Стабильные глазные капли для заживления повреждений роговицы

СТАБИЛЬНЫЕ ГЛАЗНЫЕ КАПЛИ ДЛЯ ЗАЖИВЛЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ РОГОВИЦЫ Изобретение имеет целью доведение до максимума эффективности, сведение к минимуму частоты побочных эффектов и улучшение стабильности при хранении глазных капель для заживления повреждений роговицы, содержащих пептид (SSSR), аминокислотная последовательность которого представлена Ser-Ser-Ser-Arg, или его фармацевтически приемлемую соль и пептид(FGLM), аминокислотная последовательность которого представлена Phe-Gly-Leu-Met-NH2,или его фармацевтически приемлемую соль. Соотношение концентраций SSSR или его фармацевтически приемлемой соли и FGLM или его фармацевтически приемлемой соли составляет от 1/15 до 1/50. Концентрация SSSR или его фармацевтически приемлемой соли составляет от 0,001 до 0,3 мас.%, а концентрация FGLM или его фармацевтически приемлемой соли составляет от 0,015 до 1,5 мас.%. Значение pH глазных капель поддерживается между 2,5 и 6,5. Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение касается глазных капель, содержащих пептид с аминокислотной последовательностью, представленной Ser-Ser-Ser-Arg (в дальнейшем именуется "SSSR"), или его фармацевтически приемлемую соль, и пептид с аминокислотной последовательностью, представленной Phe-Gly-LeuMet-NH2 (в дальнейшем именуется "FGLM"), или его фармацевтически приемлемую соль, которые получают при заданном соотношении концентраций SSSR или его фармацевтически приемлемой соли иFGLM или его фармацевтически приемлемой соли, концентрации SSSR или его фармацевтически приемлемой соли, концентрации FGLM или его фармацевтически приемлемой соли и диапазоне pH глазных капель, при этом улучшается эффект усиления заживления повреждений роговицы и стабильность активных ингредиентов в глазных каплях. Предшествующий уровень техникиSSSR представляет собой частичный пептид инсулиноподобного фактора роста I (в дальнейшем именуется "IGF-I"), a FGLM представляет собой тетрапептид С-концевого участка субстанции Р (JP-A2003-231695 и JP-A-10-17489). В JP-A-2003-231695 раскрыто, что SSSR оказался минимальной единицей для проявления активности IGF-I в отношении усиления заживления ран, и что комбинированное применение частичного пептида IGF-I типа SSSR и FGLM или субстанции Р дает эффект усиления заживления повреждений роговицы и заживления кожных ран. Далее, в JP-A-2003-231695 изложено изобретение, касающееся новой субстанции типа SSSR, представляющей собой частичный пептид IGF-I, и фармацевтического применения комбинации из частичного пептида IGF-I типа SSSR и FGLM или субстанции Р. Однако состав глазных капель, в которых применяется комбинация SSSR и FGLM, не был полностью изучен. Сущность изобретения Задачи, решаемые изобретением. В отношении состава глазных капель, в которых применяется комбинация двух агентов SSSR иFGLM, представляет интерес подробное исследование химических свойств SSSR и FGLM и определение соотношения концентраций этих медикаментов, концентрации каждого медикамента и т.п. с тем, чтобы довести до максимума эффективность комбинированного средства и свести к минимуму появление их побочных эффектов, а также улучшить стабильность при хранении глазных капель с учетом процесса распределения глазных капель или вариации при их применении. Средства решения задач. Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования, в результате которых они установили следующий факт и осуществили настоящее изобретение. Относительно глазных капель, содержащих SSSR или его фармацевтически приемлемую соль и FGLM или его фармацевтически приемлемую соль, эффект усиления заживления повреждений роговицы, то есть их эффективность можно довести до максимума, а глазные капли могут стабильно храниться в течение длительного времени путем: 1) доведения соотношения концентраций SSSR или его фармацевтически приемлемой соли и FGLM или его фармацевтически приемлемой соли в пределах от 1/15 до 1/50; 2) доведения концентрации SSSR или его фармацевтически приемлемой соли в пределах от 0,001 до 0,3% (w/v); 3) доведения концентрации FGLM или его фармацевтически приемлемой соли в пределах от 0,015 до 1,5% (об./вес.); и 4) доведения pH глазных капель в пределах от 2,5 до 6,5. Таким образом, настоящее изобретение касается глазных капель, содержащих SSSR или его фармацевтически приемлемую соль и FGLM или его фармацевтически приемлемую соль, и позволяет максимизировать эффективность комбинированного средства путем изучения соотношения концентрацийSSSR или его фармацевтически приемлемой соли и FGLM или его фармацевтически приемлемой соли,устранить побочные эффекты медикаментов путем снижения соответствующих концентраций SSSR или его фармацевтически приемлемой соли и FGLM или его фармацевтически приемлемой соли, и обеспечить стабильность при длительном хранении глазных капель путем изучения влияния pH на глазные капли. В настоящем изобретении примеры фармацевтически приемлемых солей включают гидрохлориды,сульфаты, фосфаты, лактаты, ацетаты, трифторацетаты, формиаты, малеаты, фумараты, оксалаты, метансульфонаты и n-толуолсульфонаты. Более предпочтительны ацетаты для SSSR и гидрохлориды дляFGLM. В глазных каплях настоящего изобретения соотношение концентраций SSSR или его фармацевтически приемлемой соли и FGLM или его фармацевтически приемлемой соли составляет от 1/15 до 1/50,более предпочтительно от 1/15 до 1/20. Результаты нижеприведенного фармакологического тестирования показали, что действие на заживление повреждений эпителия роговицы комбинированного средства, в котором SSSR или его фармацевтически приемлемая соль применяется в комбинации с FGLM или его фармацевтически приемлемой солью в глазных каплях настоящего изобретения, усиливается, если соотношение их концентраций нахо-1 022927 дится в пределах от 1/15 до 1/50, в частности, эффект достигает максимума, когда соотношение их концентраций находится в пределах от 1/15 до 1/20. Концентрация SSSR или его фармацевтически приемлемой соли в глазных каплях настоящего изобретения составляет от 0,001 до 0,3 мас.%, более предпочтительно от 0,005 до 0,1 мас.%. Концентрация FGLM или его фармацевтически приемлемой соли в глазных каплях настоящего изобретения составляет от 0,015 до 1,5 мас.%, более предпочтительно от 0,1 до 1 мас.%. Результаты нижеприведенного фармакологического тестирования эффектов показывают, что если концентрация ацетата SSSR и концентрация гидрохлорида FGLM в глазных каплях настоящего изобретения составляет 0,001 мас.% или больше и 0,015 мас.% или больше, соответственно, то комбинированное средство проявляет отличную эффективность. Но обычно при повышении концентрации медикамента в некоторых случаях появляются побочные эффекты, поэтому предпочтительно концентрацию каждого медикамента нужно поддерживать как можно более низкой. Значение pH глазных капель настоящего изобретения составляет от 2,5 до 6,5, предпочтительно от 3,0 до 6,0, более предпочтительно от 3,5 до 5,5. Результаты нижеприведенного теста на стабильность показывают, что водный раствор, содержащий ацетат SSSR, устойчив при pH 6,5 или меньше (в пределах от 2,5 до 6,5), а водный раствор, содержащий гидрохлорид FGLM, устойчив при pH 2,5 или больше (в пределах от 2,5 до 7,0). Следовательно, глазные капли настоящего изобретения, содержащие SSSR или его фармацевтически приемлемую соль и FGLM или его фармацевтически приемлемую соль, могут стабильно храниться в течение длительного времени в диапазоне pH от 2,5 до 6,5. Глазные капли настоящего изобретения можно приготовить общепринятым способом, а при необходимости можно добавить поддерживающие изотоничность вещества, pH-регулирующие вещества и др. Примеры поддерживающих изотоничность веществ включают, без ограничения, концентрированный глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, трегалозу, сахарозу, сорбитол, маннитол, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция и хлорид магния, более предпочтительно хлорид натрия и концентрированный глицерин. Примеры pH-регулирующих веществ включают хлорную кислоту, лимонную кислоту, цитрат натрия, фосфорную кислоту, однозамещенный фосфат натрия, двухзамещенный фосфат натрия, двухзамещенный фосфат калия, уксусную кислоту, ледяную уксусную кислоту, ацетат натрия, гидроксид натрия,гидроксид калия, борную кислоту, тетраборат натрия, моноэтаноламин, серную кислоту, карбонат натрия и бикарбонат натрия. Глазные капли настоящего изобретения применяются в качестве терапевтического средства для повреждений роговицы, а примеры повреждений роговицы включают язвы роговицы, повреждения эпителия роговицы, кератит и сухость глаз. Частота закапывания глазных капель настоящего изобретения правильно определяется в соответствии с симптомами, возрастом, дозовой формой и др. Глазные капли можно закапывать от одного раза до нескольких (к примеру, от 1 до 6 раз) раз в день в количестве от одной до нескольких капель за раз. Эффекты изобретения. Как будет подробно описано в приведенном ниже разделе о тестировании, глазные капли настоящего изобретения могут усиливать эффект заживления повреждений эпителия роговицы комбинированным средством, если соотношение концентраций ацетата SSSR и гидрохлорида FGLM составляет от 1/15 до 1/50, в частности эффект может достигать максимума, если соотношение их концентраций составляет от 1/15 до 1/20. Кроме того, если концентрация ацетата SSSR ацетата доведена до 0,001 мас.% или больше,а концентрация гидрохлорида FGLM доведена до 0,015 мас.% или больше, то отличная превосходная эффективность, а также, если pH глазных капель настоящего изобретения поддерживается в пределах от 2,5 до 6,5, то ацетат SSSR и гидрохлорид FGLM могут стабильно храниться в течение длительного времени. Осуществление изобретения Далее будут представлены результаты различных тестов, однако эти примеры служат для лучшего понимания настоящего изобретения, а не для ограничения рамок настоящего изобретения. 1. Тестирование на фармакологические эффекты. Тестирование на фармакологические эффекты проводилось с использованием приведенных ниже препаратов. 1-1. Приготовление медикаментов.i) Ацетат SSSR. Синтезировали блокированный тетрапептид (Z-Ser(OBzl)-Ser(OBzl)-Ser(OBzl)-Arg(NO2)-OBzl) путем элонгации пептидной цепи с помощью Boc-Ser(OBzl)-OH методом Boc, используя в качестве исходного материала для С-концевой аминокислоты H-Arg(NO2)-OBzl. Затем этот блокированный тетрапетид подвергали деблокированию методом каталитической гидрогенизации с помощью палладия в присутствии уксусной кислоты, получая ацетат SSSR.ii) Гидрохлорид FGLM. Синтезировали блокированные дипептиды (Boc-Phe-Gly-OBzl и Boc-Leu-Met-NH2) синтезировали из производных аминокислот Boc-Phe-OH и H-Gly-OBzl и из производных аминокислот Boc-Leu-OH иH-Met-NH2, соответственно, путем образования пептидной связи с помощью конденсирующего реагента. Затем эти блокированные дипептиды подвергали дебензилированию методом каталитической дегидрогенизации с помощью палладия и синтезу пептидов методом Boc, при этом образовался блокированный тетрапептид (Boc-Phe-Gly-Leu-Met-NH2). Затем этот блокированный тетрапептид деблокировали с помощью хлористого водорода, получая гидрохлорид FGLM. 1-2. Приготовление тест-препаратов. Тест-препарат 1. Ацетат SSSR и гидрохлорид FGLM растворяли в физрастворе с фосфатным буфером, при этом получали тест-препарат 1 (глазные капли), содержащий ацетат SSSR при 0,01% масс, и гидрохлорид FGLM при 0,005 мас.%. Тест-препараты 2-8. Тест-препараты 2-8 получали тем же способом, что и тест-препарат 1, за исключением того, что количество ацетата SSSR и количество гидрохлорида FGLM в тест-препарате 1 изменяли таким образом,чтобы получить концентрации и соотношения концентраций в каждом тест-препарате, приведенные в табл. 1. 1-3. Способ тестирования и результаты. На мышиной модели нейропаралитической кератопатии, полученной методом Nagano et al. (Invest.Ophthalmol. Vis. Sci., 44, 3810-3815 (2003, исследовали эффект на заживление повреждения эпителия роговицы после отслоения эпителия роговицы. В частности, оценку проводили следующим способом. После отслоения эпителия роговицы каждый тест-препарат закапывали 6 раз в день (по 5 мкл за раз) с интервалом в 1,5 ч. Для измерения площади повреждения проводили окрашивание флуоресцеином, а затем делали снимки роговицы и рассчитывали окрашенную флуоресцеином площадь при помощи системы анализа изображений. Таблица 1- наблюдался значительный эффект расширения эпителия роговицы;- наблюдался эффект усиления заживления повреждений эпителия роговицы;- наблюдалась тенденция к усилению заживления повреждений эпителия роговицы;- не наблюдалось эффекта усиления заживления повреждений эпителия роговицы. 1-4. Обсуждение. Как видно из табл. 1, в случае комбинированных средств из тест-препаратов 4-6 эффект заживления повреждений эпителия роговицы усиливался при комбинированном применении ацетата SSSR и гидрохлорида FGLM, в частности, эффект максимален, когда соотношение концентраций ацетата SSSR и гидрохлорида FGLM составляет 1/15 и 1/17 (тест-препараты 4 и 5). Соответственно, регулируя соотношение концентраций ацетата SSSR и гидрохлорида FGLM в пределах от 1/15 до 1/50, концентрацию ацетатаSSSR до 0,001 мас.% или больше и концентрацию гидрохлорида FGLM до 0,015 мас.% или больше следует ожидать проявления отличной эффективности. 2. Тестирование на стабильность глазных капель. 2-1. Приготовление образцов и способ тестирования. Каждый образец (100 мл, глазные капли), содержащий ацетат SSSR при 0,003 мас.% и гидрохлоридFGLM при 0,05 мас.%, готовили в диапазоне pH от 2,5 до 7,0 и хранили при 40 С. Определяли концентрации SSSR и FGLM методом HPLC после 2 месяцев хранения, 3 месяцев хранения и 6 месяцев хранения, а также определяли остаточное содержание SSSR и FGLM, соответственно. 2-2. Результаты тестирования. Остаточное содержание SSSR представлено в табл. 2, а остаточное содержание FGLM представлено в табл. 3. 2-3. Обсуждение. Как оказалось, даже при хранении глазных капель при 40 С в течение 6 месяцев при pH в диапазоне от 2,5 до 6,5 остается 50% или больше SSSR (см. табл. 2), а при pH в диапазоне от 2,5 до 7,0 остается 50% или больше FGLM (см. табл. 3). Соответственно, в глазных каплях, содержащих ацетат SSSR и гидрохлорид FGLM настоящего изобретения при поддержании pH глазных капель в диапазоне от 2,5 до 6,5, и ацетат SSSR, и гидрохлорид FGLM может стабильно храниться в течение длительного времени. 3. Препаративные примеры. Как видно из табл. 4 и 5, глазные капли 1-8 готовили общепринятым способом (по 100 мл). Таблица 4 Промышленное применение Настоящим изобретением предусмотрены глазные капли, содержащие SSSR или его фармацевтически, приемлемую соль и FGLM или его фармацевтически приемлемую соль, при этом эффективность глазных капель доведена до максимума, а появление побочных эффектов сведено к минимуму, а также улучшена их стабильность при хранении. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Стабильные глазные капли для заживления повреждений роговицы, содержащие пептид с аминокислотной последовательностью, представленной Ser-Ser-Ser-Arg, или его фармацевтически приемлемую соль и пептид с аминокислотной последовательностью, представленной Phe-Gly-Leu-Met-NH2, или его фармацевтически приемлемую соль, причем:a) соотношение концентраций пептида с аминокислотной последовательностью, представленнойSer-Ser-Ser-Arg, или его фармацевтически приемлемой соли и пептида с аминокислотной последовательностью, представленной Phe-Gly-Leu-Met-NH2, или его фармацевтически приемлемой соли составляет от 1/15 до 1/50;b) концентрация пептида с аминокислотной последовательностью, представленной Ser-Ser-Ser-Arg,или его фармацевтически приемлемой соли составляет от 0,001 до 0,3 мас.%;c) концентрация пептида с аминокислотной последовательностью, представленной Phe-Gly-LeuMet-NH2, или его фармацевтически приемлемой соли составляет от 0,015 до 1,5 мас.%; иd) значение pH глазных капель составляет от 2,5 до 6,5. 2. Стабильные глазные капли для заживления повреждений роговицы, содержащие ацетат пептида с аминокислотной последовательностью, представленной Ser-Ser-Ser-Arg, и гидрохлорид пептида с аминокислотной последовательностью, представленной Phe-Gly-Leu-Met-NH2, причем:a) соотношение концентраций ацетата пептида с аминокислотной последовательностью, представленной Ser-Ser-Ser-Arg, и гидрохлорида пептида с аминокислотной последовательностью, представленной Phe-Gly-Leu-Met-NH2, составляет от 1/15 до 1/20;b) концентрация ацетата пептида с аминокислотной последовательностью, представленной Ser-SerSer-Arg, составляет от 0,005 до 0,1 мас.%;c) концентрация гидрохлорида пептида с аминокислотной последовательностью, представленнойd) значение pH глазных капель составляет от 3,0 до 6,0. 3. Способ стабилизации глазных капель для заживления повреждений роговицы, содержащих пептид с аминокислотной последовательностью, представленной Ser-Ser-Ser-Arg, или его фармацевтически приемлемую соль и пептид с аминокислотной последовательностью, представленной Phe-Gly-Leu-MetNH2, или его фармацевтически приемлемую соль, который включает:a) доведение соотношения концентраций пептида с аминокислотной последовательностью, представленной Ser-Ser-Ser-Arg, или его фармацевтически приемлемой соли и пептида с аминокислотной последовательностью, представленной Phe-Gly-Leu-Met-NH2, или его фармацевтически приемлемой соли в пределах от 1/15 до 1/50;b) доведение концентрации пептида с аминокислотной последовательностью, представленной SerSer-Ser-Arg, или его фармацевтически приемлемой соли в пределах от 0,001 до 0,3 мас.%;c) доведение концентрации пептида с аминокислотной последовательностью, представленной PheGly-Leu-Met-NH2, или его фармацевтически приемлемой соли в пределах от 0,015 до 1,5 мас.%; иd) доведение pH глазных капель в пределах от 2,5 до 6,5 соответственно. 4. Способ стабилизации глазных капель для заживления повреждений роговицы, содержащих ацетат пептида с аминокислотной последовательностью, представленной Ser-Ser-Ser-Arg, и гидрохлорид пептида с аминокислотной последовательностью, представленной Phe-Gly-Leu-Met-NH2, который включает:a) доведение соотношения концентраций ацетата пептида с аминокислотной последовательностью,представленной Ser-Ser-Ser-Arg, и гидрохлорида пептида с аминокислотной последовательностью, представленной Phe-Gly-Leu-Met-NH2, в пределах от 1/15 до 1/20;b) доведение концентрации ацетата пептида с аминокислотной последовательностью, представленной Ser-Ser-Ser-Arg, в пределах от 0,005 до 0,1 мас.%;c) доведение концентрации гидрохлорида пептида с аминокислотной последовательностью, представленной Phe-Gly-Leu-Met-NH2, в пределах от 0,1 до 1 мас.% и