллелью (фиг. 2): AMELX, из чего можно заключить, что образец принадлежит женщине. Пример 3. Гибридизация меченого продукта на биочипе. Содержимое всех пробирок, полученных на стадии 2 примера 1, используют для гибридизации на биочипе в буфере следующего состава: 25% формамид (Gibco BRL), 5SSPE. Готовую гибридизационную смесь перед гибридизацией денатурируют при 95 С в течение 5 мин, охлаждают во льду 2 мин и наносят на биочип в гибридизационную камеру объемом 20 мкл (Sigma, USA). Гибридизацию проводят в течение 10-14 ч при температуре 37 С. Отмывку проводят в буфере 1 SSPE при комнатной температуре в течение 10 мин. Пример 4. Регистрация и интерпретация результатов гибридизации. Регистрацию гибридизационной картины производят с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой, производимого ООО Биочип-ИМБ. При визуальном анализе изображения интерпретацию результатов проводят, как в примере 2. Описание алгоритма автоматического анализа изображения с помощью программы Image Ware выходит за рамки настоящего изобретения. Все патенты, публикации, научные статьи и другие документы и материалы, цитируемые или упоминаемые здесь, включены в настоящее описание путем отсылки в такой степени, как если бы каждый из этих документов был включен путем отсылки индивидуально или приведен здесь в его полном виде. Конкретные используемые материалы и методы, описанные здесь, относятся к предпочтительным вариантам осуществления, приведены в качестве примеров и не предназначены для ограничения объема данного изобретения. При изучении этого описания другие объекты, аспекты и воплощения изобретения будут приходить в голову специалистам в данной области, и они охватываются рамками данного изобретения. Специалистам в данной области будет понятно, что различные замены и модификации могут быть произведены в отношении описанного выше изобретения без отклонения от его объема и рамок, которые определяются прилагаемой формулой изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ анализа генетического полиморфизма для целей генетической идентификации личности,включающий верификацию полиморфных вариантов последовательности в образце ДНК, предусматривающий следующие стадии:(а) амплификация полиморфных фрагментов генов методом мультиплексной гнездовой двухэтапной полимеразной цепной реакции (ПЦР), в которой в качестве матрицы для амплификации используют образец ДНК, с использованием набора праймеров с последовательностями, представленными в SEQ IDNO: 1-16, с получением на втором этапе ПЦР меченого ПЦР-продукта;(б) обеспечение биочипа для идентификации полиморфных фрагментов генов, содержащего набор иммобилизованных олигонуклеотидов с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 17-37;(в) гибридизация амплифицированного меченого ПЦР-продукта на биочипе;(г) регистрация и интерпретация результатов гибридизации. 2. Способ по п.1, в котором на втором этапе ПЦР для флуоресцентного мечения ПЦР-продукта используют флуоресцентно меченые по 5'-концу праймеры. 3. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором биочип обеспечивают методом фотоиндуцируемой сополимеризации в гидрогеле. 4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором используют условия гибридизации,обеспечивающие высокую степень дифференциации между совершенными и несовершенными гибридизационными дуплексами. 5. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором регистрацию результатов гибридиза- 18015913 ции проводят с помощью устройства, способного регистрировать и записывать сигналы флуоресценции. 6. Способ по п.5, в котором регистрацию результатов гибридизации проводят с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой. 7. Способ по п.5, в котором регистрацию результатов гибридизации проводят с помощью флуоресцентного микроскопа, снабженного ПЗС-камерой. 8. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором интерпретацию результатов проводят визуально. 9. Способ по любому из пп.1-7, в котором интерпретацию результатов проводят с использованием программы автоматического анализа изображения. 10. Набор праймеров для амплификации полиморфных фрагментов генов в способе по любому из пп.1-9, где последовательности праймеров представлены в SEQ ID NO: 1-16. 11. Набор олигонуклеотидов для идентификации полиморфных фрагментов генов, амплифицированных с помощью набора праймеров по п.10, с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 17-37. 12. Биочип для идентификации полиморфных фрагментов генов, амплифицированных с помощью набора праймеров по п.10, представляющий собой подложку с набором иммобилизованных на ней олигонуклеотидов с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 17-37.