Определение употребления марихуаны

Номер патента: 19664

Опубликовано: 30.05.2014

Авторы: Пулли Тимо, Таккинен Кристиина, Седерлунд Ханс

Есть еще 7 страниц.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Антитело или фрагмент антитела для определения каннабиноида, содержащие участки, определяющие комплементарность, (CDR) легкой и тяжелой цепей антитела, где указанные участки легкой цепи имеют аминокислотные последовательности, состоящие из аминокислот 23-35, 51-57 и 93-100 SEQ ID NO: 3, и указанные участки тяжелой цепи имеют аминокислотные последовательности, состоящие из аминокислот 29-35, 50-60 и 99-109 SEQ ID NO: 4.

2. Фрагмент антитела по п.1, включающий VL, содержащий аминокислоты 1-111 SEQ ID NO: 3, и VH, содержащий аминокислоты 1-120 SEQ ID NO: 4, или включающий легкую цепь с последовательностью SEQ ID NO: 3 и тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID NO: 4.

3. Антитело или фрагмент антитела по п.1, которые специфично распознают иммунный комплекс, образованный тетрагидроканнабинолом (ТНС) и антителом к ТНС.

4. Набор для анализа, предназначенный для определения каннабиноида, включающий антитело или фрагмент антитела по любому из пп.1-3 и другое антитело или фрагмент антитела для связывания каннабиноида, содержащие участки, определяющие комплементарность, (CDR) легкой и тяжелой цепей антитела, где указанные участки легкой цепи имеют аминокислотные последовательности, состоящие из аминокислот 24-35, 51-57 и 90-98 SEQ ID NO: 1, указанные участки тяжелой цепи имеют аминокислотные последовательности, состоящие из аминокислот 27-36, 51-66 и 99-107 SEQ ID NO: 2.

5. Набор для анализа по п.4, дополнительно включающий реагенты для неконкурентного гомогенного иммунологического анализа, предпочтительно исследования резонансного переноса энергии флюоресценции с временным разрешением (TR-FRET).

6. Набор для анализа по любому из пп.4, 5, дополнительно включающий реагенты для определения нескольких наркотических средств.

7. Применение антитела или фрагмента антитела по любому из пп.1-3 для определения каннабиноидов в образце, взятом из организма человека, которого необходимо протестировать на употребление каннабиноидов.

8. Применение по п.7, где каннабиноид представляет собой ТНС.

9. Способ определения аналита с помощью иммунологического анализа в образце, взятом из организма, где этот образец подвергают взаимодействию с парой реагентов, включающей первое антитело или фрагмент антитела, которые специфично связываются с аналитом, и второе антитело или фрагмент антитела, которые специфично связываются с комплексом аналита и первого антитела или фрагмента антитела, и определение связывания второго антитела или фрагмента антитела с указанным комплексом, что указывает на наличие аналита в образце, отличающийся тем, что указанный аналит представляет собой каннабиноид и указанное первое антитело или фрагмент антитела содержат участки, определяющие комплементарность, (CDR) легкой и тяжелой цепей антитела, где указанные участки легкой цепи имеют аминокислотные последовательности, состоящие из аминокислот 24-35, 51-57 и 90-98 SEQ ID NO: 1, и указанные участки тяжелой цепи имеют аминокислотные последовательности, состоящие из аминокислот 27-36, 51-66 и 99-107 SEQ ID NO: 2, и указанное второе антитело или фрагмент антитела содержат участки, определяющие комплементарность, (CDR) легкой и тяжелой цепей антитела, где указанные участки легкой цепи имеют аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислот 23-35, 51-57 и 93-100 SEQ ID NO: 3, и указанные участки тяжелой цепи имеют аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислот 29-35, 50-60 и 99-109 SEQ ID NO: 4.

10. Способ определения аналита с помощью иммунологического анализа по п.9, который представляет собой неконкурентный гомогенный иммунологический анализ, преимущественно TR-FRET.

11. Способ определения аналита с помощью иммунологического анализа по любому из пп.9, 10, где образец, который необходимо исследовать, выбирается из группы, состоящей из крови, мочи и ротовой жидкости.

12. Способ определения аналита с помощью иммунологического анализа по п.9, где ТНС определяют в слюне.

13. Полинуклеотид, кодирующий антитело или фрагмент антитела по любому из пп.1-3.

14. Клетка-хозяин, способная экспрессировать антитело или фрагмент антитела по любому из пп.1-3.

Текст

Смотреть все

В изобретении предложен связывающий партнер, в частности фрагмент антитела, который специфично распознает иммунный комплекс антиген-антитело, образованный антителом к ТНС и ТНС (тетрагидроканнабинол). Связывающий партнер облегчает проведение неконкурентных гомогенных иммунологических анализов по определению употребления конопли. Также описывается набор для анализа, включающий связывающий партнер. Предпочтительно иммунологический анализ применяется для проведения анализа слюны подозреваемых водителей в дорожных условиях.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ТЕКНОЛОГИАН ТУТКИМУСКЕСКУС ВТТ (FI) Область техники Настоящее изобретение обеспечивает средства улучшения иммунологических анализов для определения употребления марихуаны. В частности, настоящее изобретение относится к связывающему партнеру, в частности фрагменту антитела, который способен связывать иммунный комплекс тетрагидроканнабинола (ТНС) и антитела к ТНС. Настоящее изобретение также направлено на набор для анализа, содержащий связывающий партнер, и использование указанного связывающего партнера для определения употребления марихуаны. Дополнительно настоящее изобретение относится к иммунологическому анализу, в котором используется указанный связывающий партнер. Более того, настоящее изобретение направлено на полинуклеотид, кодирующий указанный связывающий агент, и хозяйскую клетку, способную его экспрессировать. Предшествующий уровень техники Наркотическая зависимость представляет собой серьезную угрозу, в первую очередь безопасности дорожного движения, поэтому были разработаны различные методы для удобного определения веществ,вызывающих болезненное пристрастие. Многие анализы представляют собой иммунологические анализы и в основном относятся к конкурентным иммунологическим анализам, которые обычно являются менее специфичными по сравнению с анализами неконкурентного формата. Например, Kerrigan и Phillips сравнили 12 коммерчески доступных типов ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) для определения опиатов, метамфетамина, бензодиазепинов, метаболитов кокаина, фениклидина и каннабиноидов в цельной крови и моче (Kerrigan S.,Phillips, W., 2001, Clinical Chemistry, 47(3):540-547). Проводили иммунологический анализ конкурентного формата, результаты не были полностью удовлетворительными, т.к. были получены ложные результаты, и наблюдалась перекрестная реактивность. Можно определять вещества, вызывающие болезненное пристрастие, не только в крови или моче,но также и в слюне, которая представляет собой предпочтительную биологическую среду для проведения анализа в дорожных условиях. Lo Muzio et al. исследовали коммерчески доступный иммунологический экспресс-анализ для обнаружения наркотических средств в моче и сравнили две биологические среды: нетрадиционную (слюну) и традиционную (мочу). Обнаружили, что результаты иммунологического анализа образцов слюны на присутствие конопли, ТНС, бензодиазепинов и трициклических антидепрессантов были отрицательными, однако результаты газовой хроматографии масс-спектрометрии (GC-MS) показали присутствие этих веществ в низких концентрациях. Заключили, что прежде чем использовать набор для анализа применительно к образцам слюны, его необходимо усовершенствовать (Lo Muzio L.,et al., 2005, Int. J. Immunopathol Pharmacol., 18(3):567-573). В публикации WO 2004/046733 описан неконкурентный иммунологический анализ для исследования малых аналитов, таких как вещества, вызывающие болезненное пристрастие. Для улучшения специфичности и чувствительности в анализе используется первое антитело, специфичное в отношении аналита, и второе антитело, специфичное в отношении иммунного комплекса первого антитела и аналита. Используемое антитело против иммунного комплекса (ИК) получали из наивной библиотеки фагового дисплея фрагментов антител человека, предварительно инкубируя фаги дисплея со связанным первым антителом для отбора фагов, связывающихся с первым антителом как таковым, отделяя несвязанные фаги и инкубируя со смесью аналита и иммобилизованного первого антитела для отбора фагов, которые связываются с ИК, образованным иммобилизованным первым антителом и аналитом, но не с антителом как таковым. Были получены очень хорошие результаты по определению морфина в слюне. А 9-Тетрагидроканнабинол (А 9-ТНС) представляет собой родительский препарат конопли и быстро метаболизируется до 11-нор-9-ТНС-СООН или 11-ОН-9-ТНС, который можно определить в моче. Таким образом, предпочтительно употребление конопли определяют с помощью количественного анализа 9-ТНС в слюне, который служит лучшим показателем недавнего употребления конопли, чем определение метаболитов в моче. Однако оказалось трудно разработать экспресс-тест для этого аналита, и набор для анализа, присутствующий на рынке, не является достаточно чувствительным. В US 6326159 и публикации Ullman et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci, 90:1184-1189 описан иммунологический анализ с использованием антител к ИК для улучшения сродства и специфичности первичных антител. В этих публикациях получали вторичное антитело к ИК, которое связывается с первичным антителом к аналиту, которое смешивается с аналитом, но не связывается с первичным антителом или аналитом по отдельности. Описывается антитело, которое распознает ИК антитела к тетрагидроканнабинолу(ТНС). Антитело к ИК было получено с использованием антител к ТНС с аффинной меткой в качестве иммуногена и отбором антитела к ИК, связывание которого усиливалось в присутствии 9 ТНС. Наблюдали некоторую перекрестную реакцию, например, с метаболитами ТНС, что является нежелательным при криминалистическом анализе лекарственных средств. Антитела были получены с помощью традиционных гибридомных технологий, которые делают их слишком большими для применения в гомогенных иммунологических анализах.Kintz P. et al. исследовали коммерческое устройство для анализа наркотических веществ в слюне,сравнили полученные результаты с результатами анализа GC-MC и обнаружили, что индикатор выявил только одного водителя, который употребил ТНС, тогда как по результатам GC-MC у 18 водителей были получены положительные результаты. Заключили, что в настоящее время ограничением использования этого образца для проведения анализа в дорожных условиях является отсутствие соответствующего иммунологического анализа, в котором при достаточно малых концентрациях выявляется родительское соединение (ТНС) (Kintz P., et al., 2005, J. Anal. Toxicol., 29(7):724-727). Существующие в настоящее время иммунологические анализы по определению марихуаны не являются удовлетворительными, в частности из-за низкой специфичности и чувствительности. Поэтому сохраняется потребность в легком, быстром и надежном анализе употребления марихуаны, который можно использовать, например, для проведения анализа в дорожных условиях и предпочтительно для исследования образцов ротовой жидкости, который является неинвазивным, легко осуществимым и который можно проводить под пристальным наблюдением. Настоящее изобретение удовлетворяет, по крайней мере, некоторые из этих потребностей. Сущность изобретения Настоящее изобретение обеспечивает новый реагент, который способствует быстрому и надежному определению употребления марихуаны. Реагент представляет собой белок, способный распознавать иммунный комплекс каннабиноида и антитела к каннабиноиду. Более точно настоящее изобретение обеспечивает связывающий партнер, включающий участки, определяющие комплементарность, (CDR) легкой и тяжелой цепей антитела, при этом указанные участки легкой цепи имеют аминокислотные последовательности 23-35, 51-57 и 93-100 SEQ ID NO: 3 и указанные участки тяжелой цепи имеют аминокислотные последовательности 29-35, 50-60 и 99-109 SEQ ID NO: 4. Также настоящее изобретение обеспечивает тест-набор, содержащий связывающий партнер, и использование связывающего партнера для определения каннабиноидов в образце биологического материала, полученного от человека, которого необходимо проверить на употребление марихуаны. Благодаря высокой специфичности, чувствительности и предпочтительно небольшому размеру связывающий партнер особенно подходит для проведения гомогенных неконкурентных иммунологических анализов, которые можно использовать, например, для проведения анализа в дорожных условиях слюны водителей,которых подозревают в употреблении марихуаны. Дополнительно настоящее изобретение обеспечивает иммунологический анализ для определения аналита в образце биологического материала, в ходе которого образец взаимодействует с парой реагентов, включающей первый связывающий партнер, который специфично связывается с аналитом, и второй связывающий партнер, который специфично связывается с комплексом аналита и первого связывающегося партнера, и определения связывания второго связывающего партнера с указанным комплексом, которое свидетельствует о наличии в образце аналита, где указанный аналит представляет собой каннабиноид, и указанный второй связывающий партнер включает участки, определяющие комплементарность,(CDR) легкой и тяжелой цепей антитела, при этом указанные участки легкой цепи имеют аминокислотные последовательности, состоящие из аминокислот 23-35, 51-57 и 93-100 SEQ ID NO: 3, и указанные участки тяжелой цепи имеют аминокислотные последовательности, состоящие из аминокислот 29-35, 5060 и 99-109 SEQ ID NO: 4. В дополнение настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотид, кодирующий связывающий партнер, и клетку хозяина, которая способна экспрессировать связывающий партнер. Полинуклеотид представляет собой ДНК или РНК. Преимущественные варианты реализации изобретения изложены в зависимых пунктах формулы изобретения. Прочие цели, детали и преимущества настоящего изобретения станут понятны из приведенных ниже графических материалов, подробного описания изобретения и описания примеров осуществления изобретения. Краткое описание графических материалов Фиг. 1 иллюстрирует аминокислотные последовательности легкой цепи Fab Т 3 антитела к ТНС(SEQ ID NO: 1) и VH-CH1 тяжелой цепи Fab T3 антитела к ТНС (SEQ ID NO: 2). Отмечены три участка,определяющие комплементарность, CDR1, CDR2 и CDR3 каждой из указанных цепей иммуноглобулина. Фиг. 2 иллюстрирует аминокислотные последовательности легкой цепи Fab 104 иммунного комплекса антитела к Т 3 и ТНС (SEQ ID NO: 3) и тяжелой цепи Fab 104 иммунного комплекса антитела к Т 3 и ТНС (SEQ ID NO: 4). Отмечены три участка, определяющие комплементарность, CDR1, CDR2 и CDR3 каждой из указанных цепей иммуноглобулина. Фиг. 3 иллюстрирует результаты анализа ТНС методом TR-FRET различных наркотических средств и их метаболитов, полученные при сочетании Fab Т 3 антитела к ТНС и Fab 104 иммунного комплекса антитела к Т 3 и ТНС. Описание примеров осуществления изобретения Каннабиноиды представляют собой традиционное название терпенофеноловых молекул, присутствующих в растениях конопли рода Cannabis sativa. В общем смысле это определение объединяет группу молекул, по структуре похожих на тетрагидроканнабинол (ТНС) и которые связываются с рецептором каннабиноидов. ТНС является основным психотропным каннабиноидом конопли и является синонимом 9-тетрагидроканнабинола (9-ТНС) и D9-тетрагидроканнабинола (D9-ТНС), которые используются взаимозаменяемо в настоящем описании. ТНС метаболизируется в организме, в частности, до 11-нор-D9THC-COOH и 11-OH-D9-THC, которые также представляют собой примеры других каннабиноидов. Связывающий партнер согласно настоящему изобретению специфично распознает иммунный комплекс ТНС и антитела к ТНС, благодаря чему взаимодействует с метаболитами в существенно меньшей степени. Связывающий партнер согласно настоящему изобретению можно использовать в анализах сэндвичтипа для определения ТНС в образце, в ходе которого образец взаимодействует с парой реагентов, включающих первый связывающий партнер, который специфично связывается с ТНС, и второй связывающий партнер, который способен специфично распознавать иммунный комплекс ТНС и антитела к ТНС и который представляет собой связывающий партнер согласно настоящему изобретению. Связывание второго связывающего партнера с иммунным комплексом первого связывающего партнера и ТНС свидетельствует о наличие ТНС в образце. Термин "связывающий партнер" в настоящем описании обычно обозначает белок или полипептид,например антитела, включая фрагменты антител, имеющие желательные связывающие свойства. Антитело представляет собой молекулу иммуноглобулина и может принадлежать любому классу IgG, IgM,IgE, IgA или IgD; при этом наиболее часто используются IgG и IgM. Предпочтительно связывающие партнеры представляют собой фрагменты антител, включающие сайт связывания лиганда, например Fabили scFv-фрагменты. Фрагмент, обозначаемый как Fab-фрагмент (антиген-связывающий фрагмент), состоит из вариабельного и константного домена легкой цепи иммуноглобулина, ковалентно связанного с помощью дисульфидного мостика с вариабельным и первым константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина. Fv (вариабельный домен) обозначает вариабельные участки молекулы иммуноглобулина,которые отвечают за связывание лиганда. ScFv (одноцепочечный Fv-фрагмент) обозначает молекулу, в которой вариабельные домены легкой и тяжелой цепи антитела связаны пептидом с образованием отдельной полипептидной цепи, синтезируемой с одной молекулы мРНК. Вариабельные участки легкой и тяжелой цепи иммуноглобулина в совокупности отвечают за связывание лиганда. Лиганд представляет собой вещество, с которым связывается связывающий партнер, в отношении антител он представляет собой антиген или гаптен. Связывающие партнеры с легкостью можно получить с использованием рекомбинантной библиотеки связывающих партнеров в формате фагового дисплея, например, как описано в WO 2004/046733. После отбора первого связывающего партнера его объединяют с лигандом и этот комплекс используют для отбора второго связывающего партнера из рекомбинантной библиотеки. Первый связывающий партнер без лиганда используется в качестве негативного отбора. Второй связывающий партнер должен только распознавать комплексы, а не свободный первый связывающий агент или свободный антиген в значительной степени. Библиотеку антител в формате фагового дисплея можно создать с помощью клонирования доменов иммуноглобулина, кодирующих кДНК, в подходящий вектор для фагового дисплея. ДНК, кодирующую миллионы вариантов фрагментов антител, клонируют сериями в вектор в качестве части белка оболочки фага. С помощью трансформации бактерий этими векторами можно получить большие библиотеки, содержащие миллионы фрагментов антител с различной специфичностью. Культивирование бактерий приводит к экспрессии фагов, представляющих фрагменты антител на своей поверхности. Ген предъявляемого антитела включается в геном фага, таким образом связывая генотип с фенотипом. Физическая связь между предъявляемым белком и его ДНК позволяет провести массовый анализ большого количества вариантов белка, каждый из которых связан с соответствующей ДНК, с помощью простой процедуры отбора in vitro, которую называют пэннинг (метод анализа антигенов или антител путем "просеивания" анализируемого содержимого через сорбент или подложку с иммобилизованным лигандом). В простейшем виде пэннинг проводят следующим образом: инкубируют весь набор вариантов, демонстрируемых фагом, с интересующим лигандом, который иммобилизован на носителе, удаляют несвязавшиеся фаги и элюируют специфично связанный фаг, нарушив связывание с лигандом. Элюированный фаг затем амплифицируют in vivo. Эту процедуру повторяют несколько раз, что приводит к поэтапному обогащению пула фагов для последовательностей с наибольшим связыванием. Приблизительно через 3-6 круга отбора и амплификации наилучше клоны секвенируют и трансформируют в хозяйскую клетку для дальнейшей экспрессии. Хозяйская клетка может представлять собой клетку прокариотического или эукариотического организма, например клетку дрожжей, животного, растения, насекомого или бактерии. Также она может представлять собой гибридомную клетку, которая производит моноклональное антитело после трансформации. Рекомбинантный связывающий партнер или по меньшей мере его часть также можно получить синтетическими способами. Пара реагентов, включающая первый связывающий партнер, распознающий каннабиноид, и второй связывающий партнер, распознающий иммунный комплекс каннабиноида и указанного первого связывающего агента, представляет собой неконкурентный анализ сэндвич-типа соответствующего каннабиноида. Сэндвич можно определять с помощью стандартных иммунологических анализов. Один партнер может быть иммобилизован на носителе, таком как лунка микротитровального планшета или бусина. Сэндвич образуется в присутствии аналита и другого связывающего партнера. Сэндвич можно определять, например, с помощью вторых антител или посредством мечения по меньшей мере одного из связы-3 019664 вающих партнеров. Метка может представлять собой традиционную метку, такую как радиоактивная метка, фермент или флуоресцентное вещество. Анализ может представлять собой, например, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) или иммунофлюоресцентный анализ (FIA). Большим преимуществом пары реагентов, включающей связывающий партнер согласно настоящему изобретению, является то, что она способствует проведению гомогенного иммунологического анализа, т.е. иммунологического анализа, которой проводится в растворе. Исключение этапов иммобилизации и промывки делает этот анализ в высшей степени простым. Гомогенный анализ обеспечивает великолепный и удобный инструмент для проведения анализов на месте, например, которые может использовать полиция для захвата водителей и т.д. Иммунологический анализ, который обеспечивает настоящее изобретение, является в 10 раз более эффективным по сравнению с существующими коммерческими методами. Образцом для исследования может быть любой образец жидкости организма, например кровь, сыворотка или моча - но предпочтительна ротовая жидкость, например слюна. Предпочтительно аналит представляет собой ТНС. Предпочтительный гомогенный иммунологический анализ основан на резонансном переносе энергии флюоресценции (FRET), см. Szllsi J. et al., 1998, Communications in Clinical Cytometry, 34:159-179. При FRET от молекулы флюорофора (донора) высвобождается энергия высокого уровня и переносится на другой флюорофор (акцептор) посредством межмолекулярного диполь-дипольного взаимодействия. Это возможно только, если расстояние между донором и акцептором небольшое (10-100 А) и спектр флюоресценции донора и абсорбции акцептора частично перекрываются. Перенос энергии определяется как изменение флюоресценции. Часто используется флюоресценция с временным разрешением (HemmilFRET можно применять к настоящему изобретению через мечение двух связывающих партнеров,которые предпочтительно представляют собой фрагменты антитела, флюорофорами, которые образуют пару донор-акцептор FRET. Если связывающие партнеры и аналит имеют малые размеры, флюорофоры сближаются и получается измеримый сигнал FRET. В другом случае иммунологический анализ употребления марихуаны может представлять собой традиционный сендвич-анализ в микротитровальных планшетах или боковой анализ текучести. Связывающий партнер согласно настоящему изобретению можно включать в набор для анализа,который также может содержать любой другой реагент, необходимый для анализа и инструкцию по применению. Предпочтительно набор для анализа также содержит первый связывающий партнер для связывания аналита. Более предпочтительно указанный связывающий партнер содержит участки, определяющие комплементарность, (CDR) легкой и тяжелой цепей антитела, где указанные участки легкой цепи имеют аминокислотные последовательности, состоящие из аминокислот 24-35, 51-57 и 90-98 SEQID NO: 1, и указанные участки тяжелой цепи имеют аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислот 27-36, 51-66 и 99-107 SEQ ID NO: 2. Предпочтительно набор для анализа включает реагенты для проведения неконкурентного гомогенного анализа, например реагенты, необходимые для анализаTR-FRET. Набор может также включать растворы, буферы, промывочные растворы для анализа и средства для определения, например метки и, возможно, флуориметр. Можно проводить анализ таким образом, что все реагенты смешиваются в лунке микротитровального планшета и добавляют серийные разведения образца. Предпочтительно, например, для использования полицией реагенты находятся в сухом виде в сосуде. Добавляют слюну, которая растворяет реагенты, и можно определить результат без дальнейшей обработки. Предпочтительно набор для анализа включает реагенты для исследования нескольких наркотических веществ, например реагенты для анализа морфина, кодеина, героина, амфетамина, метамфетамина,барбитуратов и бензодиазепинов. В этом случае набор для анализа может включать различные пары реагентов, отделенные друг от друга, например, в форме микропанели, благодаря чему можно исследовать множество наркотиков в одном образце слюны одновременно. Связывающий партнер согласно настоящему изобретению содержит три CDR легкой цепи антитела, имеющей последовательность SEQ ID NO: 3, и три CDR тяжелой цепи антитела, имеющей последовательность SEQ ID NO: 4. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения связывающий партнер содержит целый вариабельный участок, т.е. лиганд-связывающую часть указанной легкой цепи (VL) и тяжелой цепи (VH). Также он может содержать аминокислоты 1-111 SEQ ID NO: 3 и аминокислоты 1-120 SEQ ID NO: 4. В частности, указанный связывающий партнер включает аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 3 и NO: 4. Соответственно первый связывающий агент может включать целый вариабельный участок SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, т.е. аминокислоты 1-108 SEQ ID NO: 1 и аминокислоты 1-118 SEQ ID NO: 2. В частности, он содержит аминокислотные последовательности SEQID NO: 1 и NO: 2. Незначительные вариации или модификации любой из предложенных в описании и формуле изобретения последовательности или подпоследовательности включены в объем описания при условии, что они не влияют на связывающую активность белков. Такие вариации и модификации, в частности, включают замены консервативных аминокислот. Приведенные ниже примеры иллюстрируют изобретение, но не ограничивают его. Пример 1. Получение Fab антитела к ТНС. Мышей иммунизировали ТНС, конъюгированным с BSA (Fitzgerald) с адъювантом Фрейнда, и после вторичной инъекции антигена анализировали образцы сыворотки, мышей с наибольшим ответом на антиген по результатам непрямого анализа ELISA отбирали для создания библиотеки антител методом фагового дисплея. Создавали библиотеку фрагментов антител методом фагового дисплея, ТНСспецифичные фаги обогащали и фрагменты гена Fab отдельных клонов выделяли, экспрессировали и описывали, как описано в WO 2004/046733. Для дальнейших исследований отбирали Fab Т 3 антитела к ТНС. Аминокислотная последовательность легкой цепи Fab Т 3 антитела к ТНС представлена на SEQ IDNO:1, аминокислотная последовательность VH-CH1 цепи Fab Т 3 антитела к ТНС представлена на SEQSEQ ID NO: 2. Аминокислоты 1-108 SEQ ID NO: 1 представляют собой вариабельный участок легкой цепи и аминокислоты 1-118 SEQ ID NO: 2 представляют собой вариабельный участок тяжелой цепи. Аминокислоты 109-215 SEQ ID NO: 1 представляют собой константный участок легкой каппа-цепи и аминокислоты 119-221 SEQ ID NO: 2 представляют собой константный участок CH1 тяжелой цепи мыши. Аминокислотные последовательности Fab Т 3 антитела к ТНС также изображены на фиг. 1. Пример 2. Получение антитела к иммунному комплексу Fab антитела к ТНС и ТНС. Отбор антитела, специфичного в отношении иммунного комплекса, из наивной библиотеки фагового диспея scFv человека. Фрагмент Fab Т 3 биотинилировали с помощью набора ImmunoPure Sul-fo-NHS-LC-Biotin Kit(Pierce). Биотинилированное антитело очищали и меняли буфер на PBS с колонками Econo-Pac 10DG(Bio-Rad, CA, USA). 200 мкл наивной библиотеки фагового дисплея scFv человека (легкие цепи каппа или лямбда) в BSA/PBS предварительно инкубировали с 10 мкл магнитных бусин, покрытых стрептавидином (Dynal, M-280) и 0,5 мкг биотинилированного Fab Т 3 в течение ночи при +4 С. Наивную библиотеку фагового дисплея scFv человека создавали из смешанных лимфоцитов 50 здоровых доноров. Размер библиотеки составил 1108 клонов. Наивная библиотека фагового дисплея scFv человека содержит IgM специфичные VH-гены, объединенные с VL-генами, специфичными к каппа- или лямбда-цепям. Несвязавшиеся фаги отделяли от бусин и 100 мкл фагов инкубировали с 100 нг ТНС, 500 нг биотинилированного Fab Т 3 и 5 мкл магнитных бусин, покрытых стрептавидином, в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере. Фоновую процедуру отбора проводили аналогично, но без ТНС. Магнитные бусины промывали 5 раз 0,5 мл PBS и связавшиеся фаги элюировали 100 мкл HCl (рН 2.2) в течение 30 мин. Элюированные фаги нейтрализовали 1 М Tris и инфицировали клетки Е. coli XL1-Blue. Клетки культивировали и очищали фаги согласно описанию WO 2004/046733. После трех циклов пэннинга наблюдали обогащение, когда сравнивали количество элюированных фагов с количеством элюированных фагов в контрольной лунке. Также по результатам ELISA фагов четко наблюдали обогащение специфических связывающих агентов иммунного комплекса, образованного Fab Т 3 и ТНС, при анализе элюированных фагов после этапов отбора и анализе отдельных клонов фагов scFv. Описание отдельных клонов. Отдельные клоны фагов scFv, связывавшиеся специфично с комплексом Т 3 и ТНС, отбирали, секвенировали, экспрессировали и исследовали. Для дальнейшего исследования отобрали клон 104. Из-за того, что scFv склонны агрегировать в процессе экспрессии и очистки, клон 104, специфичный к иммунному комплексу, переводили во фрагмент Fab с помощью клонирования участков генов легкой лямбдацепи человека и константных участков HC1 lgG1 в гены VL и VH соответственно. Для очистки с помощью афинной хроматографии с использованием иммобилизованных металлов (IMAC) на С-конец СН 1 прикрепляли метку, содержащую 6 остатков гистидина. Фрагмент Fab 104 клонировали в вектор экспрессии pKKtac и проверяли последовательность. Аминокислотная последовательность Fab 104 легкой цепи иммунного комплекса анти-Т 3 и ТНС представлена на SEQ ID NO: 3 и аминокислотная последовательность VH-СН 1-6His-участка Fab представлена на SEQ ID NO: 4. Аминокислоты 1-111 SEQ ID NO: 3 представляют собой вариабельный участок легкой цепи и аминокислоты 1-120 SEQ ID NO: 4 представляют собой вариабельный участок тяжелой цепи. Аминокислоты 112-216 SEQ ID NO: 3 представляют собой константный участок легкой лямбда-цепи человека и аминокислоты 121-223 SEQ ID NO: 4 представляют собой константный участок CH1 участка тяжелой цепи человека. 6 остатков гистидина на Сконце константного участка тяжелой цепи облегчают очистку фрагмента Fab методом афинной хроматографии с использованием иммобилизованных металлов (IMAC). Экспрессия и очистка Fab 104. Вектором экспрессии фрагмента Fab 104 трансформировали штамм-продуцент RV308 E. coli. Клетки инокулировали в 25 мл среды ТВ (дрожжевой экстракт 12 г/л, соевый пептон 24 г/л, KH2PO4 2.31 г/л,KH2PO4 12.54 г/л, глицерин 5 г/л, рН 7.1) с 100 мкг/мл ампициллина и 2% глюкозы и инкубировали в течение ночи при +37 С на шейкере. 6 мл инокулята из ночной культуры добавляли в две колбы Эрленмайера, содержащие 300 мл ТВ и 100 мкг/мл ампициллина. Клетки инкубировали при +37 С на шейкере до достижения OD600 4, после чего в культуру добавляли 0.3 мл 1 М IPTG и 100 мкг/мл ампициллина и продолжали инкубацию в течение ночи при +30 С на шейкере. Супернатант культуральной среды использовали для очистки фрагмента 104 Fab. Клетки центрифугировали при 4000 g в течение 20 мин при 4 и супернатант переносили в чистый флакон. Супернатант обрабатывали 2 мг/мл DNasel для удаления остатков хромосомной ДНК в течение 1 ч при +37 С. Поскольку экспрессируемый Fab 104 имеет метку из 6 остатков гистидина на С-конце, его можно очистить с помощью афинной хроматографии с использованием иммобилизованных металлов (IMAC). Fab 104 очищали на Ni2+ Chelating Sepharose (AmershamPharmacia Biotech). Чистоту Fab 104 проверяли с помощью SDS-PAGE. Пример 3. Гомогенный иммунологический анализ ТНС методом резонансного переноса энергии флюоресценции с временным разрешением (TR-FRET). Фрагмент Fab Т 3 антитела к ТНС метили европием с помощью набора LANCE Eu-W1024 ITC chelate Kit (Wallac). Буфер меченого Т 3 меняли на 50 мМ Tris, рН 7.8, 0.9% NaCl. Fab 104 фрагмент иммунного комплекса антитела к Т 3 + ТНС метили Alexa Fluor 647 с помощью набора Alexa Fluor Protein Labeling kit (Molecular Probes, Inc.). В лунки микротитровального планшета, содержащие 60 мкл слюны, добавляли 1 мкг Fab Т 3 антитела к ТНС, меченного европием, и 1,5 мкг Fab 104 антииммунный комплекс, меченного Alexa Fluor 647. В лунки добавляли 40 мкл образцов слюны, в которые в концентрации 0, 3.75, 7.5, 15, 30, 60 и 120 нг/мл вносили наркотические вещества: D9-THC, 11-OH-D9-THC, 11-Hop-D9-THC-COOH, героин и амфетамин. После перемешивания измеряли резонансный перенос энергии флюоресценции с временным разрешением (TR-FRET) с помощью флуориметра Victor V (Perkin Elmer Wallac). Результаты представлены на фиг. 3. Образцы слюны с ТНС имеют высокую величину флуоресценции, тогда как метаболиты ТНС имеют существенно пониженные величины флуоресценции, героин и морфин имеют величины флуоресценции, сравнимые с фоновой флуоресценцией в контроле (меченые фрагменты Т 3 и 104 без добавления наркотиков). Fab 104 связывает иммунный комплекс, образованный Т 3 и ТНС, с исключительно высокой специфичностью и чувствительностью. Этот метод позволяет определять концентрацию ТНС намного ниже порога отсечки (20 нг/мл в слюне) экспресс-методов, существующих в настоящее время на рынке. Несмотря на то что описывается только одна стратегия обеспечения реагентов и анализов согласно настоящему изобретению, многочисленные изменения и модификации станут очевидными для специалиста в данной области. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Антитело или фрагмент антитела для определения каннабиноида, содержащие участки, определяющие комплементарность, (CDR) легкой и тяжелой цепей антитела, где указанные участки легкой цепи имеют аминокислотные последовательности, состоящие из аминокислот 23-35, 51-57 и 93-100 SEQ IDNO: 3, и указанные участки тяжелой цепи имеют аминокислотные последовательности, состоящие из аминокислот 29-35, 50-60 и 99-109 SEQ ID NO: 4. 2. Фрагмент антитела по п.1, включающий VL, содержащий аминокислоты 1-111 SEQ ID NO: 3, иVH, содержащий аминокислоты 1-120 SEQ ID NO: 4, или включающий легкую цепь с последовательно- 12019664 стью SEQ ID NO: 3 и тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID NO: 4. 3. Антитело или фрагмент антитела по п.1, которые специфично распознают иммунный комплекс,образованный тетрагидроканнабинолом (ТНС) и антителом к ТНС. 4. Набор для анализа, предназначенный для определения каннабиноида, включающий антитело или фрагмент антитела по любому из пп.1-3 и другое антитело или фрагмент антитела для связывания каннабиноида, содержащие участки, определяющие комплементарность, (CDR) легкой и тяжелой цепей антитела, где указанные участки легкой цепи имеют аминокислотные последовательности, состоящие из аминокислот 24-35, 51-57 и 90-98 SEQ ID NO: 1, указанные участки тяжелой цепи имеют аминокислотные последовательности, состоящие из аминокислот 27-36, 51-66 и 99-107 SEQ ID NO: 2. 5. Набор для анализа по п.4, дополнительно включающий реагенты для неконкурентного гомогенного иммунологического анализа, предпочтительно исследования резонансного переноса энергии флюоресценции с временным разрешением (TR-FRET). 6. Набор для анализа по любому из пп.4, 5, дополнительно включающий реагенты для определения нескольких наркотических средств. 7. Применение антитела или фрагмента антитела по любому из пп.1-3 для определения каннабиноидов в образце, взятом из организма человека, которого необходимо протестировать на употребление каннабиноидов. 8. Применение по п.7, где каннабиноид представляет собой ТНС. 9. Способ определения аналита с помощью иммунологического анализа в образце, взятом из организма, где этот образец подвергают взаимодействию с парой реагентов, включающей первое антитело или фрагмент антитела, которые специфично связываются с аналитом, и второе антитело или фрагмент антитела, которые специфично связываются с комплексом аналита и первого антитела или фрагмента антитела, и определение связывания второго антитела или фрагмента антитела с указанным комплексом,что указывает на наличие аналита в образце, отличающийся тем, что указанный аналит представляет собой каннабиноид и указанное первое антитело или фрагмент антитела содержат участки, определяющие комплементарность, (CDR) легкой и тяжелой цепей антитела, где указанные участки легкой цепи имеют аминокислотные последовательности, состоящие из аминокислот 24-35, 51-57 и 90-98 SEQ ID NO: 1, и указанные участки тяжелой цепи имеют аминокислотные последовательности, состоящие из аминокислот 27-36, 51-66 и 99-107 SEQ ID NO: 2, и указанное второе антитело или фрагмент антитела содержат участки, определяющие комплементарность, (CDR) легкой и тяжелой цепей антитела, где указанные участки легкой цепи имеют аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислот 23-35, 5157 и 93-100 SEQ ID NO: 3, и указанные участки тяжелой цепи имеют аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислот 29-35, 50-60 и 99-109 SEQ ID NO: 4. 10. Способ определения аналита с помощью иммунологического анализа по п.9, который представляет собой неконкурентный гомогенный иммунологический анализ, преимущественно TR-FRET. 11. Способ определения аналита с помощью иммунологического анализа по любому из пп.9, 10, где образец, который необходимо исследовать, выбирается из группы, состоящей из крови, мочи и ротовой жидкости. 12. Способ определения аналита с помощью иммунологического анализа по п.9, где ТНС определяют в слюне. 13. Полинуклеотид, кодирующий антитело или фрагмент антитела по любому из пп.1-3. 14. Клетка-хозяин, способная экспрессировать антитело или фрагмент антитела по любому из пп.13.

МПК / Метки

МПК: G01N 33/542, G01N 33/68, G01N 33/94, C07K 16/16

Метки: употребления, марихуаны, определение

Код ссылки

<a href="https://eas.patents.su/15-19664-opredelenie-upotrebleniya-marihuany.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Определение употребления марихуаны</a>

Похожие патенты