Вакцины против гриппа, адсорбированные на алюминиевых адъювантах, для немедленного приёма

ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГРИППА, АДСОРБИРОВАННЫЕ НА АЛЮМИНИЕВЫХ АДЪЮВАНТАХ, ДЛЯ НЕМЕДЛЕННОГО ПРИМА Антигенный и адъювантный компоненты вакцины против гриппа с адъювантом не смешиваются во время получения, а изготавливаются как отдельные компоненты для смешения в момент использования, например, в виде набора, состоящего из (i) антигенного компонента, включающего антиген вируса гриппа; и (ii) адъювантного компонента, включающего соль алюминия.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: НОВАРТИС ВЭКСИНС ЭНД ДИАГНОСТИКС СРЛ (IT) 014190 Все цитируемые здесь документы полностью приведены в качестве ссылки. Участие государства Изобретение было создано в целом или в части по Контракту HHSN266200400032C с Национальными институтами здоровья/Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний при поддержке правительства Соединенных Штатов. В связи с этим, правительство Соединенных Штатов имеет некоторые права на изобретение. Область техники Данное изобретение относится к области вакцин с адъювантом для защиты против вирусной инфекции гриппа. Предпосылки создания изобретения Исключая продукт FLUAD от Chiron Vaccines, который включает адъювант в виде эмульсии типа масло-в-воде, вакцины против гриппа в настоящее время, в общем, не содержат адъювант. Эти вакцины описаны более детально в главах 17 и 18 ссылки 1. Они основаны на живых или инактивированных вирусах, и инактивированные вакцины могут быть основаны на целых вирусах, сплит вирусах или поверхностно очищенных антигенах (включая гемагглютинин и нейраминидазу). Совсем недавно предлагалось включить в противогриппозные вакцины адъюванты в виде солей алюминия (например, см. ссылки 2-5). Вследствие требования дополнительной стадии смешения при производстве, замедляющей производство в целом, включение этих солей связано с различными проблемами. Например, их нерастворимость означает, что адсорбированные антигены осаждаются из суспензии, так что приготовление индивидуальных доз из общего объема вакцины требует повышенной аккуратности. В дополнение присоединение антигена к солям усложняет качественный контроль конечной вакцины. В частности, некоторые возможные испытания противогриппозных вакцин основаны на иммуноанализах in vitro, которые требуют, чтобы антиген был не связан, то есть адсорбция к адъюванту означает, что эти анализы не могут быть выполнены. Целью изобретения является обеспечение новых и улучшенных противогриппозных вакцин с адъювантом (как для пандемического, так и межпандемического использования) и методы для их изготовления. Сущность изобретения Согласно изобретению компоненты противовирусной вакцины с адьювантом, антиген и адъювант,не смешиваются во время производства, но изготавливаются как отдельные компоненты для смешения для приема при использовании. Это изобретение является эффективным только потому, что было обнаружено (см. приведенные примеры), что адсорбция антигена к адъюванту происходит практически мгновенно и является необратимой в условиях, имеющих место при вакцинации. Таким образом, изобретение исключает различные проблемы, которые возникают в результате выполнения смешения во время производства. Поэтому изобретение представляет собой набор, включающий: (i) антигенный компонент, состоящий из антигена вируса гриппа; и (ii) адъювантный компонент, являющийся солью алюминия. Компонент (i) не включает соль алюминия в качестве адъюванта, и компонент (ii) не включает антиген вируса гриппа. Изобретение также представляет собой (i) антигенный компонент, состоящий из антигена вируса гриппа; и (ii) адъювантный компонент, являющийся солью алюминия, для одновременного раздельного или последовательного использования. Изобретение также представляет собой иммуногенную композицию, состоящую из антигена вируса гриппа и адъюванта, являющегося солью алюминия, когда эта композиция приготовляется путем смешивания антигена и адъюванта в момент использования. Изобретение также представляет собой способ получения вакцины против гриппа, включающий этапы: (i) приготовления антигенного компонента, состоящего из антигена вируса гриппа; (ii) приготовления адъювантного компонента, являющегося солью алюминия; и (iii) объединения компонентов антигена и адъюванта в набор. Способ может также представлять этап (iv) смешения компонентов антигена и адъюванта для введения пациенту, но этап (iv) обычно скорее будет выполняться во время использования профессиональным медицинским работником, чем производителем. Изобретение также представляет собой способ получения и введения вакцины против гриппа,включающий этапы: (i) смешения компонентов набора, который включает антигенный компонент, состоящий из антигена вируса гриппа, и адъювантный компонент, являющийся солью алюминия; и (ii) введения смешанных компонентов пациенту. Этот способ будет, как правило, включать встряхивание адъювантного компонента, чтобы диспергировать любые осевшие алюминиевые соли; асептическое добавление антигенного компонента к адъювантному компоненту; перевертывание или осторожное встряхивание смешанных компонентов; втягивание смешанных компонентов в шприц; и введение смешанных компонентов пациенту. Введение пациенту, как правило, будет происходить менее чем через 24 ч (например, 18, 12, 6, 3, 2, 1 ч, 30, 20, 10, 5, 2, 1 мин и т.д.) после смешения.-1 014190 Набор Набор согласно изобретению включает два компонента: один с антигеном и другой с адъювантом. Эти два компонента хранятся в наборе отдельно, пока не будет решено приготовить вакцину для введения пациенту, к этому моменту компоненты смешиваются, чтобы получить вакцину, в которой антиген адсорбируется на адъюванте. Два компонента, таким образом, физически разделены друг с другом в одном наборе, и это разделение может быть достигнуто различными путями. Например, два компонента могут быть в двух разных емкостях, таких как ампула. Содержание двух ампул может быть смешано, например, удалением содержимого из одной ампулы и добавления его в другую ампулу или отдельным удалением содержимого из обеих ампул и смешения его в третьей емкости. В предпочтительном исполнении один из компонентов набора это шприц, а другой - емкость, такая как ампула. Предварительно наполненный шприц может быть использован (например, с иглой) для введения его содержимого во вторую емкость для смешивания, и смесь затем может быть извлечена обратно в шприц. Смешанное содержимое из шприца затем может быть введено пациенту, обычно через новую стерильную иглу. Предварительное помещение одного компонента в шприц исключает, таким образом,необходимость использования отдельного шприца для введения пациенту. В другом предпочтительном исполнении два компонента набора находятся вместе в одном и том же шприце, но разделены, например в двухкамерном шприце, таком, как описано в ссылках 6-13 и др. Когда шприц используется (например, при введении пациенту), тогда содержимое двух камер смешивается. Такое исполнение исключает необходимость отдельного этапа смешения во время использования. Содержимое одной и другой камер обычно бывает в водной форме. В некоторых исполнениях один из компонентов (обычно антиген, а не адъювант) находится в сухом виде (например, в лиофилизированной форме), при этом другой компонент находится в водной форме. Эти два компонента могут быть смешаны для того, чтобы реактивировать сухой компонент и получить водную композицию для введения пациенту. В другом, менее предпочтительном исполнении оба компонента находятся в сухом виде. Лиофилизированный компонент будет в основном размещен скорее в ампуле, чем в шприце. Высушенные компоненты могут включать стабилизаторы, такие как лактоза, сахароза или маннитол, а также их смеси, например смеси лактоза/сахароза, смеси сахароза/маннитол и др. В одном предпочтительном варианте используется водный адъювант в предварительно заполненном шприце и лиофилизированный антиген в ампуле. Если оба компонента находятся в водной форме, они могут быть смешаны в различных объемных отношениях, например между 1:5 (избыточный объем водного антигена) и 5:1 (избыточный объем водного адъюванта). Отношение между 1:2 и 2:1 является предпочтительным, например около 1:1. Подходящие емкости для набора включают ампулы и одноразовые шприцы. Эти емкости должны быть стерильны. Если компонент помещается в ампулу, она предпочтительно изготовлена из стекла или пластического материала. Ампула предпочтительно стерилизуется перед наполнением ее композицией. Чтобы избежать проблем с пациентами, чувствительными к латексу, ампулы предпочтительно закрываются не содержащими латекс пробками, и отсутствие латекса в каждом упаковочном материале является предпочтительным. Ампула может содержать одноразовую дозу вакцины или более чем одну дозу(мультидозовая ампула), например 10 доз. Предпочтительные ампулы изготовлены из бесцветного стекла. Вакцины против гриппа обычно вводятся в дозируемом объеме около 0,5 мл, хотя половина дозы(то есть около 0,25 мл) может вводиться детям. Для облегчения ведения половины объема дозы на емкостях может быть показано, что они содержат половины объема дозы, например, на шприце, содержащем дозу объемом 0,5 мл, может быть отмечено 0,25 мл объема. Ампула может иметь наконечник (например, наконечник Люэра), устроенный так, что предварительно наполненный шприц может быть введен в наконечник, причем содержимое шприца вытесняется в ампулу (например, чтобы разбавить в ней лиофилизированный материал), и содержимое ампулы может возвращаться в шприц. После изъятия шприца из ампулы может быть присоединена игла, и композиция может быть введена пациенту. Наконечник предпочтительно размещается внутри герметика или крышки, так что герметик или крышка должны быть удалены перед тем, как наконечник сможет быть доступным. Ампула может иметь наконечник, который позволяет асептическое удаление содержимого, особенно в случае ампул с лекарственными средствами для многократного приема. Когда компонент помещается в шприц, этот шприц может иметь присоединенную иглу. Если игла не присоединена, отдельная игла может быть приложена со шприцем для комплекта и использования. Такая игла может быть в чехле. Предпочтительными являются безопасные иглы. Размеры игл 1-дюйм 23 калибр, 1-дюйм 25-калибр и 5/8-дюйма 25-калибр являются типичными. Шприцы могут быть снабжены несмываемой меткой, на которой напечатаны номер партии и истечение срока годности содержимого,чтобы знать сроки хранения. Поршень в шприце предпочтительно имеет фиксатор, чтобы предотвратить его случайное отделение во время аспирации. Шприцы могут иметь колпачок и/или поршень из латексного каучука. Одноразовые шприцы содержат одну дозу вакцины. У этого шприца обычно имеется кол-2 014190 пачок с кончиком, чтобы запечатать этот кончик до присоединения иглы, и этот колпачок с кончиком предпочтительно изготовлен из бутилкаучука. Если шприц и игла упакованы раздельно, тогда игла предпочтительно снабжена защитой из бутилкаучука. Предпочтительно используются шприцы, поставляемые под торговой маркой "Tip-Lok". В случае стеклянной емкости (шприца или ампулы) предпочтительно использовать емкость, изготовленную из боросиликатного стекла, а не из известково-натриевого стекла. Набор может включать (например, в той же самой коробке) листок-вкладыш с информацией о вакцине, например, с инструкциями по введению, данными об антигенах в вакцине и т.д. Инструкции могут также содержать предупреждения, например, держать раствор адреналина готовым к использованию в случае анафилактической реакции, вследствие вакцинации. Набор предпочтительно хранится при температуре от 2 до 8 С. Его не следует замораживать. Антиген вируса гриппа Один из компонентов набора содержит антиген. Эти антигены обычно получают из вирионов гриппа, но как альтернатива, антигены, такие как гемагглютинин, могут быть экспрессированы в рекомбинантном хозяине (например, в клеточной линии насекомых с использованием бакуловирусного вектора) и использованы в очищенной форме [14,15]. В большинстве случаев, однако, антигены из вирионов. Антиген может иметь форму живого вируса или более предпочтительно инактивированного вируса. Химические средства для инактивации вируса включают обработку эффективным количеством одного или более следующих агентов: детергентов, формальдегида, формалина, -пропиолактона, или УФсветом. Дополнительные химические средства инактивации включают метиленовый синий, псорален,карбоксифуллерен (С 60) или любые их комбинации. Другие методы инактивации вирусов известны в данной области техники, такие как, например, двухатомный этиламин ацетилэтиленимин или гаммаоблучение. Продукт INFLEXAL является инактивированной вакциной из целых вирионов. В случае использования инактивированного вируса, вакцина может включать целый вирус, сплит вирус или очищенные поверхностные антигены (включая гемагглютинин и, обычно, также включая нейраминидазу). Вирионы могут быть собраны из вируссодержащих жидкостей различными методами. Например,способ очищения может включать зональное центрифугирование раствора с линейным градиентом плотности сахарозы, который включает детергент для разрушения вирионов. Антигены затем могут быть очищены после оптимального разбавления диафильтрацией. Сплит вирусы получают обработкой вирионов детергентами (например, этиловым эфиром, полисорбатом 80, дезоксихолатом, три-N-бутилфосфатом, Triton Х-100, Triton N101, цетилтриметиламмонийбромидом, Tergitol NP9 и др.) для получения субвирионных препаратов, включаяспособ расщепления Твин-эфир. Методы расщепления вирусов хорошо известны в данной области техники, например,см. ссылки 16-21 и др. Расщепление вируса в основном выполняется разрушением или фрагментацией целого вируса, либо инфекционной, либо неинфекционной, с расщепляющим агентом разрушающей концентрации. Разрушение приводит к полной или частичной растворимости вирусных белков, изменяющих целостность вируса. Предпочтительно расщепляющими агентами являются неионные и ионныеN101), полиоксиэтиленсорбитан сложные эфиры (Tween ПАВы), полиоксиэтилен простые эфиры, полиоксиэтилен сложные эфиры и др. В одном применяемом способе расщепления используются последовательные воздействия дезоксихолата натрия и формальдегида, и расщепление может происходить во время начальной очистки вирионов (например, в растворе с градиентом плотности сахарозы). Так способ расщепления может включать очищение вирионсодержащего материала (чтобы удалить не вирионы),концентрирование собранных вирионов (например, используя метод адсорбции, такой как адсорбция СаНРО 4), отделение целых вирионов от невирионного материала, расщепление вирионов с использованием расщепляющего агента на этапе центрифугирования в градиенте плотности (например, используя сахарозный градиент, который содержит расщепляющий агент, такой как дезоксихолат натрия) и затем фильтрацию (например, ультрафильтрацию) для удаления нежелательных материалов. Сплит вирионы могут быть успешно ресуспендированы в изотоническом растворе хлорида натрия, забуференном фосфатом натрия. Продукты BEGRIVAC, FLUARIX, FLUZONE и FLUSHIELD являются сплит вакцинами. Вакцины из очищенных поверхностных антигенов включают поверхностные антигены гриппа гемагглютинин (НА) и, как правило, также нейраминидазу (NA). Способ приготовления этих белков в очищенном виде хорошо известен в данной области техники. Продукты FLUVIRIN, AGRIPPAL иINFLUVAC являются субъединичными вакцинами. Другие белки вируса, кроме НА и NA, также могут быть использованы как антиген гриппа, включая-3 014190 фрагменты натуральных белков. Также могут быть использованы их комбинации. Антигены гриппа могут быть представлены также в виде виросом [22]. Вирус гриппа может быть ослабленным. Вирус гриппа может быть чувствительным к температуре. Вирус гриппа может быть адаптирован к холоду. Эти три возможности касаются, в особенности, живых вирусов. Штаммы вирусов гриппа, используемые в вакцинах, меняются от сезона к сезону. В настоящем межпандемическом периоде вакцины в основном включают два штамма гриппа A (H1N1 и H3N2) и один штамм гриппа В, и трехвалентные вакцины являются обычными. Изобретение может также использовать вирусы из пандемических штаммов (то есть штаммов, к которым реципиент и вообще человеческая популяция иммунологически не подготовлены), таким как подтипы штаммов Н 2, Н 5, Н 7 или Н 9 (в частности, вируса гриппа А), при этом вакцины гриппа пандемических штаммов могут быть одновалентными или могут быть основаны на обычной трехвалентной вакцине, дополненной пандемическим штаммом. Однако в зависимости от ситуации и природы антигена, введенного в вакцину, изобретение может представить защиту против одного или более подтипов НА H1, Н 2, Н 3, Н 4, Н 5, Н 6, Н 7, Н 8, Н 9, Н 10, Н 11,Н 12, Н 13, Н 14, Н 15 или H16. Композиции изобретения с адъювантом особенно пригодны для иммунизации против пандемических штаммов. Характеристики штамма гриппа, который может вызвать вспышку пандемии: (а) он содержит новый гемаггллютинин в отличие от гемаггллютининов в циркулирующих в настоящее время человеческих штаммах, то есть тот, который не был замечен в человеческой популяции в течение десятилетия (например, Н 2) или вообще не был замечен в человеческой популяции (например, Н 5, Н 6 или Н 9, которые были найдены, в основном, только в популяции птиц), так что человечество будет иммунологически не подготовлено к гемагглютинину этого штамма; (б) он способен передаваться горизонтально в человеческой популяции; и (с) он является патогенным для людей. Вирус с гемагглютинином типа Н 5 является предпочтительным для иммунизации против пандемического гриппа, такого как штамм H5N1. Другие возможные штаммы включают H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 и H7N7 и некоторые другие потенциально возможные пандемические штаммы. В пределах подтипа Н 5 вирус может подразделяться на НА клад 1, НА клад 1', НА клад 2 или НА клад 3 (23), причем клад 1 и 3 являются предпочтительными. Другие штаммы, которые могут быть эффективно включены в композиции, являются те, которые устойчивы к антивирусной терапии (например, к осельтамивиру [24] и/или занамивиру), включая штаммы, устойчивые пандемические штаммы [25]. Композиции изобретения могут включать антиген(ы) из одного или более (например, 1, 2, 3, 4 или более) штаммов вируса гриппа, включая вирус гриппа А и/или вирус гриппа В. Если вакцина включает более чем один штамм гриппа, то разные штаммы обычно выращиваются раздельно и смешиваются после того, как вирусы будут выращены и антигены получены. Таким образом, способ по изобретению может включать стадию смешения антигенов из более чем одного штамма гриппа. Трехвалентная вакцина,включающая антигены из двух вирусных штаммов гриппа А и одного вирусного штамма гриппа В, является предпочтительной, хотя одновалентные вакцины также пригодны (например, для пандемических штаммов). Вирус гриппа может быть реассортантным штаммом и может быть получен способами обратной генетики. Способы обратной генетики [например, 26-30] позволяют получать вирусы гриппа с желаемыми геномными сегментами in vitro, используя плазмиды. Обычно они включают экспрессирующие (a) молекулы ДНК, которые кодируют желаемые молекулы вирусной РНК, например из polI промоторов, и(b) молекулы ДНК, которые кодируют вирусные белки, например из polII промоторов, так что экспрессия обоих типов ДНК в клетке ведет к образованию полного интактного инфекционного вириона. ДНК предпочтительно обеспечивает все вирусные РНК и белки, но также, возможно, следует использовать вирус-помощник, чтобы получить некоторые РНК и белки. Основанные на плазмидах способы, использующие отдельные плазмиды для получения каждой вирусной РНК, являются предпочтительными [3133], и эти способы также включают использование плазмид для экспрессии всех или некоторых (например, только РВ 1, РВ 2, РА и NP белков) вирусных белков, при этом в некоторых способах используются 12 плазмид. Для того чтобы снизить число необходимых плазмид, в недавнем подходе [33] объединили множество транскрипционных кассет РНК-полимеразы I (для синтеза вирусной РНК) на одной и той же плазмиде (например, последовательности, кодирующие 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или все 8 сегментов вРНК гриппа А) и множество кодирующих белки областей с промоторами РНК-полимеразы II на другой плазмиде (например, последовательности, кодирующие 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или все 8 транскриптов мРНК гриппа А). Предпочтительные аспекты приведенного метода [34] включают: (a) РВ 1, РВ 2 и РА мРНК-кодирующие области на одной плазмиде; и (b) все 8 вРНК-кодирующих сегмента на одной плазмиде. Можно также облегчить задачу, включая NA и НА сегменты на одной плазмиде и шесть других сегментов на другой плазмиде. В качестве альтернативы использования polI промоторов для кодирования сегментов вирусной РНК, можно использовать промоторы полимеразы бактериофага [35]. Например, удобно использовать-4 014190 промоторы полимеразы SP6, Т 3 или Т 7. Благодаря видоспецифичности polI промоторов, промоторы полимераз бактериофага могут быть более пригодны для многих типов клеток (например, MDCK), хотя клетка также должна быть трансфецирована плазмидой, кодирующей экзогенный полимеразный фермент. В других методах возможно использование двойных polI и polII промоторов, чтобы одновременно кодировать вирусные РНК и для экспрессируемых мРНК из одной матрицы [36, 37]. Таким образом, вирус (в частности, вирус гриппа А) может включать один или более сегментов РНК из вируса A/PR/8/34 (обычно 6 сегментов из A/PR/8/34, с НА и N сегментами из штамма вакцины,то есть с реассортацией 6:2), особенно когда вирусы выращиваются в яйцах. Можно также включить один или более РНК сегментов из A/WSN/33 вируса или из любого другого вирусного штамма для получения реассортантных вирусов при изготовлении вакцины. Как правило, изобретение защищает от штамма, который способен передаваться от человека к человеку, и поэтому геном штамма будет в основном включать по крайней мере один сегмент РНК, который присутствует в вирусе гриппа млекопитающих (например, человека). Он также может включать сегмент NS из вируса птичьего гриппа. Вирусы, используемые как источник антигенов, могут быть выращены либо на яйцах, незараженных определенным вирусом (SPF), либо на клеточной культуре. В современном стандартном способе выращивания вирусов гриппа используют куриные яйца с зародышем, при этом вирус выделяют из яичного содержания (аллантоидной жидкости). Совсем недавно, однако, вирусы были выращены в клеточной культуре животных и по причине скорости и аллергий у пациентов, этот метод выращивания является предпочтительным. Если используется способ выращивания вирусов на основе яиц, то в аллантоидную жидкость яйца вместе с вирусом могут быть введены одна или более аминокислот [18]. Клеточным субстратом в основном является клеточная линия млекопитающих. Подходящие клетки млекопитающих включают, но не ограничиваются, клетками хомяков, крупного рогатого скота, приматов (включая людей и обезьян) и собак. Могут быть использованы различные типы клеток, такие как клетки почки, фибробласты, ретинальные, легочные клетки и др. Примером подходящих клеток хомяка являются клеточные линии, имеющие название BHK21 или HKCC. Подходящими клетками обезьян являются, например, клетки Африканской зеленой мартышки, такие как клетки почки как в клеточной линии Vero. Подходящими клетками собаки являются, например, клетки почки, такие как в MDCK клеточной линии. Так подходящие клеточные линии включают, но не ограничиваются MDCK; CHO; 293T;BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38 и другие. Использование клеток млекопитающих означает, что вакцины могут быть свободны от куриной ДНК, а также свободны от яичных белков (таких как овалбумин и овомукоид) и иметь тем самым пониженную аллергенность. Предпочтительные клеточные линии млекопитающих для выращивания вирусов гриппа включают клетки MDCK [38-41], полученные из почки собаки Madin Darby; клетки Vero [42-44], полученные из почки Африканской зеленой мартышки (Cercopithecus aethiops); или клетки PER.C6 [45], полученные из ретинобластов человеческих эмбрионов. Эти клеточные линии широко представлены, например, в Американской коллекции Культур Типовых Клеток (АТСС) [46], в клеточных хранилищах Coriell [47] или в Европейской Коллекции Клеточных Культур (ЕСАСС). Например, АТСС поставляет различные клеткиVero по каталогу под номерами CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 и CRL-1587 и поставляет клетки MDCK по каталогу под номером CCL-34. PER.C6 имеются в наличии в ЕСАСС под депозитным номером 96022940. Как менее предпочитаемая альтернатива клеточным линиям млекопитающих, вирус может быть выращен из клеточных линий птиц [например, ссылки 48-50], включая клеточные линии, полученные от уток(например, сетчатка глаза уток) или кур, например фибробласты куриных эмбрионов (CEF) и др. Примеры включают стволовые клетки птичьих эмбрионов [48, 51], включая ЕВх клеточную линию, происходящую от стволовых клеток куриных эмбрионов, ЕВ 45, ЕВ 14 и ЕВ 14-074 [52]. Наиболее предпочтительными клеточными линиями для выращивания вирусов гриппа являются клеточные линии MDCK. Первоначальная клеточная линия MDCK представлена от АТСС как CCL-34,однако могут быть использованы также производные этой клеточной линии. Например, ссылка 38 раскрывает клеточную линию MDCK, которая была адаптирована для выращивания в суспензионной культуре (MDCK 33016, представленная как DSM АСС 2219). Аналогично, ссылка 53 раскрывает MDCKпроизводную клеточную линию, которая растет в суспензионной бессывороточной культуре (В-702,представленная как FERM ВР-7449). Ссылка 54 раскрывает не онкогенные MDCK клетки, включающиеMDCK-S (АТСС РТА-6500), MDKC-SF101 (АТСС РТА-6501), MDKC-SF102 (АТСС РТА-6502) и MDCKSF103 (РТА-6503). Ссылка 55 раскрывает MDCK клеточные линии с высокой чувствительностью к инфекции, включающие клетки MDCK.5F1 (АТСС CRL-12042). Любые из этих клеточных линий MDCK могут быть использованы. Если вирус выращен на клеточной линии млекопитающих, тогда антигенный компонент в наборе будет преимущественно свободен от яичных белков (например, овалбумина и овомукоида) и от куриной ДНК и тем самым будет иметь пониженную аллергенность. Если вирус растет на клеточной линии, то эта культура для роста, а также вирусный инокулум, используемый для затравки культуры, будут предпочтительно свободны (то есть будут испытаны на получение негативных результатов вследствие загрязнения) от вируса простого герпеса, респираторно-5 014190 синциального вируса, вируса парагриппа 3, коронавируса SARS, аденовируса, риновируса, респираторно-кишечных вирусов, вирусов полиомы, бирнавирусов, цирковирусов и/или парвовирусов [56]. Отсутствие вирусов простого герпеса особенно предпочтительно. Если вирус выращен на клеточной линии, то антигенный компонент преимущественно содержит менее чем 10 нг (предпочтительно менее чем 1 нг и более предпочтительно менее чем 100 пг) остатков ДНК клетки-хозяина на дозу, хотя следы ДНК клетки-хозяина могут присутствовать. Загрязняющая ДНК может быть удалена во время приготовления вакцины с помощью стандартных очистительных способов,таких как хроматография и др. Удаление остаточной ДНК клетки-хозяина может быть улучшено путем нуклеазной обработки, например, путем использования ДНКазы. Традиционный способ снижения контаминирования ДНК клетки-хозяина раскрыт в ссылке 57 и 58, включающий двустадийную обработку,где сначала используется ДНКаза (например, бензоназа), которая может быть использована в течение роста вируса, а затем катионный детергент (например, ЦТАБ), который может быть использован во время разрушения вирионов. Обработка алкилирующим агентом, таким как -пропиолактон, также может быть использована для удаления ДНК клетки-хозяина и преимущественно может также быть использована для инактивации вирионов [59]. Вакцины, содержащие 10 нг (например, 1 нг, 100 пг) ДНК клетки-хозяина на 15 г гемагглютинина, являются предпочтительными по сравнению с вакцинами, содержащими 10 нг (например, 1 нг,100 пг) ДНК клетки-хозяина на 0,25 мл объема. Вакцины, содержащие 10 нг (например, 1 нг, 100 пг) ДНК клетки-хозяина на 50 г гемагглютинина, являются более предпочтительными по сравнению с вакцинами, содержащими 10 нг (например,1 нг, 100 пг) ДНК клетки-хозяина на 0,5 мл объема. Предпочтительно средняя длина любой остаточной ДНК клетки-хозяина является меньше чем 500 п.о., например меньше чем 400 п.о., меньше чем 300 п.о., меньше чем 200 п.о., меньше чем 100 п.о. и т.д. При выращивании на клеточных линиях, таких как клетки MDCK, вирус можно вырастить в суспензии [38, 60, 61] или в адгезивной культуре. Одной из подходящих MDCK клеточных линий для суспензионной культуры является MDCK 33016 (представленная как DSM АСС 2219). В качестве альтернативы может быть использована культура на микроносителях. Клеточные линии, поддерживающие репликацию вирусов гриппа, предпочтительно выращивают в свободной от сыворотки культурной среде и/или в свободной от белков среде. В контексте данного изобретения среда относится к свободной от сыворотки, когда она не содержит никаких добавок сыворотки человеческого или животного происхождения. Средой, свободной от белков, принято обозначать культуры, в которых размножение клеток происходит в отсутствие белков, факторов роста, других белковых добавок и бессывороточных белков, но можно выборочно включать белки, такие как трипсин или другие протеазы, которые могут быть необходимы для роста вирусов. Клетки, растущие в такой культуре,обычно сами содержат белки. Клеточные линии, поддерживающие репликацию вирусов гриппа, предпочтительно растут при температуре ниже 37 С [62] (например, 30-36 С или около 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 С), например, во время вирусной репликации. Метод разведения вируса в культивируемых клетках обычно включает этапы посева культивируемых клеток со штаммом, который должен быть выращен, культивации зараженных клеток в течение желаемого периода времени для репродуцирования вируса, такого как, например, определено титром вируса или экспрессией антигена (например, между 24 и 168 ч после посева) и сбора выращенного вируса. Культивируемые клетки засеваются вирусом (измеренным PFU или TCID50) в отношении к клеткам от 1:500 до 1:1, предпочтительно от 1:100 до 1:5, более предпочтительно от 1:50 до 1:10. Вирус добавляется к суспензии клеток или наносится на монослой клеток, и вирус абсорбируется на клетках по крайней мере 60 мин, но обычно менее 300 мин, предпочтительно между 90 и 240 мин, при 25-40 С, предпочтительно от 28 до 37 С. Зараженная клеточная культура (например, монослои) может быть удалена либо методом замораживания-оттаивания, либо ферментацией, чтобы увеличить вирусное содержание собранной культуры в кондиционированной среде. Собранные жидкости затем либо активируются, либо хранятся в замороженном виде. Культивированные клетки могут подвергнуться множественному заражению (мз) от около 0,0001 до 10, предпочтительно от 0,002 до 5, более предпочтительно от 0,001 до 2. Еще более предпочтительно клетки заражаются при мз около 0,01. Зараженные клетки могут быть собраны через 30-60 ч после заражения. Предпочтительно клетки собирают через 34-48 ч после заражения. Еще более предпочтительно клетки собирают через 38-40 ч после заражения. Во время выращивания клеток обычно добавляют протеазы (в основном трипсин), чтобы позволить выделить вирус, и протеазы можно добавлять на любой подходящей стадии выращивания. Гемагглютинин (НА) является главным иммуногеном инактивированных вакцин гриппа, и дозы вакцин на самом деле стандартизируются относительно уровней НА, измеряемых обычно анализом одномерной радиальной иммунодиффузии (SRID). Вакцины в основном содержат около 15 г НА на штамм, хотя используются и более низкие дозы, например, для детей или в ситуациях пандемии. Были использованы дробные дозы, такие как 1/2 (то есть 7,5 г НА на штамм), 1/4 и 1/8 [4, 5], так же как и бо-6 014190 лее высокие дозы (например, 3 или 9 дозы [63, 64]). Такие вакцины могут содержать от 0,1 до 150 г НА на штамм гриппа, предпочтительно от 0,1 до 50 г, например 0,1-20, 0,1-15, 0,1-10, 0,1-7,5, 0,5-5 г и др. Отдельные дозы включают, например, около 45, около 30, около 15, около 10, около 7,5, около 5,около 3,8, около 1,9, около 1,5 и так далее на штамм. Эти более низкие дозы особенно применимы, когда в вакцине присутствует адъювант, как в изобретении. Для живых вакцин дозирование измеряется средней инфекционной дозой в тканевой культуре(TCID50), а не содержанием НА, и TCID50 между 106 и 108 (предпочтительно между 106,5-107,5) на штамм является типичной. НА, используемый в изобретении, может быть натуральным НА в том виде, в котором он находится в вирусе, или может быть модифицированньм. Например, известно что, чтобы модифицировать НА, необходимо удалить детерминанты (например, гиперосновные области около сайта расщепления между НА 1 и НА 2), которые делают вирус высокопатогенным у различных видов птиц, так как эти детерминанты иначе могут помешать росту вируса в яйцах. Антигенный компонент наборов изобретения может включать детергент, например ПАВ сложный эфир полиоксиэтилен сорбитана (известный как Tweens), октоксинол (такой как октоксинол-9 (Triton X100) или трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол), цетилтриметиламмонийбромид (ЦТАБ) или дезоксихолат натрия, в частности для сплит вакцины или вакцины из поверхностных антигенов. Детергент может присутствовать только в виде следов. Так, вакцина может включать менее чем 1 мг/мл каждого из октоксинола-10, -токоферил водород сукцината и полисорбата 80. Другие остаточные компоненты в виде следов могут представлять собой антибиотики (например, неомицин, канамицин, полимиксин В). Инактивированная, но нецельноклеточная вакцина (например, сплит вирусная вакцина или вакцина очищенного поверхностного антигена) может включать матриксный белок для того, чтобы получить пользу от дополнительных эпитопов Т-клетки, которые расположены в этом антигене. Так, нецельноклеточная вакцина (особенно сплит вакцина), которая включает гемагглютинин и нейраминидазу, может дополнительно включать матриксный белок M1 и/или М 2. Когда присутствует матриксный белок, включение определяемых уровней матриксного белка М 2 или фрагмента белка M1 является предпочтительным. Нуклеопротеин также может присутствовать. Адъювант. Адъюванты, которые были использованы в противогриппозных вакцинах, включают хитозан [65],эмульсии типа масло-в-воде, такие как MF59 [66], эмульсии вода-в-масле-в-воде [67], соли алюминия[2,5], CpG олигодезоксинуклеотиды, такие как CpG 7909 [68], термолабильный токсин E.coli [69, 87], и ее обезвреженных мутантов [70-71], монофосфорил липид А [72] и его 3-о-деацилированную производную[73], мутанты коклюшного токсина [74], мурамил-дипептиды [75] и др. Согласно изобретению основой адъювантного компонента являются соли алюминия. Эти соли включают адъюванты, известные как гидроокись алюминия и фосфат алюминия. Эти названия являются общепринятыми, но используются только для удобства, поскольку не являются точным описанием действительного химического соединения, которое представляют [например, см. глава 9 ссылки 76]. Изобретение может использовать любой из "гидроокисных" или "фосфатных" адъювантов, которые обычно используются в качестве адъювантов. Адъюванты, известные как "гидроокиси алюминия", являются в основном метагидроокисями алюминия, которые обычно, по крайней мере частично, являются кристаллическими. Метагидроокись алюминия, которая может быть представлена формулой AlO(OH), может быть отлична от других соединений алюминия, таких как гидроокись алюминия Al(OH)3, путем инфракрасной (ИК) спектроскопии, в частности присутствием полосы поглощения 1070 см-1 и плеча на 3090-3100 см-1 [глава 9 ссылки 76]. Степень кристалличности адъюванта гидроокиси алюминия отражается шириной дифракционной полосы при половинной высоте (WHH), при этом слабо кристаллизованные частицы показывают большее линейное расширение, благодаря меньшим размерам кристаллитов. Площадь поверхности увеличивается с увеличением WHH, и адъюванты с большим значением WHH, как было показано, имеют более высокую адсорбционную способность антигена. Волокнистая морфология (например, как видно в трансмиссионных электронных микрографах) является типичной для адъювантов гидроокиси алюминия. Величина pI адьювантов гидроокиси алюминия в основном около 11, то есть сам адъювант имеет положительный заряд на поверхности при физиологическом рН. Для адъювантов гидроокисей алюминия отмечены адсорбционные способности между 1,8-2,6 мг белка на мг А при рН 7,4. Адъюванты, известные как "фосфаты алюминия", в основном являются гидроксифосфатами, часто содержащими также небольшое количество сульфата (то есть сульфат гидроксифосфат алюминия). Они могут быть получены осаждением, и условия реакции и концентрирования во время осаждения влияют на степень замещения фосфата на гидроксил в соли. Гидроксифосфаты в общем имеют молярное отношение PO4/Al между 0,3 и 1,2. Гидроксифосфаты можно отличить от конкретного AlPO4 благодаря присутствию гидроксильных групп. Например, полоса ИК спектра 3164 см-1 (например, нагретого до 200 С) показывает присутствие структурных гидроксильных групп [гл. 9, ссылки 76]. Молярное отношение PO4/Al3+ адъюванта фосфата алюминия находится обычно между 1,3 и 1,2,-7 014190 предпочтительно между 0,8 и 1,2, более предпочтительно 0,950,1. Фосфат алюминия будет в основном аморфным, особенно гидроксифосфатные соли. Адъювант в основном является аморфным гидроксифосфатом алюминия с молярным отношением PO4Al между 0,84 и 0,92, включаемым при 0,6 мг Al3+/мл. Фосфат алюминия будет в основном в виде частиц (например, пластинчатой морфологии, как видно в трансмиссионных электронных микрографах). Типичный диаметр частиц находится в пределах 0,5-20 м(например, около 5-10 м) после адсорбции антигена. Для адъювантов фосфатов алюминия отмечены адсорбционные способности между 0,7-1,5 мг белка на мг Al при рН 7,4. Точка нулевого заряда (PZC) фосфата алюминия находится в обратной зависимости от степени замещения фосфата гидроксилом, и эта степень замещения может меняться в зависимости от реакционных условий и концентрации реагирующих веществ, используемых для приготовления соли путем осаждения. PZC также меняется при изменении концентрации свободных фосфатных ионов в растворе (больше фосфата = больше кислотная PZC) или при добавлении буфера, такого как гистидиновый буфер (делаетPZC более основным). Фосфаты алюминия, используемые согласно изобретению, будут иметь PZC в основном между 4,0 и 7,0, более предпочтительно между 5,6 и 6,5, например около 5,7. Суспензии алюминиевых солей, используемые для приготовления композиций изобретения, могут содержать буфер (например, фосфатный или гистидиновый или Tris буфер), но это не всегда необходимо. Суспензии предпочтительно являются стерильными и апирогенными. Суспензия может включать свободные фосфатные ионы в водной фазе, например, при концентрации между 1,0 и 20 мМ, предпочтительно между 5 и 15 мМ и более предпочтительно около 10 мМ. Суспензия может также включать хлорид натрия. В одном осуществлении изобретения адъювантный компонент включает смесь как гидроокиси алюминия, так и фосфата алюминия [4]. В этом случае фосфата алюминия может быть больше, чем гидроокиси, например весовое отношение, по крайней мере, равно 2:1, например 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 и т.д. Концентрация Al в композиции для введения пациенту предпочтительно менее 10 мг/мл, например 5, 4, 3, 2, 1 мг/мл и т.д. Предпочтительный интервал составляет между 0,3 и 1 мг/мл. Максимум 0,85 мг/доза является предпочтительным. Подобно включению одной или более солей алюминия в качестве адъювантов, адъювантный компонент может включать один или более адъювантов или иммуностимулирующих агентов. Такие дополнительны агенты включают, но не оганичиваются, адъювант 3-О-деацилированный монофосфорил липид A (3d-MPL) и/или эмульсию типа масло-в-воде. 3d-MPL также называется как 3-де-Оацилированный монофосфорил липид А или как 3-О-дезацил-4'-монофосфорил липид А. Название показывает, что позиция 3 восстанавливающего конца глюкозамина в монофосфорил липиде А деацилирована. Он был изготовлен из безгептозного мутанта S.minnesota и химически подобен липиду А, но не имеет кислотно-лабильной фосфорильной группы и основно-лабильной ацильной группы. Он активирует клетки линий моноцитов/макрофагов и стимулирует высвобождение некоторых цитокинов, включая IL-1, IL12, TNF- и GM-CSF. Приготовление 3d-MPL было первоначально описано в ссылке 77, и этот продукт был произведен и продан Corixa Corporation под торговой маркой MPL. Дальнейшие детали можно найти в ссылках 78-81. Наконец, в альтернативном осуществлении изобретения, вместо алюминиевой соли используется соль кальция. В этих осуществлениях адъювантный компонент в основном будет включать соль фосфата кальция. Фармацевтические композиции Антигенный и адъювантный компоненты набора будут оба фармацевтически приемлемы, так же как их смесь. Смешанный продукт может включать компоненты в дополнение к антигену и адъюванту, и они могут быть получены из антигенного компонента, и/или адъювантного компонента, и/или из выбранного третьего компонента. Так конечная смесь будет в основном включать один или более фармацевтических носителей и/или вспомогательных средств. Подробное обсуждение таких носителей и средств имеется в ссылке 82. Окончательная смесь может включать консерванты, такие как тиомерсал или 2-феноксиэтанол. Предпочтительно, однако, чтобы вакцина была, по существу, свободной от (например, менее 5 г/мл) соединений ртути, например свободной от тиомерсала [17, 83]. Вакцины, вовсе не содержащие ртуть,являются более предпочтительными. Вакцины, не содержащие консерванты, являются особенно предпочтительными. Для контроля тонуса предпочтительно включать физиологическую соль, такую как натриевая соль. Предпочтительным является хлорид натрия (NaCl), который может присутствовать в количестве от 1 до 20 мг/мл. Другие соли, которые могут присутствовать, включают хлорид калия, дигидрофосфат калия,дегидратированный фосфат динатрия, хлорид магния, хлорид кальция и др. Композиция может включать цитратные ионы. Композиции для введения будут иметь осмоляльность в основном между 200 и 400 мОсм/кг, предпочтительно 240-360 мОсм/кг и более предпочтительным будет падение в ряду 290-310 мОсм/кг. Осмо-8 014190 ляльность, как отмечалось ранее, не оказывает влияния на боль, вызываемую вакцинацией [84], но сохранение осмоляльности в этих пределах является, тем не менее, предпочтительным. Композиции для введения могут включать один или более буферов. Типичные буферы включают фосфатный буфер; Tris буфер; боратный буфер; сукцинатный буфер; гистидиновый буфер или цитратный буфер. Буферы будут включаться в основном в пределах 5-20 мМ. Величина рН композиции для введения будет, в общем, находиться между 5,0 и 8,1 и, как правило,между 6,0 и 8,0, или между 6,5 и 7,5, или 7,0 и 7,8. В способе по изобретению может поэтому иметься стадия корректирования рН целиковой вакцины перед упаковкой. Индивидуальные компоненты набора, включая емкости, предпочтительно являются стерильными. Компоненты набора предпочтительно являются непирогенными, то есть содержащими 1 ЭЕ (эндотоксиновая единица, стандартная величина) на дозу и предпочтительно 0,1 ЭЕ на дозу. Композиция предпочтительно является свободной от глютена. Компоненты набора могут включать материал для однократной вакцинации или для многочисленных вакцинаций (то есть упаковку для многократных доз). Так, например, антиген для 10 доз может быть включен в одну емкость, адъювант для 10 доз во вторую емкость. Компоненты могут быть смешаны в кабинете врача утром при использовании, чтобы получить 10 доз для введения ряду пациентов в течение дня. Каждая доза будет взята в новый шприц для введения. Включение консерванта является предпочтительным в случае многократных доз. В качестве альтернативы (или в дополнение) включению консерванта в состав многократных доз, композиции могут содержаться в емкости, имеющей асептическое приспособление для выемки материала. Методы лечения и введения вакцины. После смешения композиции изобретения подходят для введения людям, и изобретение представляет собой способ повышения иммунного ответа у пациента, включающий этап введения композиции изобретения пациенту. Изобретение также представляет собой набор или композицию изобретения для использования в качестве лекарственного средства. Изобретение также представляет собой использование (i) антигена вируса гриппа и (ii) адъювантного компонента, включающего соль алюминия, в производстве лекарственного средства для повышения иммунного ответа у пациента, в котором лекарственное средство включает антиген и адъювант как отдельные компоненты. Иммунный ответ, повышенный этими способами и их использованием, будет обычно включать гуморальный иммунный ответ, предпочтительно защитный иммунный ответ. Способы оценки иммунных ответов, нейтрализующей способности и защиты после вакцинации вируса гриппа хорошо известны в данной области техники. Исследования на человеке показали, что титры антивирусных антител против гемагглютинина человеческого вируса гриппа соотносятся с защитой (титр образца сыворотки, ингибирующей гемагглютинин, около 30-40 дает около 50% защиты от инфекции гомологичным вирусом) [85]. Иммунные ответы обычно измеряются ингибированием гемагглютинина, микронейтрализацией, одномерной радиальной иммунодиффузией (SRID) и/или одномерным радиальным гемолизом (SRH). Эти методы анализа хорошо известны в данной области техники. Композиции по изобретению могут быть введены различными способами. Наиболее предпочтительным способом иммунизации является внутримышечная инъекция (например, в руку или ногу), но другие подходящие способы включают подкожную инъекцию, введение интраназально [86-88], орально[89], внутрикожно [90, 91], через кожу [92] и др. Вакцины, полученные согласно изобретению, могут быть использованы для введения как детям, так и взрослым. Вакцины гриппа в настоящее время рекомендованы для использования при иммунизации взрослого населения и детей в возрасте от 6 месяцев. Так, пациенту может быть менее 1 года, 1-5 лет, 515 лет, 15-55 лет или по крайней мере 55 лет. Предпочтительными пациентами для получения вакцин являются пожилые люди (например, 50, 60 лет, предпочтительно 65 лет), дети (например, 5 лет),госпитализированные пациенты, медицинские работники, военнослужащие и военный персонал, беременные женщины, хронически больные, пациенты с иммунодефицитом, пациенты, которые приняли противовирусный препарат (например, оселтамивир или занамивир, такой как оселтамивир фосфат - см. ниже) за 7 дней перед получением вакцины; люди с аллергией на яйца и люди, уезжающие за границу. Вакцины не подходят только для этих групп, однако, могут быть использованы более широко среди населения. В отношении пандемических штаммов, введение всем возрастным группам предпочтительно. Вакцины, полученные с помощью изобретения, могут быть введены пациентам в основном в то же самое время (например, во время той же самой медицинской консультации, или визита к врачу, или в центр вакцинации), что и другие вакцины, например, в основном в то же самое время, что и вакцины против кори, эпидемического паротита, краснухи; тривакцина против кори, эпидемического паротита и коревой краснухи (MMR); вакцина против ветряной оспы, MMRV вакцина, вакцина против дифтерита,вакцина против столбняка, вакцина против коклюша, вакцина против КДС (коклюш, дифтерит, столбняк), конъюгированная вакцина против H.Influenzae типа b, инактивированная полиовирусная вакцина,вирусная вакцина против гепатита В, менингококковая конъюгированная вакцина (такая как четырехва-9 014190 лентная вакцина A-C-W135-Y), вакцина против респираторно-синцитиального вируса, пневмококковая конъюгированная вакцина и др. Введение в одно и то же время пневмококковой вакцины или менингококковой вакцины особенно полезно для пациентов преклонного возраста. Подобным образом вакцины изобретения могут быть введены пациентам в основном в то же самое время (например, во время той же самой медицинской консультации или визита к врачу), что и антивирусное соединение и, в частности, антивирусное соединение, активное против вируса гриппа (например,оселтамивир). Эти антивирусы включают ингибиторы нейраминидазы, такие как (3R,4R,5S)-4 ацетиламино-5-амино-3-(1-этилпропокси)-1-циклогексен-1-карбоновую кислоту, включая ее сложные эфиры (например, этиловые эфиры) и ее соли (например, фосфатные соли). Предпочтительным антивирусом является (3R,4R,5S)-4-ацетиламино-5-амино-3-(1-этилпропокси)-1-циклогексен-1-карбоновая кислота, этиловый сложный эфир, фосфат (1:1), известный также как оселтамивир фосфат (TAMIFLU). Лечение может быть проведено в режиме введения одной дозы или многократных доз. Многократные дозы могут быть использованы при первичной иммунизации и/или при ускоренном режиме иммунизации. Введение более чем одной дозы (в основном две дозы) особенно полезно для иммунологически не подготовленных пациентов, например для людей, которым никогда ранее не вводили противогриппозную вакцину, или при вакцинации против новых подтипов НА (как при вспышке пандемии). Многоразовые дозы будут вводиться, как правило, с интервалом по крайней мере в 1 неделю (например, около 2,около 3, около 4, около 6, около 8, около 10, около 12, около 16 недель и т.д.). Поскольку композиции и наборы изобретения включают адъювант на основе алюминия, во время хранения возможно осаждение компонентов. Поэтому композицию следует встряхивать перед введением пациенту. Композиция после встряхивания будет в виде белой непрозрачной суспензии. Общие сведения Понятие включающий охватывает содержащий, так же как и состоящий, например, композиция, включающая X, может состоять только из X или может содержать что-нибудь дополнительное,например X+Y. Выражение по существу не исключает полностью, например композиция, которая по существу свободна от Y, может быть полностью свободна от Y. Там, где необходимо, выражение по существу может быть пропущено в описании изобретения. Понятие около в связи с числовым значением х означает, например, х 10%. Если конкретно не указано, то способ, включающий стадию смешения двух или более компонентов,не требует никакого особого порядка смешения. Таким образом, компоненты могут быть смешаны в любом порядке. Там, где присутствуют три компонента, затем два компонента могут быть соединены друг с другом, и потом комбинация может соединяться с третьим компонентом и т.п. Когда антиген описывается как адсорбированный адъювантом, то предпочтительно, чтобы по крайней мере 50 вес.% этого антигена было адсорбировано, например 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98% или более. Там, где используются животные материалы (и в особенности крупного рогатого скота) в культуре клеток, их следует получать из источников, которые свободны от передающихся губчатых энцефалопатий (TSEs), и, в частности, свободны от губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота (BSE). В целом, предпочтительным является культивирование клеток при полном отсутствии материалов животного происхождения. Когда клеточный субстрат используется для рекомбинации или в способах обратной генетики,предпочтительным является получение одобрения для использования в производстве человеческой вакцины, например, как в Ph Eur general chapter 5.2.3. Варианты осуществления изобретения Поскольку вышеупомянутые проблемы связаны с использованием алюминиевых солей в качестве адъювантов противогриппозных вакцин, было решено исследовать возможность приготовления вакцины,в которой адъювантный и антигенный компоненты содержатся отдельно до момента использования, но в которой может иметь место адсорбция антигена. Чтобы определить возможность такого подхода, поверхностно очищенные антигены вируса гриппа были смешаны с суспензией гидроокиси алюминия. Сразу после образования смеси соль алюминия осадили путем настольного центрифугирования, и количество белка, оставшегося на поверхности (то есть было измерено количество неадсорбировавшегося белка). Современные штаммы вируса гриппа А. Гемагглютинин был очищен от вируса гриппа A/New Caledonian (H1N1) или A/Wyoming (H3N2) и был разбавлен до получения 75 г/мл. Адъювант гидроокись алюминия был приготовлен как 4,25 мг/мл(приблизительно 1,5 мг Al/мл). Суспензия адъюванта в количестве 1 мл была добавлена к 4 мл раствора антигена в 15 мл цилиндре "Falcon", и смесь была перевернута и инкубирована при комнатной температуре. Образцы отбирались через промежутки времени от нулевого и затем через 5, 10, 20, 30, 60, 90 и 120 мин. В качестве контрольных были образцы, содержащие только антиген (10 мМ PBS, рН 7,7) или только адъювант (10 мМ PBS, рН 7,7). Образцы сразу центрифугировали при 4000 об./мин, чтобы осадить адсорбированный материал для анализа. Содержание белка определяли белковым анализом Bio- 10014190Rad и неденатурирующим SDS-PAGE. Результаты исследования адсорбции для двух штаммов представлены ниже, при этом нормализованным до 100% является содержание белка в контрольном образце, содержащем только антиген. Таким образом, высокая степень адсорбции достигается очень быстро. Отличия для разных временных точек являются незначительными. Чтобы подтвердить эти результаты, было использовано окрашивание ярко-красным красителем SYPRO на SDS-PAGE разделении супернатантов. Никаких полос белка не было обнаружено на контрольных образцах адьюванта через, 0, 5, 10, 20 или 30 мин. Таким образом,присутствие какого-либо количества белка было ниже предела определения этим методом, который достаточно чувствителен, чтобы обнаружить 1-2 нг белка. Результаты показывают, что по крайней мере 97% антигена быстро адсорбируется на адъюванте. Поразительно, что адсорбция происходит практически мгновенно, что может позволить использовать противогриппозную вакцину с адьювантом без предварительной адсорбции к адъюванту. Таким образом,адъювантная вакцина может быть приготовлена более быстро, что будет наиболее полезно в случае пандемической ситуации. Эти результаты были получены с двумя различными штаммами вируса гриппа А,и можно ожидать, что тот же самый результат получится для других штаммов и с другими адъювантами на основе нерастворимых солей алюминия. Пандемический штамм гриппа A. Был приготовлен препарат A/Vietnam/1203/2004A/PR/8/34 (H5N1) из поверхностно очищенного антигена вируса гриппа с реассортацией 2:6. Содержание гемагглютинина, определенное SRID, составляло 41 г НА/мл. 30 мл A/H5N1 было концентрировано приблизительно до объема 15 мл при использовании центробежного фильтровального прибора Ultrafree-15. Общее содержание белка как в первоначальном, так и в концентрированном A/H5N1 определялось путем белкового анализа Bio-Rad по стандартной кривой с 0-50 г/мл гамма-глобулина. Используя этот результат, была рассчитана доля НА по отношению к общему белку. Эта величина затем была использована для расчета окончательного объема,необходимого для 60 г НА/мл раствора A/H5N1. 0,7 мл 2 мг/мл адъюванта гидроокиси алюминия было добавлено к 0,7 мл 60 г НА/мл МВР в 1,5 мл цилиндр центрифуги. Раствор был смешан путем переворачивания и инкубирован при комнатной температуре (приблизительно 20 С). Дубликаты образцов были отобраны через 5, 10, 30 мин, 2, 8 и 24 ч. Для контроля 0,7 мл 10 мМ PBS, рН 7,7 добавляли к 0,7 мл 60 г НА/мл МВР и 0,7 мл 10 мМ PBS, рН 7,7 добавляли к 0,7 мл 2 мг/мл гидроокиси алюминия. Образцы центрифугировали при 13000 об./мин в течение 1 мин при комнатной температуре, чтобы удалить суспендированную гидроокись алюминия, и супернатант переливали в маркированный 7 мл стерильный флакон. Результаты были проанализированы, как описано выше, путем белкового анализа Bio-Rad и неденатурирующим SDS-PAGE с SYPRO красителем и представлены ниже. Результаты для препарата A/H5N1 были сравнимы с экспериментами, проведенными с использованием эквивалентных препаратов A/New Caledonia и A/Wyoming. При использовании белкового анализаBio-Rad были обнаружены очень низкие уровни белка в супернатанте для всех образцов, подтверждающие, что почти весь белок остается связанным с гранулами гидроокиси алюминия. Чувствительное окрашивание образцов с помощью ярко-красного красителя SYPRO после SDS-PAGE разделения не выявило никаких белковых полос в контрольном или любом из шести временных образцов с адъювантом. Таким образом, присутствие какого-либо количества белка было ниже предела определения этим методом. Никакого значительного различия не существовало между концентрациями белков в различных временных точках. Абсорбционные способности всех образцов и соответствующие оценки концентрации белков для гидроокиси алюминия контрольного и временных образцов были ниже нижнего предела стандартной кривой от 5 до 50 г/мл. Таким образом, данные показывают, что белок А/Н 5 ТМ 1 мгновенно адсорбируется на адъюванте соли алюминия и остается прочно связанным по крайней мере 24 ч. Клинические данные для людей. Как отмечалось в ссылке 93, 300 добровольцев в произвольном открытом исследовании неконтролируемой фазы I получали одну из шести инактивированных одновалентных сплит вакцин гриппаA/Vietnam/1194/2004 (H5N1) состава, включая 3 различные дозы НА (7,5 г, 15 г или 30 г) с или без адъюванта гидроокиси алюминия. Пациентов, подвергшихся двум вакцинациям, и образцы крови проверяли на ингибирование гемагглютинина и микронейтрализацию. Вакцина была получена на эмбрионах куриных яиц с использованием лицензионного процесса производства, используемого для межпандемической вакцины VAXIGRIP [94]. Штаммом вакцины был эталонный штамм гриппа A/Vietnam/1194/2004/NIBRG14 (H5N1), изготовленный NIBSC. Этот штамм содержит модифицированные гемагглютинин и нейраминидазу из высокопатогенного штамма птичьего гриппа A/Vietnam/1194/2004 и другие вирусные белки из гриппа A/PR/8/34 (H1N1). Гемагглютинин был модифицирован для того, чтобы удалить последовательность многоосновной аминокислоты на расщепляющем сайте. Шприцы 0,5 мл (23-калибр, с иглой 1 дюйм) были наполнены сплит вакциной до уровня 7,5, 15 или 30 г гемагглютинина в фосфатно-соляном буфере без адъюванта. При вакцинации без адъюванта эти шприцы использовали для пациентов сразу. Для вакцинации с адъювантом, однако, содержимое шприца было введено в стерильную ампулу, где было содержание шприца, содержащего адъювант гидроокись алюминия. Это смешение происходило у постели больного, прямо перед использованием, и после 10 с смешивания содержимое было перенесено в новый шприц (23 калибр, с иглой 1 дюйм), с легким перемешиванием, чтобы гомогенизировать суспензию антиген/адъювант, и затем введено пациенту внутримышечно (дельтовидную мышцу плеча). Объем инъекции составляет 0,5 мл, кроме 30 г адъюванта (1 мл по объему). Окончательное содержание адъюванта в вакцине составляет 600 г. Предварительные изучения смешения антигена и адъюванта показало подобные коэффициенты адсорбции для всех трех доз антигена. Каждый участник получил по две внутримышечные иньекции, с интервалом в 21 день (дни 0 и 21). Образцы крови были взяты в дни 0, 21 и 42. Все шесть лекарственных форм были хорошо перенесены без серьезных неблагоприятных последствий между днями 0 и 42, без серьезной боли при инъекции и без лихорадящих состояний с оральной- 12014190 температурой более 38 С. Все лекарственные формы вызывали иммунный ответ, при этом у некоторых ответы обнаруживались после одной дозы. Что касается ингибирования гемагглютинина, то от 6 до 34% каждой группы имели титры 32 и более на 21 день, причем эта доля увеличивалась до 28-67% на 42 день. Ответы на нейтрализацию антител сопровождались особенностью, подобной при ингибировании гемагглютинина. Лекарственная форма с 30 г адъюванта вызывала самый большой ответ (индекс сероконверсии ингибирования гемагглютинина 67% после двух вакцинаций). В частности, двухдозовый режим вакцины H5N1 с 30 г адъюванта показал иммунный ответ, соответствующий Европейским нормативным требованиям для разрешения сезонных противогриппозных вакцинаций. Следует понимать, что изобретение было только описано посредством примера, и могут иметь место модификации, которые остаются в масштабе и духе изобретения. Ссылки (содержание которых введено здесь в качестве ссылки)(i) антигенный компонент, включающий антиген вируса гриппа; и(ii) адъювантный компонент, включающий соль алюминия, где антигенный компонент и адъювантный компонент находятся в разных емкостях. 2. Набор по п.1, в котором один или оба компонента находятся в ампуле. 3. Набор по п.1, в котором один или оба компонента находятся в шприце. 4. Набор по п.1, в котором один компонент находится в шприце, а другой компонент находится в ампуле. 5. Набор по п.4, в котором антигенный компонент находится в шприце. 6. Набор по любому предшествующему пункту, в котором антиген вируса гриппа является инактивированным вирусом.- 14014190 7. Набор по п.6, в котором антиген вируса гриппа включает целый вирус, сплит вирус или очищенные поверхностные антигены. 8. Набор по любому предшествующему пункту, в котором антиген вируса гриппа является антигеном вируса гриппа А подтипа H1, Н 2, Н 3, Н 4, Н 5, Н 6, Н 7, Н 8 или Н 9. 9. Набор по любому предшествующему пункту, в котором антиген вируса гриппа получают из вируса гриппа, выращенного на яйцах. 10. Набор по любому одному из пп.1-8, в котором антиген вируса гриппа получают из вируса гриппа, выращенного на клеточной культуре. 11. Набор по любому одному из пп.1-8, в котором антигенный компонент вируса гриппа является свободным от овалбумина, овомукоида и куриной ДНК. 12. Набор по п.10, в котором антигенный компонент вируса гриппа содержит менее 10 нг клеточной ДНК из культуры клеток хозяина. 13. Набор по любому предшествующему пункту, в котором антигенный компонент вируса гриппа содержит между 0,1 и 50 г гемагглютинина на вирусный штамм в компоненте. 14. Набор по любому предшествующему пункту, в котором адъювантный компонент включает адъювант на основе гидроокиси алюминия. 15. Набор по любому предшествующему пункту, в котором адъювантный компонент включает адъювант на основе фосфата алюминия. 16. Антигенный компонент, включающий антиген вируса гриппа, и адъювантный компонент, включающий соль алюминия, для одновременного раздельного или последовательного использования, где антигенный компонент и адъювантный компонент находятся в разных емкостях. 17. Иммуногенная композиция, включающая антиген вируса гриппа и соль алюминия в качестве адъюванта, где композицию получают путем смешивания антигена и адъюванта в момент использования. 18. Способ получения вакцины против гриппа, включающий стадии:(i) приготовления антигенного компонента, включающего антиген вируса гриппа;(iii) объединения антигенного и адъювантного компонентов в наборе, где антигенный компонент и адъювантный компонент находятся в разных емкостях. 19. Способ получения и введения вакцины против гриппа, включающий этапы:(а) соединения (i) антигенного компонента, включающего антиген вируса гриппа, и (ii) адъювантного компонента, включающего соль алюминия; и(b) введения вакцины пациенту в течение 12 ч после выполнения этапа (а). 20. Использование (i) антигена вируса гриппа и (ii) адъювантного компонента, включающего соль алюминия, для получения лекарственного средства для повышения иммунного ответа у пациентов, где лекарственное средство содержит антиген и адъювант в виде отдельных компонентов.