Защита пенообразованием.

1 Область изобретения Изобретение относится к способам предохранения чувствительных биологически активных растворов и суспензий, эмульсий и дисперсий из, например, ферментов, протеинов, вирусов, сывороток, вакцин, липосом и клеточных суспензий. Существующий уровень техники Долговременное хранение биологически активных веществ создат уникальную проблему из-за того, что биологически активное вещество в силу самой своей природы, возможно,является самым хрупким и наносящим вред окружающей среде материалом на нашей планете. Лишь очень небольшое количество гидратированных веществ являются достаточно устойчивыми, чтобы их можно было изолировать, очищать и хранить при комнатной температуре в виде раствора дольше очень короткого промежутка времени. И коммерчески, и практически хранение биологически активных веществ в сухом виде заключает в себе огромные выгоды. Успешно высушенные реагенты, вещества и ткани имеют сниженный вес и требуют меньше места для хранения, несмотря на увеличенное время хранения. Хранение высушенных веществ при комнатной температуре к тому же эффективно с точки зрения стоимости по сравнению с хранением при низкой температуре и сопутствующими этому расходами. Существующие технологии производства сухих биологически активных веществ, прежде всего, включают в себя высушивание распылением (см. патент США 5565318, направленный на вариант этого способа) и сушку в псевдоожиженном слое, ввиду того, что простое высушивание практически невозможно довести до чего-то похожего на коммерчески полезный уровень. Способы предохранения посредством пониженной температуры, которые могут включать в себя обезвоживание, содержат сублимационную сушку и/или криогенное замораживание. Сублимационная сушка не очень хорошо подходит для предохранения чувствительных биологически активных веществ из-за образования кристаллов льда, приводящего к вызванному холодом низкотемпературному повреждению, и из-за высоких расходов. Среди различных протоколов, в которых биологически активные вещества переводятся в сухую, но вс же обратимую биологически активную форму, частная проблема состоит в том,что процедуры простой воздушной или вакуумной сушки чрезвычайно трудно наращивать. Высушивание является процессом с ограниченной диффузией, так что удаление водной составляющей становится более затруднительным,когда объем превышает примерно 10 мкл, и к тому же чем больше осушаемая подложка, тем тяжелее становится осуществить высушивание в е середине. Время сушки обратно пропорцио 001138 2 нально коэффициенту диффузии воды и пропорционально квадрату размера образца. Обращение к методам высушивания распылением не всегда возможно из-за того, что типичные для некоторых из них высокие температуры могут повредить чувствительные биологически активные вещества. Более того, приготовление высушенных веществ при помощи известных методов высушивания может иногда приводить к плотным, труднорастворимым массам, которые не позволяют правильно обрабатывать их в дальнейшем в коммерческих биологических и фармацевтических приложениях. Поэтому остатся потребность в регулируемом способе предохранения чувствительных биологически активных веществ посредством высушивания. Раскрытие изобретения Для того чтобы удовлетворить эту потребность, настоящее изобретение представляет способ предохранения чувствительных биологических суспензий и растворов путм образования устойчивых пен из высушиваемых жидких веществ в качестве вспомогательного средства при высушивании одного или нескольких биологически активных субстратов в жидкости и в качестве вспомогательного средства при приготовлении легкорастворимого высушенного продукта, пригодного для дальнейшего коммерческого использования. Устойчивые пены образуются путм частичного удаления воды в биологически активном образце для образования вязкой жидкости и путм последующего внесения отогнанной жидкости в вакуум, чтобы заставить ее "кипеть", высушивая далее при температурах значительно ниже 100 градусов Цельсия. Другими словами, к вязким растворам или суспензиям биологически активных веществ прикладывается пониженное давление,заставляющее раствор или суспензию вспениваться во время кипения, а в процессе вспенивания дополнительное удаление воды вызывает окончательное получение устойчивой пены с открытыми или закрытыми порами. Такие пены легко разделяемы путм разрезания, дробления и прочих методов разделения, а само действие пенообразованияулучшает удаление воды путм максимизации поверхности жидкости, доступной для испарения или иного выделения растворителя. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение представляет собой способ предохранения чувствительных биологических дисперсий, суспензий, эмульсий и растворов путм образования устойчивых пен из высушиваемых жидких веществ в качестве вспомогательного средства при высушивании одного или нескольких биологически активных субстратов в жидкости и в качестве вспомогательного средства при приготовлении легко разделяемого высушенного продукта, пригодного для дальнейшего коммерческого использова 3 ния. Устойчивые пены образуются путм частичного удаления воды для образования вязкой жидкости и путм последующего внесения отогнанной жидкости в вакуум, чтобы заставить е"кипеть" в ходе дальнейшего высушивания при температурах существенно ниже 100C. Другими словами, к вязким растворам или суспензиям биологически активных веществ прикладывается пониженное давление, чтобы заставить эти растворы или суспензии образовывать пену во время кипения, а в процессе вспенивания дополнительное удаление растворителя вызывает окончательное получение устойчивой пены с открытыми или закрытыми порами. Такие пены легко разделяются путм разрезания, дробления и прочих методов разделения, а само вспенивающее действие улучшает удаление воды путм максимизации поверхности жидкости, доступной для выпаривания. (В общем случае фракция растворителя в осушаемых веществах будет водной, однако, следует понимать, что настоящий способ может применяться к растворам и суспензиям различных типов, в том числе к тем, которые содержат неводные растворители или смесь таких растворителей). Поскольку оценивается изобретение из сочетания протоколов высушивания посредством кипения с пониженньм давлением, можно видеть, что в своих самых простых выполнениях изобретнное устройство является новой комбинацией вакуумного насоса с температурноуправляемым сушильным устройством. Опциональные признаки такой комбинации включают в себя датчики для измерения температуры и управления потоком тепла, микропроцессоры для расчта других параметров процесса на основании данных, собранных упомянутыми и другими датчиками, и т.д. Такое устройство позволяет реализовать новый двумерный вакуумный и температурный протокол для высушивания. Количество биологических жидкостей, к которым может быть применена эта новация с пенообразованием за счт кипения в вакууме,фактически бесконечно. Буквально любые раствор или суспензия могут обезвоживаться с помощью процедуры кипения в вакууме по изобретению, хотя способ и имеет чткие преимущества (т.е. предотвращение разрушения из-за низких температур высушивания) при предохранении биологически чувствительных веществ. Растворы, содержащие остекловывающие усилители и другие защитные агенты, а также растворители практически любого типа будут лучше высушиваться, когда их подвергнут давлению ниже атмосферного и ценообразованию в процессе кипения. Защитными агентами могут быть, без ограничения, сахара (в том числе, среди прочих, сахароза), углеводы, полисахариды, водорастворимые полимеры, пептиды или протеины, если защитный агент улучшает способность биологически активного вещества 4 выдерживать высушивание и хранение и не влияет на конкретную биологическую активность. В важном выполнении настоящего изобретения процесс пенообразования содержит два шага: (а) интенсивное обезвоживание раствора или дисперсии, содержащих биологически активный агент, путм кипения в вакууме для образования устойчивой неопадающей пены и (б) последующее вторичное высушивание пен до такой степени, что пены являются устойчивыми и не опадают во время хранения. Как отмечалось выше, изобретение обеспечивает регулируемый способ для предохранения чувствительных биологически активных веществ (протеинов, ферментов, сывороток,вакцин, вирусов, липосом и клеточных суспензий) при помощи уникально спроектированного способа высушивания. Используя этот способ,возможно вновь наполнить образцы водой или водными растворами, чтобы вернуть процесс к первоначальной биологической активности. Способ может применяться для предохранения фармакологических, текучих или практически любых других биологически активных продуктов и растворов. В способе по изобретению относительно большие количества биологически активных жидкостей (растворов или суспензий) обезвоживаются путм кипения в вакууме для образования устойчивых пен. Пенообразование является кинетическим процессом и зависит от скорости изменений температуры и вакуума в ходе пенообразования, а также от начальной концентрации и состава раствора или дисперсии, содержащих биологически активную субстанцию. Устойчивость пен может быть дополнительно улучшена добавлением поверхностно-активных веществ или других синтетических или биологических полимеров, если эти добавки не влияют на биологическую активность раствора,предназначенного для преобразования в сухую форму. Вторичное высушивание и опционное охлаждение образованных и первоначально высушенных пен может производиться для обеспечения устойчивости пены во время хранения. Для преобразования вспененного материала в стекловидное состояние может использоваться охлаждение. Пены, приготовленные в соответствии с настоящим изобретением, могут храниться целиком либо разделнными или раздробленными, и когда их надо использовать,необходимо лишь заново добавить воды для восстановления их первоначальной биологической активности. Следующие примеры являются иллюстративными. Пример 1. 50%-ный водный раствор изоцитратдегидрогеназы глицерина компанииSigma Chemical Co., содержащий 59,4 единиц активности на мл, подвергался диализу в течение 5 ч в 0,1 моль буфера TRIS HCl (рН = 7,4). 5 Активность изоцитратдегидрогеназы в растворе 0,1 моль TRIS HCl после диализа была равна 261,8 единиц на мл. Уменьшение активности было связано с уменьшением концентрации фермента из-за разбавления в ходе диализа. Сто (100) мкл смеси, содержащей 50 мкл 50% по весу раствора сахарозы и 50 мкл суспензии изоцитратдегидрогеназы в 0,1 моль буфераTRIS HCl (рН = 7,4) помещались в пластиковые трубки по 1,5 мл и предохранялись путм высушивания при комнатной температуре. Вопервых, образцы высушивались 4 ч при низком вакууме (гидростатическое давление = 0,2 атм). Во-вторых, образцы кипятились в течение 4 ч при высоком вакууме (Р 0,01 атм.). На этом шаге в трубках формировалась устойчивая сухая пена. В-третьих, образцы в течение 8 дней хранились на DRIERITE под вакуумом при комнатной температуре. По прошествии нескольких дней хранения образцы были заново залиты 500 мкл воды. Увлажнение образцов, содержащих сухие пены,было лгким процессом, выполняемым за несколько секунд. Восстановленный образец испытывался на активность путм проверки способности уменьшения НАДФ, измеренного спектрофотометрически на 340 нм. Реакционная смесь состояла из 2 мл 0,1-молярного буфераMnSO4; 10 мкл 50-миллимолярного 1 изоцитрата и 10 мкл раствора изоцитратдегидрогеназы. Активность была равна 2,60,2 единиц/мл. Это означает, что не было потери активности в ходе высушивания и последующего хранения при комнатной температуре. Пример 2. Сто (100) мкл смеси, содержащей 50 мкл 50%-ного по весу раствора сахарозы и 50 мкл суспензии образующих ледяные ядра бактерий, поставляемой Genencor International,Inc., были помещены в пластиковые трубки по 1,5 мл и предохранялись путм высушивания при комнатной температуре. Во-первых, образцы высушивались 4 ч при низком вакууме (гидростатическое давление Р = 0,2 атм). Во-вторых,образцы кипятились в течение 4 ч при высоком вакууме (Р 0,01 атм.). После кипения при вакууме в трубках формировалась устойчивая сухая пена. В-третьих, образцы хранились в течение 8 дней на DRIERITE при вакууме при комнатной температуре. После 8 дней хранения образцы были заново увлажнены с помощью 500 мкл воды. Увлажнение образцов, содержащих сухие пены, было лгким процессом, занимавшим несколько секунд. Затем образцы испытывались на активность образования ледяных ядер по сравнению с контрольными образцами. Мы обнаружили, что не было существенной разницы между активностью образования ледяных ядер на 1000 бактерий в образцах, предохраненных с помощью настоящего способа, и контрольных образцах. 6 Хотя изобретение описано выше со ссылкой на частные выполнения и подробности,данное изобретение должно ограничиваться только так, как установлено в прилагаемой формуле изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ предохранения биологически активных веществ от разрушения путм воздействия на раствор, дисперсию или суспензию, содержащие биологически активный агент, вакуумом, соответствующим остаточному гидростатическому давлению ниже 24 Торр, достаточным, чтобы заставить упомянутые раствор,дисперсию или суспензию кипеть с получением в процессе кипения механически устойчивой пены. 2. Способ по п.1, в котором упомянутое гидростатическое давление находится в диапазоне между 0 и 7,6 Торр. 3. Способ по п.1, в котором перед воздействием на упомянутые раствор, дисперсию или суспензию вакуумом упомянутые раствор, дисперсия или суспензия обезвоживается или концентрируется путм выпаривания из жидкого состояния при низком вакууме, соответствующем остаточному гидростатическому давлению выше 7,6 Торр, или путм выпаривания из частично замороженного состояния, или путм концентрации посредством обратного осмоса,или других мембранных технологий, для снижения времени, в течение которого должен применяться упомянутый высокий вакуум, и для увеличения вязкости упомянутых раствора,дисперсии или суспензии перед кипением при высоком вакууме. 4. Способ по п.1, в котором вторичный процесс высушивания выполняется путм приложения либо вакуума, либо сухого воздуха к упомянутой устойчивой пене при повышенной температуре. 5. Способ по п.4, в котором после процедуры вторичного высушивания пена охлаждается до температуры, которая ниже температуры перехода в стекловидное состояние высушенной пены. 6. Способ по п.5, в котором к упомянутым раствору, дисперсии или суспензии добавляется поверхностно-активное вещество до приложения упомянутого вакуума, для улучшения устойчивости пены в процессе вторичного высушивания. 7. Способ по п.6, в котором упомянутые раствор, дисперсия или суспензия содержат защитное вещество, выбираемое из группы, состоящей из сахара, углеводов, полисахаридов,полимеров, пептидов, протеинов и их смеси,причм упомянутое защитное вещество улучшает способность биологически активного материала переносить высушивание и хранение. 8. Способ по п.1, в котором упомянутый процесс дополнительно содержит шаг повторного увлажнения упомянутой устойчивой пены путм контактирования упомянутой пены с подходящим растворителем. 9. Способ по п.8, в котором упомянутое повторное увлажнение выполняется при температуре более высокой, чем температура, при которой пена хранилась до повторного увлажнения. 10. Способ по п.9, в котором температура,при которой пена хранилась до повторного увлажнения, равна, по меньшей мере, комнатной температуре. 8 11. Способ по п.8, в котором упомянутое повторное увлажнение выполняется при температуре, которая равна или ниже температуры,при которой пена хранилась до повторного увлажнения. 12. Способ по п.8, в котором температура,при которой пена хранилась до повторного увлажнения, ниже или равна комнатной температуре. 13. Способ по п.8, в котором упомянутым растворителем является водный раствор, содержащий криозащитное вещество. 14. Способ по п.7, в котором упомянутым сахаром является сахароза.