Способ стабилизации реагента для амплификации или детекции нуклеиновой кислоты и способ хранения

006679 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к способу стабилизации и хранения реагента для способа модификации и/или детекции нуклеиновой кислоты-мишени, полезного в области генной инженерии и клинической медицины. Уровень техники Синтез ДНК используют в исследованиях в области генной инженерии для различных целей. Большинство синтезов ДНК, за исключением синтеза короткоцепочечной ДНК (например, олигонуклеотида),осуществляют с использованием ферментативного способа, при котором используют ДНК-полимеразу. Примером такого способа является способ полимеразной цепной реакции (ПЦР, PCR), подробно описанный в патентах США 4683195, 4683202 и 4800159. Другим примером является способ ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР, RT-PCR), описанный в Trends in Biotechnology, 10:146-152 (1992). С другой стороны, можно использовать способ лигазной цепной реакции (ЛЦР, LCR), описанный в ЕР 320308, или способ с системой амплификации на основе транскрипции (TAS), описанный в PCRProtocols, Academic Press Inc., 1990, pp. 245-252. В указанных выше четырех способах требуется несколько раз повторить реакцию при высокой температуре и при низкой температуре для того, чтобы получить одноцепочечную молекулу-мишень для последующего цикла амплификации. Систему реакций следует проводить с использованием непрерывных фаз или циклов, поскольку реакция ограничивается температурами, как описано выше. Таким образом, в таких способах требуется использование дорогостоящих термоячеек, в которых можно в широком интервале точно регулировать температуры во времени. Кроме того, при реакции требуется время для достижения двух или трех предварительно установленных температур. Потеря времени возрастает пропорционально числу циклов. Для того чтобы решить проблемы, разрабатываются способы амплификации нуклеиновых кислот,которые можно осуществить изотермически. Их примерами являются способ амплификации с замещением цепи (SDA), описанный в JP-B 7-114718, способ самоподдерживающейся репликации последовательности (3SR), способ амплификации на основе нуклеотидной последовательности (NASBA), описанный в патенте Японии 2650159, способ амплификации, опосредованной транскрипцией (ТМА), способ с Qрепликазой, описанный в патенте Японии 2710159, и различные способы модифицированной SDA,описанные в патенте США 5825517, WO 99/09211, WO 95/25180 и WO 99/49081. Способ изотермического ферментативного синтеза описывается в патенте США 5916777. Достраивание с праймера и/или отжиг праймера к одноцепочечному продукту достраивания (или к исходной последовательности-мишени) с последующим достраиванием с праймера при реакции в таком способе изотермической амплификации нуклеиновых кислот или синтезе олигонуклеотидов происходят параллельно в реакционной смеси,инкубированной при постоянной температуре. Среди способов изотермической амплификации нуклеиновых кислот способ SDA является примером системы, в которой в конечном счете аплифицируется ДНК. Способ SDA представляет собой способ амплификации нуклеотидной последовательности-мишени (и комплементарной ей цепи) в образце путем замещения двух цепочек с использованием ДНК-полимеразы и рестриктазы. Для способа требуется четыре праймера, используемых для амплификации, два из которых должны быть сконструированы таким образом, чтобы они содержали сайт узнавания для рестриктазы. Способ требует для синтеза ДНК в больших количествах применения в качестве субстрата модифицированного дезоксирибонуклеотидтрифосфата. Примером модифицированного дезоксирибонуклеотидтрифосфата является (-S)дезоксирибонуклеотидтрифосфат, в котором атом кислорода в фосфатной группе в -положении заменен атомом серы (S). Проблема меняющейся стоимости, связанная с применением модифицированного дезоксирибонуклеотидтрифосфата, становится серьезной, если взаимодействие проводят традиционным способом, например, в случае генетического испытания. Кроме того, введение в таком способе модифицированного нуклеотида (например, (-S)-дезоксирибонуклеотида) в амплифицированный фрагмент ДНК может лишить амплифицированный фрагмент ДНК способности к расщеплению рестриктазой, например, когда его подвергают анализу на полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ, RFLP). Модифицированный способ SDA, описанный в патенте США 5824517, представляет собой способ амплификации ДНК, в котором используют химерный праймер, состоящий из РНК и ДНК и содержащий в качестве обязательного элемента структуру, в которой ДНК располагается, по меньшей мере, в 3'-конце. Модифицированный способ SDA, описанный в WO 99/09211, требует применения рестрикционного фермента, который генерирует 3'-выступающий конец. Модифицированный способ SDA, описанный в WO 95/25180, требует применения по меньшей мере двух пар праймеров. Модифицированный способ SDA, описанный в WO 99/49081, требует применения по меньшей мере двух пар праймеров и по меньшей мере одного модифицированного дезоксирибонуклеотидтрифосфата. С другой стороны, способ синтеза олигонуклеотидов, описанный в патенте США 5916777, включает синтез ДНК с использованием праймера, содержащего рибонуклеотид в 3'-конце, завершение реакции с использованием праймера, введение ника между праймером и достраиваемой цепью в цепи, достраиваемой с праймера с помощью эндонуклеазы, для отделения их друг от друга, расщепление матрицы и извлечение праймера для его повторного использования. Необходимо выделить праймер из реакционной смеси и затем снова от-1 006679 жечь его к матрице для того, чтобы праймер использовать в способе повторно. Кроме того, для способа изотермической амплификации при посредничестве петли (LAMP), описанного в WO 00/28082, требуется четыре праймера для амплификации, и продукты, амплифицированные с использованием такого способа, представляют собой ДНК разного размера, в которых повторяются области-мишени. Кроме того, известен способ изотермической амплификации нуклеиновых кислот с использованием химерного олигонуклеотидного праймера - способ изотермической и инициируемой химерным праймером амплификации нуклеиновых кислот (ICAN), описанный в WO 00/56877 или WO 02/7139. Так как многие реагенты для реакции, используемые в вышеуказанных способах, неустойчивы при комнатной температуре, реагенты в операциях в большинстве случаев используют при охлаждении льдом. Кроме того, так как большинство реагентов следует хранить при температуре 4 С или ниже или при -20 С или ниже, необходимо уделять серьезное внимание способам хранения. Таким образом, нужен способ стабилизации и/или хранения реагента, который допускает стабильное длительное хранение при комнатной температуре при отсутствии при хранении потребности в холодильнике или морозильнике. Цели изобретения Основной целью настоящего изобретения является способ стабилизации и длительного хранения реагента для реакции в способе амплификации нуклеиновой кислоты-мишени, посредством которого нуклеиновую кислоту-мишень в образце специфически амплифицируют с высокой чувствительностью с использованием химерного олигонуклеотидного праймера, а также высокочувствительного способа детекции патогенного микроорганизма или вируса. Сущность изобретения В результате интенсивных исследований авторы настоящего изобретения нашли высокочувствительный способ детекции вируса или патогенного микроорганизма, при котором участок ДНК, представляющий интерес, амплифицируют в присутствии химерного олигонуклеотидного праймера, эндонуклеазы и ДНК-полимеразы. Авторы настоящего изобретения также нашли способ стабилизации и длительного хранения реагента для способа амплификации участка ДНК, представляющего интерес. Таким образом, осуществлено настоящее изобретение. Первый аспект настоящего изобретения относится к способу стабилизации реагента для реакции,используемого для способа амплификации и/или детекции нуклеиновой кислоты-мишени, включающему(а) получение реакционной смеси путем смешивания нуклеиновой кислоты в качестве матрицы, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, по меньшей мере одного праймера и РНКазы Н, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер,который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один элемент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается в 3'конце или со стороны 3'-конца праймера; и(b) амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени путем инкубации реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции,где (i) по меньшей мере один компонент реагента, выбранный из группы, состоящей из магниевой соли, химерного олигонуклеотидного праймера и ферментов (ДНК-полимеразы и/или РНКазы Н), перед реакцией отделяют от других компонентов реагента; и(ii) концентрация(и) фермента(ов) в растворе реагента, содержащем фермент(ы), высокая(ие), в то время как концентрация соли в указанном растворе не является высокой, и концентрацию соли в другом растворе реагента регулируют таким образом, что оптимальная концентрация соли для стадии амплификации достигается после смешивания отдельных растворов реагента друг с другом. Согласно первому аспекту реагент для реакции может состоять из двух растворов реагента: раствора реагента, содержащего химерный олигонуклеотидный праймер; и раствора реагента, содержащего фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н), и можно использовать магниевую соль. Концентрация соли в растворе реагента, содержащем фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н), может быть равна или меньше оптимальной концентрации соли для стадии амплификации. Концентрация(и) фермента(ов) в растворе реагента, содержащем фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н), может быть выше концентрации(ий) фермента(ов) для стадии амплификации. Концентрацию(и) фермента(ов) в растворе реагента, содержащем фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н), можно отрегулировать так, что оптимальная концентрация(и) фермента(ов) для стадии амплификации достигается(ются) после смешивания отдельных растворов реагента друг с другом. Второй аспект настоящего изобретения относится к набору реагента для реакции, используемому в способе амплификации и/или детекции нуклеиновой кислоты-мишени, включающему(a) получение реакционной смеси путем смешивания нуклеиновой кислоты в качестве матрицы, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, по меньшей мере одного праймера и РНКазы Н, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер,который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один элемент, выбранный из группы, со-2 006679 стоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается в 3'конце или со стороны 3'-конца праймера; и(b) амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени путем инкубации реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции,где (i) по меньшей мере один компонент реагента, выбранный из группы, состоящей из магниевой соли, химерного олигонуклеотидного праймера и ферментов (ДНК-полимеразы и/или РНКазы Н), перед реакцией отделяют от других компонентов реагента; и(ii) концентрация(и) фермента(ов) в растворе реагента, содержащем фермент(ы), высокая(ие), в то время как концентрация соли в указанном растворе не является высокой, и концентрацию соли в другом растворе реагента регулируют таким образом, что оптимальная концентрация соли для стадии амплификации достигается после смешивания отдельных растворов реагента друг с другом. Согласно второму аспекту реагент для реакции может состоять из двух растворов реагента: раствора реагента, содержащего химерный олигонуклеотидный праймер; и раствора реагента, содержащего фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н) и магниевую соль. Концентрация соли в растворе реагента, содержащем фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н), может быть равна или меньше оптимальной концентрации соли для стадии амплификации. Концентрация(и) фермента(ов) в растворе реагента, содержащем фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н), может быть выше концентрации(ий) фермента(ов) для стадии амплификации. Концентрацию(и) фермента(ов) в растворе реагента, содержащем фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н), можно отрегулировать так, что оптимальная концентрация(и) фермента(ов) для стадии амплификации достигается(ются) после смешивания отдельных растворов реагента друг с другом. Набор может содержать реагент для регулирования концентрации соли в смеси отдельных растворов реагента. Третий аспект настоящего изобретения относится к способу детекции патогенного микроорганизма и/или вируса в образце, включающему(a) получение реакционной смеси путем смешивания нуклеиновой кислоты в качестве матрицы, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, по меньшей мере одного праймера и РНКазы Н, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер,который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один элемент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается в 3'конце или со стороны 3'-конца праймера;(b) амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени путем инкубации реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции; и(c) детекцию нуклеиновой кислоты-мишени со стадии (b),где химерный олигонуклеотидный праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер для детекции патогенного микроорганизма, представленный приведенной далее общей формулой, и патогенный микроорганизм выбирают из группы, состоящей из Mycobacterium tuberculosis, HCV,chlamydia, Mycobacterium avium complex, gonococcus, HBV, ВИЧ, Staphylococcus aureus, микоплазмы и(a - целое число, равное 11 или большее; b - целое число, равное 1 или большее; с - 0 или целое число,равное 1 или большее; dN - дезоксирибонуклеотид и/или нуклеотидный аналог; N - немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, где некоторые dNs в dNa могут быть заменены Ns и нуклеотид в 3'-конце может быть модифицирован так, что достраивания с 3'-конца под действием ДНК-полимеразы не происходит). Согласно третьему аспекту реакционная смесь также может содержать химерный олигонуклеотидный праймер с последовательностью, по существу, гомологичной нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы. Четвертый аспект настоящего изобретения относится к праймеру для детекции патогенного микроорганизма и/или вируса, причем праймер выбирают из группы, состоящей из(1) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции Mycobacterium tuberculosis, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID(2) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции HCV, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 15,16, 81-86 и 88-91;(3) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции chlamydia, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 17-20,121-127,130-135, 166 и 167;(4) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции Mycobacterium avium complex, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID(5) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции gonococcus, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 38-63, 164 и 165;(6) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции HBV, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 71-78;(7) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции ВИЧ, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 95-103;(8) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции Staphylococcus aureus, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 108-117;(9) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции микоплазмы, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 139-146; и(10) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции MRSA, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 152-155. Пятый аспект настоящего изобретения относится к зонду для детекции патогенного микроорганзма и/или вируса, причем зонд выбирают из группы, состоящей из(1) зонда для детекции Mycobacterium tuberculosis, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 11, 12 и 172;(2) зонда для детекции HCV, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 87 и 92;(3) зонда для детекции chlamydia, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 128, 136 и 168;(4) зонда для детекции Mycobacterium avium complex, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 32 и 33;(5) зонда для детекции gonococcus, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 64-68;(6) зонда для детекции HBV, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 79 и 80;(7) зонда для детекции ВИЧ, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 104 и 105;(8) зонда для детекции Staphylococcus aureus, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 118 и 119;(9) зонда для детекции микоплазмы, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 147-149; и(10) зонда для детекции MRSA, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 156 и 157. Шестой аспект изобретения относится к набору для способа детекции патогенного микроорганизма и/или вируса по третьему аспекту, который содержит химерный олигонуклеотидный праймер по девятому аспекту. Набор по шестому аспекту также может дополнительно содержать зонд по пятому аспекту. Краткое описание чертежей Фиг. 1 представляет собой фигуру, показывающую электрофорез в полиакриламидном геле фрагментов ДНК, амплифицированных согласно способу настоящего изобретения. Фиг. 2 представляет собой графики, показывающие детекцию в реальном времени фрагментов ДНК, амплифицированных согласно способу настоящего изобретения. Фиг. 3 представляет собой фигуру, показывающую электрофорез в полиакриламидном геле, который представляет результаты испытаний на устойчивость при хранении реагентов, используемых в способе настоящего изобретения. Фиг. 4 представляет собой фигуру, показывающую авторадиографию, которая представляет результаты испытаний на устойчивость при хранении реагентов, используемых в способе настоящего изобретения. Фиг. 5 представляет собой фигуру, показывающую электрофорез в полиакриламидном геле, который представляет результаты испытаний на устойчивость при хранении реагентов, используемых в способе настоящего изобретения. Фиг. 6 представляет собой фигуру, показывающую электрофорез в полиакриламидном геле, который представляет результаты испытаний на устойчивость при хранении реагентов, используемых в способе настоящего изобретения. Фиг. 7 представляет собой фигуру, показывающую электрофорез в полиакриламидном геле фрагментов ДНК, амплифицированных согласно способу настоящего изобретения. Подробное описание изобретения Используемый в данном случае дезоксирибонуклеотид (также называемый dN) представляет нуклеотид, в котором углеводная часть состоит из D-2-дезоксирибозы. К дезоксирибонуклеотидам относятся, например, нуклеотиды, содержащие в качестве оснований аденин, цитозин, гуанин или тимин. Кроме того, к дезоксирибонуклеотидам также относится дезоксирибонуклеотид, содержащий модифицирован-4 006679 ное основание, такое как 7-деазагуанозин, и дезоксирибонуклеотидный аналог, такой как дезоксиинозиннуклеотид. Используемый в данном случае рибонуклеотид (также называемый N) представляет нуклеотид, в котором углеводная часть состоит из D-рибозы. К рибонуклеотидам относятся, например, нуклеотиды,содержащие в качестве оснований аденин, цитозин, гуанин или урацил. К рибонуклеотидам также относятся модифицированные рибонуклеотиды, такие как модифицированный рибонуклеотид, в котором атом кислорода фосфатной группы в -положении заменен атомом серы (также называемый (-S)рибонуклеотидом или (-S)-N), или другие производные. Химерные олигонуклеотидные праймеры, используемые в настоящем изобретении, включают любой химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий рибонуклеотид, располагающийся в 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера, который можно использовать для достраивания цепи нуклеиновой кислоты в способе настоящего изобретения, можно расщепить эндонуклеазой и можно использовать для осуществления реакции замещения цепи. В данном случае сторона 3'-конца означает часть от центра к 3'-концу нуклеиновой кислоты, такой как праймер. Подобным образом, сторона 5'-конца означает часть от центра к 5'-концу нуклеиновой кислоты. Химерный олигонуклеотидный праймер представляет собой праймер, содержащий рибонуклеотид,а также по меньшей мере один элемент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога. К таким праймерам также относится олигорибонуклеотидный праймер, содержащий немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид. Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в способе настоящего изобретения, представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, имеющий нуклеотидную последовательность, по существу, комплементарную части нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы. Он может вносить вклад в достраивание цепи ДНК в используемых условиях. Кроме того, рибонуклеотид располагается в 3'-конце или со стороны 3'-конца химерного олигонуклеотидного праймера. Как правило, праймер конструируют таким образом, что он комплементарен части перед амплифицируемым участком, т.е. части 3' к нуклеотидной последовательности, соответствующей амплифицируемому участку в нуклеиновой кислоте как матрице. Используемый в данном описании термин "по существу комплементарная нуклеотидная последовательность" означает нуклеотидную последовательность, которая может отжигаться к ДНК как матрице в используемых условиях реакции. Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в способе настоящего изобретения, может содержать один или несколько модифицированных рибонуклеотидов. Рибонуклеотид может представлять собой немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, который может располагаться в 3'-конце или со стороны 3'-конца химерного олигонуклеотидного праймера и который узнается или расщепляется эндонуклеазой. Рибонуклеотиды включают как немодифицированные рибонуклеотиды, так и модифицированные рибонуклеотиды, как описано выше. Немодифицированный рибонуклеотид, модифицированный рибонуклеотид или их сочетание можно использовать для химерного олигонуклеотидного праймера настоящего изобретения до тех пор, пока они не уничтожают функцию праймера. Примерами модифицированных рибонуклеотидов являются (-S)-рибонуклеотид, в котором атом кислорода, связанный с фосфатной группой, заменен на атом серы, и рибонуклеотид, в котором гидроксигруппа в положении 2 рибозы заменена на метоксигруппу, и другие рибонуклеотиды. Кроме того, химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в способе настоящего изобретения, может содержать нуклеотидный аналог или другие вещества. Иными словами, в химерном олигонуклеотидном праймере настоящего изобретения могут содержаться один или несколько нуклеотидных аналогов до тех пор, пока не уничтожается функция праймера для осуществления реакции достраивания с 3'-конца под действием ДНК-полимеразы. Многие типы нуклеотидных аналогов можно использовать в сочетании. Примерами нуклеотидных аналогов, которые можно использовать, являются дезоксиинозиннуклеотид,дезоксиурацилнуклеотид, дезоксирибонуклеотидный аналог с модифицированным основанием, таким как 7-деазагуанин, нуклеотидный аналог с производным рибозы и т.п., и другие вещества. Кроме того,химерные олигонуклеотиды, используемые в настоящем изобретении, могут содержать дезоксинуклеотиды, рибонуклеотиды или нуклеотидные аналоги с различными модификациями, такими как присоединение меченых соединений, до тех пор, пока они сохраняют функцию, описанную выше. Введение нуклеотидного аналога в праймер эффективно для подавления образования структуры высшего порядка самого праймера и стабилизации индукции отжига к матрице. В праймер можно ввести рибонуклеотид для такой же цели. Хотя и без намерения ограничивать настоящее изобретение, можно,предпочтительно, использовать модифицированный рибонуклеотид, такой как (-S)-рибонуклеотид, для того, чтобы предотвратить расщепление праймера неспецифической эндонуклеазой (РНКазой). Такой химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий модифицированный рибонуклеотид, можно получить с использованием, например, (-S)-рибонуклеотидтрифосфата, полученного способом с использованием реагента для реакции сульфурирования (введение серы) (Glen Research), как описывается в патенте США 5003097, или реагента 2-ОМе-RNА-СЕ-фосфорамидита (Glen Research).-5 006679 Химерный олигонуклеотидный праймер, который можно использовать в способе амплификации настоящего изобретения, можно сконструировать таким, чтобы он содержал модифицированный рибонуклеотид, придающий устойчивость к расщеплению эндонуклеазой. Такой праймер полезен в том отношении, что можно регулировать сайт расщепления эндонуклеазой на стадиях реакции амплификации. Длина химерного олигонуклеотидного праймера, используемого в способе настоящего изобретения,конкретно не ограничивается, но предпочтительно составляет от примерно 12 нуклеотидов до примерно 100 нуклеотидов, предпочтительнее от примерно 15 нуклеотидов до примерно 40 нуклеотидов. Предпочтительно нуклеотидная последовательность химерного олигонуклеотида, по существу, комплементарна нуклеиновой кислоте как матрице, так что она отжигается к нуклеиновой кислоте как матрице в используемых условиях реакции. Праймер содержит последовательность, узнаваемую эндонуклеазой, которая используется на стадии, описываемой ниже, в 3'-конце или со стороны 3'-конца. Например, в способе синтеза ДНК настоящего изобретения в качестве праймера можно использовать олигонуклеотид структуры, представленной далее формулой, хотя он не предназначен для ограничения. Общая формула: 5'-dNa-Nb-dNc-3'(а - целое число, равное 11 или большее; b - целое число, равное 1 или большее; с - 0 или целое число,равное 1 или большее; dN - дезоксирибонуклеотид и/или нуклеотидный аналог; N - немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, где некоторые из dNs в dNa могут быть заменены на Ns и нуклеотид в 3'-конце может быть модифицирован, так что достраивание с 3'-конца под действием ДНК-полимеразы не происходит). Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в настоящем изобретении, имеет структуру,в которой эндонуклеаза узнает или расщепляет цепь ДНК, достроенную с праймера с использованием ДНК-полимеразы (достроенная с праймера цепь), в сайте, содержащем рибонуклеотид, располагающийся в 3'-конце или со стороны 3'-конца химерного олигонуклеотидного праймера. Хотя и без намерения ограничивать настоящее изобретение, например, когда РНКаза Н действует на двухцепочечную ДНК, образовавшуюся путем достраивания ДНК с химерного олигонуклеотидного праймера, представленного приведенной выше общей формулой, отжигаемую к нуклеиновой кислоте как матрице, химерный олигонуклеотидный праймер расщепляется в рибонуклеотидной части. Затем получают двухцепочечную ДНК,в которую вводят ник между олигонуклеотидным праймером и цепью ДНК, синтезируемой путем достраивания. Затем из ник-сайта с помощью ДНК-полимеразы проводят реакцию замещения цепи. Таким образом, в способе настоящего изобретения можно использовать любой химерный олигонуклеотидный праймер, который можно использовать для достраивания цепи нуклеиновой кислоты с 3'-конца праймера, который можно расщепить эндонуклеазой и с которым ДНК-полимераза может осуществить реакцию замещения цепи. Кроме того, к химерным олигонуклеотидным праймерам настоящего изобретения относятся праймеры, чьи 3'-концы модифицированы, так что не может происходить достраивания под действием ДНК-полимеразы, и достраивание ДНК происходит с 3'-конца, образовавшегося после расщепления эндонуклеазой. Кроме того, со стороны 5'-конца химерного олигонуклеотидного праймера может быть включена промоторная последовательность для РНК-полимеразы. Примерами таких РНК-полимераз являются РНК-полимераза Т 7 и РНК-полимераза SP6. Химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий нужную нуклеотидную последовательность,можно синтезировать с использованием, например, синтезатора ДНК типа 394 от Applied Biosystems Inc.(ABI) согласно фосфорамидитному методу. С другой стороны, для синтеза химерного олигонуклеотидного праймера можно использовать любые способы, включая триэфирфосфатный способ, Н-фосфонатный способ и тиофосфонатный способ. Можно использовать фермент, который может действовать на двухцепочечную ДНК, полученную достраиванием ДНК с химерного олигонуклеотидного праймера, описанного выше, который отжигается к нуклеиновой кислоте как матрице, и расщеплять достроенную цепь для осуществления реакции замещения цепи. Иными словами, это фермент, который может генерировать ник в части химерного олигонуклеотидного праймера двухцепочечной ДНК. Примерами эндонуклеаз, которые можно использовать в настоящем изобретении, являются рибонуклеазы и другие нуклеазы. Из них можно использовать предпочтительно эндорибонуклеазу Н (РНКазу Н), которая действует на РНК-часть двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из ДНК и РНК. Любую рибонуклеазу, обладающую вышеуказанными активностями, можно предпочтительно использовать в настоящем изобретении, включая мезофильные и теплоустойчивые рибонуклеазы. Например, РНКазу Н из Е. coli можно использовать в способе настоящего изобретения для реакции при примерно 50-70 С, как описывается ниже в примерах. В способе настоящего изобретения можно использовать, предпочтительно, теплоустойчивую рибонуклеазу. Примерами теплоустойчивых рибонуклеаз, которые можно предпочтительно использовать, являются коммерчески доступные рибонуклеаза теплоустойчивая РНКаза Н Hybridase (Epicenter Technologies), а также РНКаза Н из термофильной бактерии рода Bacillus, бактерии рода Thermus, бактерии рода Pyrococcus, бактерии рода Thermotoga, бактерии рода Archaeoglobus, бактерии рода Methanococcus, бактерии рода Thermococcus-6 006679 или подобной бактерии и другие рибонуклеазы. Кроме того, можно предпочтительно использовать как рибонуклеазы, встречающиеся в природе, так и другие рибонуклеазы. Конкретных ограничений для РНКазы Н не существует до тех пор, пока ее можно использовать в способе настоящего изобретения. Например, РНКаза Н может происходить от разных вирусов, фагов,прокариот или эукариот. Она может представлять собой или клеточную РНКазу Н, или вирусную РНКазу Н. Примером клеточной РНКазы Н является РНКаза HI из Escherichia coli, и примером вирусной РНКазы Н является РНКаза ВИЧ-1. В способе настоящего изобретения можно использовать РНКазу Н типа I, типа II или типа III. Например, предпочтительно без ограничений можно использовать РНКазу HI из Escherichia coli или РНКазу HII из бактерии рода Pyrococcus, бактерии рода Archaeoglobus или бактерии рода Thermococcus. Эффективность реакции расщепления эндонуклеазой, такой как РНКаза Н, используемая в способе настоящего изобретения, может изменяться в зависимости от нуклеотидной последовательности вблизи 3'-конца праймера и влияния на эффективность амплификации нужной ДНК. Поэтому обычно конструируют праймер, оптимальный для используемой РНКазы Н. Используемый в данном описании термин "введение ника" или "никирование" означает расщепление в пределах одной из двух цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Например, РНКаза Н действует на гибридную двухцепочечную нуклеиновую кислоту, состоящую из ДНК и рибонуклеотидсодержащей ДНК, селективно расщепляя из двух цепей рибонуклеотидсодержащую цепь в рибонуклеотидной части, посредством чего в гибридную двухцепочечную нуклеиновую кислоту вводится ник. Известно, что некоторые ДНК-полимеразы в определенных условиях обладают эндонуклеазной активностью, такой как активность РНКазы Н. Такую ДНК-полимеразу можно использовать в способе настоящего изобретения. В одном аспекте ДНК-полимеразу можно использовать в условиях, допускающих проявление активности РНКазы Н, например, в присутствии Mn2+. В таком случае способ настоящего изобретения можно осуществлять без добавления РНКазы Н. ДНК-полимераза Вса может обнаруживать РНКазную активность в буфере, содержащем Мn2+. Вышеуказанный аспект не ограничивается применением ДНК-полимеразы Вса. В настоящем изобретении можно использовать ДНК-полимеразы, о которых известно, что они обладают активностью РНКазы Н, такие как ДНК-полимераза Tth из Thermus thermophilus. Таким образом, ДНК-полимеразу, обладающую активностью РНКазы Н, можно использовать в условиях, в которых проявляется активность РНКазы Н. В качестве нуклеотидтрифосфатов, служащих в способе в качестве субстратов при реакции достраивания, можно использовать предпочтительно dNTPs, используемые для ПЦР, или подобные dNTPs(смесь dATP, dCTP, dGTP и dTTP). Кроме того, в качестве субстрата можно использовать dUTP. dNTPs могут содержать аналог dNTP (дезоксирибонуклеотидтрифосфата), такой как 7-дeaзa-dGTP, трифосфатdITP или подобное вещество, до тех пор, пока оно служит в качестве субстрата для используемой ДНКполимеразы. Можно использовать производное dNTP или аналог dNTP. Может содержаться производное с функциональной группой, такое как dUTP, содержащий аминогруппу. В способе используют химерный олигонуклеотидный праймер. Праймер можно получить, например, с использованием синтезатора ДНК согласно обычному способу синтеза. В способе настоящего изобретения можно использовать сочетание химерного олигонуклеотидного праймера и обычного олигонуклеотидного праймера. Если активность используемого фермента может снижаться в ходе реакции, в способе настоящего изобретения фермент можно добавлять в ходе реакции. Например, без намерения ограничивать настоящее изобретение, во время реакции, в которой используют РНКазу Н, можно дополнительно добавлять РНКазу Н из Escherichia coli. Добавляемый фермент может быть таким же, какой содержится в реакционной смеси в начале реакции, или он может быть другим ферментом, проявляющим такую же активность. Таким образом, тип или свойство добавляемого фермента не ограничивается одним конкретным ферментом до тех пор, пока добавление во время реакции производит действие, такое как повышение чувствительности при детекции или повышение количества амплифицированного продукта. Используемая в данном случае ДНК-полимераза относится к ферменту, синтезирующему цепь ДНКde novo с использованием цепи ДНК как матрицы. К ДНК-полимеразам относятся ДНК-полимеразы,встречающиеся в природе, и другие ферменты с вышеуказанной активностью. Например, к таким ферментам относится ДНК-полимераза с активностью замещения цепи, ДНК-полимераза, утратившая 5'3'экзонуклеазную активность, и ДНК-полимераза с обратнотранскриптазной активностью или эндонуклеазной активностью. Используемый в данном описании термин "активность замещения цепи" относится к активности,которая может влиять на замещение цепи, т.е. которая может производить дупликацию ДНК на базе последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы, в то же время заменяя цепь ДНК, с высвобождением комплементарной цепи, отожженной к цепи матрицы. Кроме того, цепь ДНК, высвобожденная из нуклеиновой кислоты как матрицы в результате замещения цепи, в данном описании относится к "замещенной цепи". Можно использовать ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи в ДНК. В частности, можно предпочтительно использовать ДНК-полимеразу, по существу, лишенную 5'3'-экзонуклеазной активности.-7 006679 В настоящем изобретении можно использовать любую ДНК-полимеразу, обладающую активностью замещения цепи. Ее примерами являются варианты ДНК-полимераз, лишенные их 5'3'-экзонуклеазной активности, полученные из термофильных бактерий рода Bacillus, таких как Bacillus caldotenax (далее называемые В. са), и Bacillus stearothermophilus (далее называемые В. st), а также большой фрагмент(фрагмент Кленова) ДНК-полимеразы I из Escherichia coli (E. coli). Как мезофильные, так и теплоустойчивые ДНК-полимеразы можно предпочтительно использовать в настоящем изобретении. В. са представляет собой термофильную бактерию с оптимальной температурой роста примерно 70 С. Известно, что ДНК-полимераза Вса из такой бактерии обладает ДНК-зависимой ДНКполимеразной активностью, РНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью (обратнотранскриптазной активностью), 5'3'-экзонуклеазной активностью и 3'5'-экзонуклеазной активностью. Фермент может представлять собой или фермент, выделенный в чистом виде из источника своего происхождения, или рекомбинантный белок, полученный с использованием методов генной инженерии. Фермент можно подвергнуть модификации, такой как замещение, делеция, присоединение или вставка, используя методы генной инженерии или другие способы. Примером таких ферментов является ДНК-полимераза BcaBEST(Takara Shuzo), представляющая собой ДНК-полимеразу Вса, лишенную ее 5'3'-экзонуклеазной активности. Нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК), используемую по настоящему изобретению в качестве матрицы, можно получить или выделить из любого образца, который может содержать нуклеиновую кислоту. С другой стороны, согласно настоящему изобретению при реакции амплификации нуклеиновой кислоты можно использовать непосредственно образец. Примерами образцов, которые могут содержать нуклеиновую кислоту, являются, но не ограничиваются перечисленным, образцы, полученные от организмов, такие как цельная кровь, сыворотка, лейкоцитная пленка, урина, фекалии, цереброспинальная жидкость, семенная жидкость, слюна, ткань (например, раковая ткань или ткань лимфоузлов) и клеточная культура (например, культура клеток млекопитающего или культура бактериальных клеток), образцы, содержащие нуклеиновую кислоту, такие как вироид, вирус, бактерия, гриб, дрожжи, растение или животное, образцы, загрязненные или инфицированные, как предполагается, микроорганизмами, такими как вирусы или бактерии (например, пища или биологическая композиция), и образцы, которые могут содержать микроорганизмы, такие как почва или сточные воды. Образец может представлять собой препарат, содержащий нуклеиновую кислоту, полученную переработкой вышеуказанных образцов согласно известным способам. Примерами препаратов, которые можно использовать в настоящем изобретении,являются продукт разрушения клеток или образец, полученный путем фракционирования такого продукта, нуклеиновая кислота в образце или образец, в котором в большом количестве содержатся молекулы определенной нуклеиновой кислоты, такой как мРНК. Кроме того, можно использовать, предпочтительно, нуклеиновую кислоту, такую как ДНК или РНК, полученную амплификацией нуклеиновой кислоты,содержащейся в образце. Препарат, содержащий нуклеиновую кислоту, можно получить из указанных выше материалов с использованием, например, лизиса с помощью детергента, ультразвука, встряхивания/перемешивания с использованием стеклянных шариков или пресса Френча, без огранчений. В некоторых случаях выгодно дополнительно обработать препарат для очистки полученной нуклеиновой кислоты (например, в случае,когда присутствует эндонуклеаза). В таких случаях нуклеиновую кислоту очищают с использованием известного способа, такого как фенольная экстракция, хроматография, ионный обмен, гель-электрофорез или центрифугирование в градиенте плотности. Когда нужно амплифицировать нуклеиновую кислоту с последовательностью, полученной от РНК,способ настоящего изобретения можно осуществлять с использованием в качестве матрицы кДНК, синтезированной с использованием обратнотранскриптазной реакции, в которой в качестве матрицы используют РНК. В способе настоящего изобретения можно использовать любую РНК, для которой можно создать праймер, используемый в обратнотранскриптазной реакции, включая полную РНК в образце, молекулы РНК, такие как мРНК, тРНК и рРНК, а также определенные РНК-молекулярные препараты. В качестве матричной нуклеиновой кислоты в настоящем изобретении можно использовать двухцепочечную ДНК, такую как геномная ДНК, выделенная так, как описано выше, или фрагмент ПЦР, одноцепочечную ДНК, такую как кДНК, полученная с использованием обратнотранскриптазной реакции из полной РНК или мРНК, и гибридную двойную цепь, состоящую из ДНК и РНК. Двухцепочечную ДНК можно предпочтительно использовать после ее денатурации в одноцепочечные ДНК или без такой денатурации. Далее настоящее изобретение будет описываться подробнее.(1) Способ стабилизации и длительного хранения реагента для реакции для способа амплификации или детекции нуклеиновой кислоты-мишени настоящего изобретения. Реагент для реакции согласно настоящему изобретению можно использовать для способа амплификации или детекции нуклеиновой кислоты-мишени с использованием по меньшей мере одного химерного олигонуклеотидного праймера, эндонуклеазы и ДНК-полимеразы. Реагент для реакции настоящего изобретения можно использовать для способа амплификации нуклеиновой кислоты-мишени, который можно осуществить с использованием двух праймеров, т.е. химер-8 006679 ного олигонуклеотидного праймера, комплементарного нуклеиновой кислоте как матрице, и другого химерного олигонуклеотидного праймера, комплементарного замещенной цепи. Один праймер связывается с цепью ДНК как матрицы, вызывая реакцию замещения цепи, в то время как другой праймер связывается с замещенной цепью, высвобождаемой в результате реакции замещения цепи, инициируя другую реакцию замещения цепи. Ясно, что продукт реакции с одним праймером может функционировать как матрица для другого праймера, если используется такой аспект. Таким образом, количество продукта амплификации нелинейно возрастет с возрастанием количества матрицы. Реагент для реакции в способе настоящего изобретения, в котором используют двухцепочечную ДНК как матрицу и два химерных олигонуклеотидных праймера, является примером другого аспекта. В таком способе, хотя имеются изменения в зависимости от условий реакции, переключение матриц в промежуточных цепях, достраиваемых с матрицы, может происходить во время реакций достраивания с праймеров с образованием двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймера цепей, отжигающихся одна с другой. Двухцепочечная нуклеиновая кислота содержит химерные олигонуклеотидные праймеры на обоих концах. Затем можно снова инициировать реакции достраивания комплементарных цепей, включая замещение цепи, с обоих концов. В результате реакций получают продукт амплификации с последовательностью праймера на одном конце. Кроме того,если переключение матриц происходит во время реакций, снова получают двухцепочечную нуклеиновую кислоту, подобную кислоте, описанной выше. Реагент для реакции настоящего изобретения можно использовать в способе амплификации нуклеиновой кислоты, который включает стадию использования ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи для осуществления реакции переключения матрицы. При реакции переключения матрицы в присутствии двухцепочечной нуклеиновой кислоты как матрицы, двух химерных олигонуклеотидных праймеров, по существу, комплементарных нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей, и ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи синтезируются две достроенные с праймеров цепи,комплементарные матрице. Переключение матрицы каждой из достраиваемых с праймеров цепей с матрицы на другую достраиваемую с праймера цепь происходит во время синтеза достраиваемых с праймеров цепей. В данном случае реакция переключения матрицы относится к реакции, при которой, когда комплементарные цепи синтезируются реакциями замещения цепи с обеих сторон двухцепочечной нуклеиновой кислоты, ДНК-полимераза переключает матрицу и затем синтезирует комплементарную цепь с использованием в качестве матрицы другой комплементарной цепи, синтезированной вновь с помощью другой ДНК-полимеразы. Иными словами, реакция переключения матрицы относится к реакции, при которой двухцепочечную нуклеиновую кислоту как матрицу обрабатывают праймерами и ДНК-полимеразой с активностью замещения цепи с образованием достроенных цепей, комплементарных матрице, где ДНКполимераза, которая синтезирует достроенные с примеров цепи, во время синтеза достраиваемых цепей активно переключает матрицу от исходных матриц на другие достраиваемые с праймеров цепи. Способность ДНК-полимеразы осуществлять реакцию переключения матрицы можно определить, например,согласно способу, описанному ниже в ссылочном примере 3, хотя такой способ не предназначен для ограничения настоящего изобретения. ДНК-полимеразу, способную осуществлять реакцию переключения матрицы во время реакции замещения цепи, можно предпочтительно использовать для настоящего изобретения. Например, предпочтительно использовать, в частности, фермент ДНК-полимеразу Вса, лишенную 5'3'-экзонуклеазной активности. Такой фермент коммерчески доступен как ДНК-полимераза BcaBEST (Takara Shuzo). Ее также можно получить из Escherichia coli HB101/pU1205 (FERM BP-3720), которая содержит ген для фермента, согласно способу, описанному в патенте Японии 2978001. В способе амплификации нуклеиновой кислоты-мишени с использованием реагента для реакции настоящего изобретения может образоваться полимер, в котором амплифицируемые участки соединены друг с другом. Полимер имеет структуру, в которой множество амплифицируемых участков повторяется в одном и том же направлении. Полимеры обнаруживают при анализе продуктов амплификации методом электрофореза в виде мультимерных полос. Полагают, что на образование таких полимеров влияет амплифицируемый участок, размер участка, фланкирующие области, нуклеотидная последовательность используемого химерного олигонуклеотидного праймера, условия реакции и т.п. Полимер, описанный выше, содержит множество амплифицируемых участков. Например, полимер полезен, когда производится детекция нуклеиновой кислоты, содержащей амплифицируемый участок,поскольку он гибридизируется с рядом зондов после гибридизации с использованием соответствующего зонда и образует интенсивный сигнал. Амплифицируемый участок или его часть можно получить из полимера в виде мономера с использованием расщепления рестриктазой или подобным ферментом в сочетании. Одной из особенностей способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения является то, что способ не требует повышения и понижения температуры во время синтеза нуклеиновой кислоты. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу изотермического синтеза нуклеиновой кислоты. Во многих известных способах амплификации нуклеиновых кислот требуется повышение и понижение температуры для отделения мишени от синтезированной цепи. Такие способы для ука-9 006679 занной цели требуют специального обрудования для реакции, такого как термоячейка. Однако способ настоящего изобретения можно проводить с использованием только оборудования, позволяющего поддерживать постоянную температуру. Как описано выше, способ настоящего изобретения можно осуществлять при одной температуре. Предпочтительно его осуществляют, выбирая температуру реакции и уровень точности такими, чтобы уменьшить неспецифический отжиг праймера, и такими, чтобы праймер специфически отжигался к нуклеиновой кислоте как матрице. Без намерения ограничивать настоящее изобретение способ настоящего изобретения можно осуществить в условиях высокой температуры, используя теплоустойчивый фермент, как описано выше. Кроме того, предпочтительно осуществлять способ настоящего изобретения при температуре, соответствующей достаточному поддержанию активности используемого фермента для того, чтобы сохранить эффективность реакции на высоком уровне. Таким образом, температура реакции составляет предпочтительно от примерно 20 до примерно 80 С, предпочтительнее от примерно 30 до примерно 75 С, наиболее предпочтительно от примерно 50 до примерно 70 С, хотя она изменяется в зависимости от используемого фермента. Когда реакцию проводят, в частности, в высокотемпературных условиях, предпочтительно использовать более длинный праймер, чем в случае реакции при нормальной температуре. Примером влияния, привносимого повышенной температурой реакции, является решение проблемы образования вторичной структуры ДНК как матрицы. Повышенная температура реакции создает возможность амплификации нужной нуклеиновой кислоты даже в том случае, если в качестве матрицы используют нуклеиновую кислоту с высоким содержанием GC. Кроме того, она также эффективна при амплификации участка с большой длиной цепи. Такое действие наблюдают в интервале от примерно 60 п.о. до примерно 20 т.п.о., конкретно от примерно 60 до примерно 1500 п.о. Эффективность амплификации можно повысить путем подбора температуры реакции в соответствии с содержанием GC в нуклеиновой кислоте как матрице. Например, если в качестве матрицы используют нуклеиновую кислоту с низким содержанием GC, реакцию амплификации по настоящему изобретению можно проводить при 50-55 С, хотя температура зависит от длины амплифицируемой цепи и величины Тm праймера. Использование ДНК-полимеразы с обратнотранскриптазной активностью (например, ДНКполимеразы BcaBEST) в способе настоящего изобретения может позволить удобно провести амплификацию нуклеиновой кислоты от РНК, включающую стадию получения кДНК из РНК (обратнотранскриптазная реакция), с использованием только одного фермента. С другой стороны, продукт, полученный путем независимого проведения стадии получения кДНК из РНК (т.е. кДНК), можно использовать в способе настоящего изобретения в качестве ДНК как матрицы. В каждом случае реакцию в способе настоящего изобретения повторяют до обрыва ее подходящим способом, например путем инактивации фермента, или путем снижения температуры реакции, или до тех пор, пока реакционная смесь не лишится одного из субстратов. Способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно использовать для различных экспериментальных процедур, в которых используют амплификацию нуклеиновых кислот,включая детекцию, мечение и секвенирование нуклеиновой кислоты. Кроме того, способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно использовать для способа амплификации нуклеиновой кислоты in situ, способа амплификации нуклеиновой кислоты на твердом субстрате, таком как ДНК-чип, или метода множественной амплификации нуклеиновых кислот, при котором одновременно амплифицируют несколько участков. Эффективность использования праймера в способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения составляет примерно 100%, что может быть в 5-10 раз выше, чем эффективность при обычном способе, таком как ПЦР. Способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно использовать для получения продукта амплификации с высоким соответствием нуклеотидной последовательности матричной нуклеиновой кислоты. Когда определяли частоту ошибок при синтезе ДНК по способу настоящего изобретения путем анализа нуклеотидных последовательностей полученных продуктов амплификации,частота ошибок, найденная в продуктах амплификации, полученных по способу настоящего изобретения, была эквивалента частоте ошибок при LA-PCR, которая, как известно, позволяет амплифицировать нуклеиновую кислоту с высоким соответствием. Иными словами, способ настоящего изобретения имеет соответствие, эквивалентное соответствию при LA-PCR. Способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени настоящего изобретения можно осуществить путем амплификации нуклеиновой кислоты-мишени непосредственно из образца, содержащего нуклеиновую кислоту. В таком случае длина цепи амплифицируемой нуклеиновой кислоты-мишени не ограничивается определенной длиной. Например, для чувствительной детекции нуклеиновой кислоты-мишени эффективен участок в 200 п.о. или короче, предпочтительно в 150 п.п. или короче. Нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить в образце с высокой чувствительностью, конструируя химерные олигонуклеотидные праймеры настоящего изобретения для того, чтобы получить в результате длину амплифицируемой цепи,указанную выше.- 10006679 Кроме того, при способе детекции настоящего изобретения нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить с большей чувствительностью даже в следовом количестве образца нуклеиновой кислоты с использованием буфера для реакции, содержащего в качестве буферирующего компонента бицин, трицин, HEPES, фосфат или трис, и раствора для отжига, содержащего спермидин или пропилендиамин. В таком случае используемые эндонуклеаза и ДНК-полимераза не ограничиваются конкретными веществами. Например, предпочтительно сочетание РНКазы Н из Escerichia coli, бактерии рода Pyrococcus или бактерии рода Archaeoglobus и ДНК-полимеразы BcaBEST. Полагают, что предпочтительные количества эндонуклеазы и ДНК-полимеразы могут изменяться в зависимости от типов ферментов. В таком случае состав буфера и количество добавляемых ферментов можно подобрать с использованием в качестве показателя повышения чувствительности детекции или количества продукта амплификации. В способе детекции настоящего изобретения во время амплификации нуклеиновой кислотымишени в качестве субстрата можно вводить dUTP. Так, если в качестве субстрата используют dUTP, с использованием урацил-N-гликозидазы (UNG) возможно предотвратить ложноположительные результаты из-за распространения загрязнения продуктов амплификации за счет разрушения продуктов амплификации. Для детекции нуклеиновой кислоты-мишени можно использовать известные способы детекции нуклеиновой кислоты. Примерами таких способов являются детекция продукта реакции специфического размера методом электрофореза и детекция путем гибиридизации с зондом. Кроме того, можно использовать предпочтительно способ детекции, при котором используют в сочетании магнитные гранулы. Пирофосфорную кислоту, образовавшуюся на стадии амплификации нуклеиновой кислоты-мишени, можно превратить в нерастворимое вещество, такое как магниевая соль, и затем можно измерить мутность. При детекции методом электрофореза, как правило, используют флуоресцирующее вещество, такое как этидия бромид. Гибридизацию с зондом можно сочетать с детекцией методом электрофореза. Зонд можно пометить радиоизотопом или нерадиоактивным веществом, таким как биотин или флуоресцирующее вещество. Кроме того, использование на стадии детекции меченого олигонуклеотида может облегчить детекцию продукта амплификации, в который включен меченый нуклеотид, или, используя метку, можно усилить сигнал для детекции. Также можно использовать для детекции метод поляризации флуоресценции, метод передачи энергии флуоресценции или подобный метод. Нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить автоматизированным способом или определить количественно, сконструировав подходящую систему детекции. Кроме того, можно использовать предпочтительно детекцию невооруженным глазом с помощью метода гибридной хроматографии. В способе детекции настоящего изобретения можно использовать рибонуклеотидный (РНК) зонд или химерный олигонуклеотидный зонд, состоящий из рибонуклеотида и дезоксирибонуклеотида, меченный двумя или большим числом флуоресцирующих веществ, расположенных на расстоянии, что приводит к состоянию тушения. Зонд не дает флуоресценции. Когда его отжигают к ДНК, амплифицированной от нуклеиновой кислоты-мишени, комплементарной зонду, РНКаза Н расщепляет зонд. Затем повышается расстояние между флуоресцирующими веществами на зонде, что приводит к появлению флуоресценции. Таким образом, испускание показывает присутствие нуклеиновой кислоты-мишени. Если в способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения используют РНКазу Н, нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить только путем добавления зонда в реакционную смесь. Например, в качестве флуоресцирующих веществ для мечения зонда можно предпочтительно использовать сочетание флуоресцирующих веществ 6-карбоксифлуоресцеина (6-FAM) и N,N,N',N'-тетраметил-6 карбоксиродамина (TAMRA), которые составляют пару меток для FRET, или сочетание 6-карбоксифлуоресцеина (6-FAM) и 4-(4'-диметиламинофенилазо)бензойной кислоты (DABCYL), которые составляют пару меток для не-FRET. Настоящее изобретение также относится к зонду, используемому в вышеописанном способе детекции нуклеиновой кислоты-мишени. Зонд настоящего изобретения на ограничивается конкретным зондом до тех пор, пока он в нормальных условиях гибридизации может гибридизироваться с нуклеиновой кислотой-мишенью, амплифицированной с использованием способа амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения. С учетом специфической детекции продукта амплификации предпочтителен зонд, гибридизирующийся в условиях, например, известных специалистам в данной области техники как строгие. Строгие условия гибридизации описываются, например, в Т. Maniatis et al., (eds.). MolecularCloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory. Конкретно, примером строгих условий являются следующие условия: инкубация при температуре примерно на 25 С ниже Тm используемого зонда на протяжении от 4 ч до ночи в 6 х SSC (1 х SSC: 0,15 М NaCl, 0,015 М цитрата натрия, рН 7,0), содержащем 0,5% SDS, 5 х растворе Денхардта (0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA),0,1% поливинилпирролидона, 0,1% фиколла 400) и 100 мкг/мл ДНК спермы лосося. Зонд с меткой, описанной выше, можно использовать в качестве зонда для облегчения детекции нуклеиновой кислотымишени. Способ амплификации нуклеиновой кислоты в изотермических условиях по настоящему изобретению не требует применения обрудования, такого как термоячейка. Число праймеров, используемых в способе амплификации настоящего изобретения, может равняться одному или двум, что меньше, чем- 11006679 число праймеров, используемых в обычном способе. Так как реагенты, такие как dNTPs, используемые для ПЦР и подобных способов, можно применять в способе настоящего изобретения, стоимость работы может быть уменьшена по сравнению с обычным способом. Следовательно, способ настоящего изобретения можно использовать предпочтительно, например, в области генетических испытаний, при которых обычно проводят детекцию. Способ настоящего изобретения дает большее количество продукта амплификации за более короткий промежуток времени, чем ПЦР. Поэтому способ настоящего изобретения можно использовать как удобный, быстрый и чувствительный способ детекции гена. Что касается реагента для реакции для получения реакционной смеси, используемой в способе настоящего изобретения, то соответствующие компоненты, составляющие реакционную смесь, можно хранить отдельно. С другой стороны, для удобства работы можно получить заранее раствор-премикс, в котором смешаны несколько компонентов. В случае такого реагента для реакции предпочтительно получить раствор-премикс, имеющий такой состав, что подавляется реакция, которая может разрушить в растворе основную функцию химерного олигонуклеотидного праймера как праймера с учетом устойчивости реагента. Хотя и без намерения ограничивать настоящее изобретение, раствор-премикс предпочтительно имеет такой состав, который не приводит к полимеризации и/или разрушению химерного олигонуклеотидного праймера. В одном из воплощений способа настоящего изобретения, например, предпочтительно исключить или обратимо инактивировать по меньшей мере один из компонентов раствора-премикса,которые требуются для и участвуют в реакции синтеза нуклеиновой кислоты, используемой в способе настоящего изобретения. Хотя и без намерения ограничивать настоящее изобретение, например, можно исключить или инактивировать по меньшей мере одно из веществ, выбранных из группы, состоящей из ДНК-полимеразы, химерного олигонуклеотидного праймера, магниевой соли и dNTPs. Посредством вышеописанного способа реагент для реакции, используемый в способе настоящего изобретения, можно стабилизировать при любой температуре. Кроме того, для того чтобы подавить инактивацию фермента(ов), фермент(ы) (ДНК-полимеразу и/или РНКазу Н) можно отделить. Таким образом, настоящее изобретение относится к реагенту для реакции, состоящему из двух растворов-премиксов, т.е. одного раствора, содержащего отделенный компонент (отделенные компоненты),и другого раствора, содержащего другие компоненты. Необязательно реагент для реакции может состоять из трех или большего числа растворов-премиксов. Вышеуказанный способ стабилизации можно использовать как способ длительного хранения реагента для реакции, используемого в способе настоящего изобретения. Хотя не существует определенного ограничения, касающегося форм длительного хранения, например, предпочтительно получить реагент для реакций в форме, состоящей из двух частей, т.е. раствора химерного олигонуклеотидного праймера и буфера для реакции, содержащего фермент(ы), магниевую соль и dNTPs. В одном из воплощений способа длительного хранения настоящего изобретения буфер для реакции предпочтительно содержит соль. В данном случае концентрация соли означает концентрацию солей, включая буферирующий компонент,магниевую соль и соль для регулирования ионной силы (например, ацетат калия). Концентрацию содержащейся соли можно отрегулировать подходящим образом в зависимости от типов используемых ДНКполимеразы и РНКазы Н. Предпочтительно, концентрацию соли регулируют таким образом, что она создает ионную силу, которая стабилизирует фермент(ы). В таком случае концентрацию соли можно оптимизировать с использованием способа, описанного в примере 4. Хотя и без намерения ограничивать настоящее изобретение, например, концентрация соли, содержащейся в буфере для реакции, содержащем фермент(ы), соответствует примерно конечной концентрации соли после реакции, например составляет 5 или меньше крат, предпочтительно 3 или меньше крат, предпочтительнее 1,5 или меньше крат, от конечной концентрации соли после реакции. Хотя и без намерения ограничивать настоящее изобретение, например, в случае реакционной системы, в которой используют ДНК-полимеразу Вса и РНКазу Н из бактерии рода Archaeoglobus, концентрация HEPES-калийгидроксидного буфера может составлять более 0 и до 160 мМ, предпочтительно находиться в интервале от 30 до 120 мМ, предпочтительнее в интервале от 32 до 102 мМ. Если в качестве магниевой соли используют ацетат магния, концентрация может составлять более 0 и до 20 мМ, предпочтительно - находиться в интервале от 3 до 15 мМ, предпочтительнее в интервале от 4 до 13 мМ. Если для регулирования ионной силы используют ацетат калия, концентрация может составлять более 0 и до 500 мМ, предпочтительно находиться в интервале от 90 до 360 мМ, предпочтительнее в интервале от 100 до 317 мМ. Необязательно можно включать отдельно реагент для регулирования концентрации соли, который используют для регулирования концентрации соли. Раствор химерного олигонуклеотидного праймера может содержать соль для регулирования концентрации соли в реакционной смеси. В таком случае реакционную смесь можно получить с использованием двух растворов-премиксов. Если следует получить реагент для реакции амплификации гена, праймер обычно растворяют в растворе на стерильной воде с низким содержанием соли (например, буфере ТЕ) и получают реакционную смесь с его необходимым количеством (см. Molecular Cloning, 2nd ed., 14.18).- 12006679 Согласно настоящему изобретению концентрацию соли в растворе-премиксе, содержащем фермент(ы), можно сделать подходящей для стабилизации фермента(ов), включая в раствор праймера соль,которая является компонентом реакционной смеси. В другом воплощении способа длительного хранения по настоящему изобретению, где реагент для реакций находится в форме, состоящей из двух отдельных частей (т.е. раствора химерного олигонуклеотидного праймера и буфера для реакции, содержащего ферменты, магниевую соль и dNTPs), предпочтительно повышать концентрации ферментов в буфере для реакции. Концентрации содержащихся ферментов можно соответствующим образом отрегулировать в зависимости от типов используемых ДНК-полимеразы и РНКазы Н. В таком случае концентрацию соли можно оптимизировать с использованием способа, описанного в примере 4. Хотя и без намерения ограничивать настоящее изобретение, например, в случае реакционной системы, в которой используют ДНК-полимеразу Вса и РНКазу Н из бактерии родаArchaeoglobus или рода Thermococcus, концентрации ферментов, содержащихся в буфере для реакции,предпочтительно повышать до тех пор, пока содержищиеся ферменты не инактивируются. В воплощении реагента для реакции, в котором праймер можно легко заменить в зависимости от нуклеиновой кислоты как матрицы, для растворения праймера вместо раствора праймера можно использовать раствор, не содержащий праймер. В другом воплощении от других компонентов можно отделить dNTPs, а не химерный олигонуклеотидный праймер, и можно определить концентрации соли в двух растворах-премиксах, учитывая устойчивость ферментов. Что касается соотношения между концентрацией(ями) фермента(ов) и концентрацией соли в ферментсодержащем растворе-премиксе по настоящему изобретению, то предпочтительно установить норму содержания фермента выше 1, в то время как норма содержания соли поддерживается на уровне примерно 1, определяя конечную концентрацию фермента или соли после реакции как 1. Предпочтительно, отношение (норма содержания фермента (Е/(норма содержания соли (S составляет более 1. Отношение составляет предпочтительно 100E/S1, предпочтительнее 10E/S1, наиболее предпочтительно 5E/S1. В реагент для реакции по способу настоящего изобретения можно добавлять антисептическое средство или противогрибковое средство. Можно использовать коммерчески доступное антисептическое средство или противогрибковое средство. Примерами таких средств, которые можно использовать предпочтительно, являются азид натрия, параоксибензойная кислота, а также ее производные и соли, тимеросал и ProClin и другие средства. Естественно, концентрацию антисептического средства или противогрибкового средства определяют такой, чтобы фермент, содержащийся в реагенте для реакции, не инактивировался во время хранения или реакции. Реагент для реакции согласно способу длительного хранения настоящего изобретения можно хранить на протяжении примерно 1 месяца или дольше. В таком случае, хотя определенного ограничения по температуре хранения не существует, например, температура составляет 50 С или ниже, предпочтительно - 30 С или ниже.(2) Праймер, используемый в способе детекции патогенного микроорганизма и/или вируса по настоящему изобретению. Нуклеиновую кислоту-мишень в образце можно обнаружить с использованием способа амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Способ включает(а) получение реакционной смеси путем смешивания нуклеиновой кислоты как матрицы, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, по меньшей мере одного праймера и РНКазы Н, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один элемент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается в 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера;(b) амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени путем инкубации реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции; и(c) детекцию нуклеиновой кислоты-мишени со стадии (b). Если на указанной выше стадии (а) в качестве матрицы используют РНК, обратнотранскриптазную реакцию и реакцию амплификации нуклеиновой кислоты можно проводить в одну стадию. Хотя и без намерения ограничивать настоящее изобретение, например, в качестве сочетания обратной транскриптазы и ДНК-полимеразы типа с активностью замещения цепи можно использовать, предпочтительно, сочетание обратной транскриптазы AMV, обратной транскриптазы MMLV или обратной транскриптазыRAV-2 и ДНК-полимеразы Вса. Способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени настоящего изобретения можно использовать для того, чтобы распознать отличие в нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. В таком аспекте используемый химерный олигонуклеотидный праймер конструируют таким, чтобы 3'концевая часть праймера располагалась вблизи специфического основания распознаваемой нуклеотид- 13006679 ной последовательности-мишени. Например, его конструируют так, что между основанием и 3'-концевым основанием праймера образуется водородная связь. Если имеет место ошибочное спаривание между нуклеотидной последовательностью 3'-концевой части праймера и нуклеотидной последовательностью матрицы, амплификации от нуклеиновой кислоты-мишени не происходит, и с использованием для реакции амплификации вышеуказанного химерного олигонуклеотидного праймера продукт амплификации не образуется. С использованием способа можно получить информацию о специфическом основании в гене,таком как точечная мутация или полиморфизм одного нуклеотида (SNP). Хотя и без намерения ограничивать настоящее изобретение, например, для способа детекции нуклеиновой кислоты-мишени настоящего изобретения можно предпочтительно использовать праймер для детекции патогенного микроорганизма и/или вируса, выбранный из группы, состоящей из следующих праймеров:(1) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции Mycobacterium tuberculosis, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID(2) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции HCV, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 15, 16, 81-86 и 88-91;(3) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции chlamydia, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 17-20, 121-127,130-135, 166 и 167;(4) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции Mycobacterium avium complex, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID(5) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции gonococcus, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 38-63, 164 и 165;(6) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции HBV, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 71-78;(7) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции ВИЧ, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 95-103;(8) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции Staphylococcus aureus, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 108-117;(9) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции микоплазмы, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 139-146; и(10) химерного олигонуклеотидного праймера для детекции MRSA, имеющего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 152-155. Для способа детекции настоящего изобретения можно предпочтительно использовать зонд для детекции патогенного микроорганизма и/или вируса, выбранный из группы, состоящей из следующих зондов:(1) зонда для детекции Mycobacterium tuberculosis, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 11, 12 и 172;(2) зонда для детекции HCV, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 87 и 92;(3) зонда для детекции chlamydia, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 128, 136 и 168;(4) зонда для детекции Mycobacterium avium complex, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 32 и 33;(5) зонда для детекции gonococcus, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 64-68;(6) зонда для детекции HBV, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 79 и 80;(7) зонда для детекции ВИЧ, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 104 и 105;(8) зонда для детекции Staphylococcus aureus, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 118 и 119;(9) зонда для детекции микоплазмы, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 147-149; и(10) зонда для детекции MRSA, выбранного из участка, содержащего нуклеотидную последовательность последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 156 и 157.(3) Набор настоящего изобретения. Набор настоящего изобретения содержит химерный олигонуклеотидный праймер и/или зонд, описанные выше в (2). Настоящее изобретение относится к набору, используемому для способа амплификации нуклеиновой кислоты или детекции нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. В одном из воплощений набор находится в упакованной форме и содержит инструкции, касающиеся применения ДНКполимеразы и эндонуклеазы в реакции замещения цепи. Также для способа настоящего изобретения предпочтительно использовать набор, содержащий ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи,- 14006679 эндонуклеазу и буфер для реакции замещения цепи. С другой стороны, можно выбрать коммерчески доступную ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи и/или эндонуклеазу и использовать согласно инструкциям. Кроме того, набор может содержать реагент для обратнотранскриптазной реакции, который используют, когда в качестве матрицы используют РНК. ДНК-полимеразу можно выбрать из числа ДНК-полимераз, используемых в настоящем изобретении, описанных выше. Эндонуклеазу можно выбрать из числа эндонуклеаз, описанных выше. Буфер для реакции замещения цепи может содержать буфер для реакции, содержащий в качестве буферирующего компонента бицин, трицин, HEPES, фосфат или трис, и раствор для отжига. Кроме того, набор может содержать модифицированный дезоксирибонуклеотид или аналог дезоксинуклеотидтрифосфата."Инструкции" представляют собой отпечатанный материал, где описывается способ применения набора, например способ получения раствора реагентов для реакции замещения цепи, рекомендуемые условия реакций и т.п. Инструкции включают руководство в форме проспекта или листовки, этикетку,наклеенную на набор, и описание на упаковке, содержащей набор. Инструкции также включают сведения, которые можно получить через электронные среды передачи данных, такие как Интернет. Набор, используемый в способе детекции нуклеиновой кислоты-мишени, может содержать, кроме инструкций и реагентов для реакции амплификации, химерный олигонуклеотидный праймер, подходящий для амплификации нуклеиновой кислоты-мишени, или реагент для детекции амплифицированной нуклеиновой кислоты-мишени (например, зонд). Предпочтительно можно использовать набор, содержащий в качестве компонента реагент для реакции, сконструированный согласно способу стабилизации или длительного хранения реагента для реакции настоящего изобретения. Кроме того, набор настоящего изобретения может содержать нуклеиновую кислоту, служащую в качестве внутреннего стандарта (I. С.) для оценки ложноотрицательных показателей. Хотя и без намерения ограничивать настоящее изобретение, примерный набор содержит химерные олигонуклеотидные праймеры с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NOS: 170 и 171, зонд для детекции Mycobacterium tuberculosis, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 172, плазмиду в качестве внутреннего стандарта, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 169, и зонд для детекции внутреннего стандарта, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 173. Другой пример набора для детекции патогенного микроорганизма и/или вируса также может содержать внутренний стандарт. Примеры Приведенные далее примеры исллюстрируют настоящее изобретение подробнее, но не предназначаются для ограничения его объема. Ссылочный пример 1.(1) Величину единицы теплоустойчивой РНКазы Н, используемой в способе настоящего изобретения, можно вычислить следующим образом. В 1 мл 40-мМ трис-НСl (рН 7,7), содержащем 1 мМ ЭДТК, растворяют 1 мг поли(rА) или поли(dТ)(оба от Amersham Pharmacia Biotech) и получают раствор поли(rА) и раствор поли(dТ). Затем раствор поли(rА) (с конечной концентрации 20 мкг/мл) и раствор поли(dТ) (с конечной концентрации 30 мкг/мл) добавляют к 40-мМ трис-НСl (рН 7,7), содержащему 4 мМ MgCl2, 1 мМ DTT,0,003% BSA и 4% глицерина. В смеси проводят реакцию при 37 С в течение 10 мин и затем смесь охлаждают до 4 С и получают раствор поли(rА)-поли(dТ). К 100 мкл раствора поли(rА)-поли(dТ) добавляют 1 мкл соответствующим образом разведенного раствора фермента. В смеси проводят реакцию при 40 С в течение 10 мин. К смеси добавляют 10 мкл 0,5 М ЭДТК для прекращения реакции. Затем измеряют поглощение при 260 нм. В качестве контроля к реакционной смеси добавляют 10 мкл 0,5 М ЭДТК, в полученной смеси проводят реакцию при 40 С в течение 10 мин и затем измеряют поглощение. Величину(разницу в поглощении) получают, вычитая поглощение в контроле из поглощения для смеси в случае реакции в отсутствие ЭДТК. Таким образом, на основе разницы в поглощении определяют концентрацию нуклеотида, высвобожденного из гибрида поли(rА)-поли(dТ) путем ферментативной реакции. Единица=[(разница в поглощении)х(объем реакционной смеси (мл]/0,0152 х(110/100)х(степень разведения) Ссылочный пример 2. Получение РНКазы Н. РНКазу Н, используемую согласно настоящему изобретению, получают по способу, описанному вWO 02/22831. Конкретно, культивируют рекомбинантные клетки Escherichia coli и из клеток получают представляющую интерес РНКазу Н, как описано далее.(1) Полипетид с активностью РНКазы Н, полученный из Pyrococcus furiosus. Была сконструирована Escherichia coli JM109, трансформированная плазмидой pFU220, содержащей ДНК, кодирующую полипептид с активностью РНКазы Н, полученный из Pyrococcus furiosus, обозначена как Escherichia coli JM109/ pFU220 и депонирована 5 сентября 2000 г. (дата начального депозита) в International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology,AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan, под инвентарным номером PERM BP-7654. Escherichia coli JM109, трансформированную pFU220, инокулируют в 2 л средыLB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при 37 С в течение 16 ч. После культивирования клетки, собранные центрифугированием, суспендируют в 66,0 мл буфера для обработки ультразвуком [50 мМ трис-НСl (рН 8,0), 1 мМ ЭДТК, 2 мМ фенилметансульфонилфторида] и- 15006679 обрабатывают ультразвуком. Супернатант, полученный центрифугированием обработанной ультразвуком суспензии при 12000 об./мин в течение 10 мин, греют при 60 С в течение 15 мин. Затем его снова центрифугируют при 12000 об./мин в течение 10 мин и собирают супернатант. Таким образом, получают 61,5 мл горячего супернатанта. Горячий супернатант загружают в колонку с RESOURCE Q (Amersham Pharmacia Biotech), уравновешенную буфером А [50 мМ трис-HCl (рН 8,0), 1 мМ ЭДТК], и хроматографируют с использованием системы FPLC (Amersham Pharmacia Biotech). В результате РНКаза НП протекает через колонку с RESOURCE Q. Загружают 60,0 мл фракции РНКазы НII, протекшей через колонку, в колонку с RESOURCE S(Amersham Pharmacia Biotech), уравновешенную буфером А, и элюируют с линейным градиентом NaCl от 0 до 500 мМ с использованием системы PPLC. Получают фракцию, содержащую РНКазу НII, элюированную при примерно 150 мМ NaCl. Методом ультрафильтрации с использованием Centricon-10(Amicon) концентрируют 2,0 мл фракции РНКазы НII. Загружают 250 мкл концентрата в колонку для гель-фильтрации с супердексом 200 (Amersham Pharmacia Biotech), уравновешенную 50-мМ трис-HCl(рН 8,0), содержащим 100 мМ NaCl и 0,1 мМ ЭДТК, и элюируют тем же буфером. В результате РНКазу НII элюируют в позиции, соответствующей молекулярной массе 17 кДа. Ферментативную активность препарата, полученного таким образом, измеряют так, как описывается в ссылочном примере 1. В результате в препарате наблюдают активность РНКазы Н.(2) Полипетид с активностью РНКазы Н, полученный из Pyrococcus horikoshii. Была сконструирована Escherichia coli JM109, трансформированная плазмидой рРН 0238, содержащей ДНК, кодирующую полипептид с активностью РНКазы Н, полученный из Pyrococcus horikoshii, обозначена как Escherichia coli JM109/ рРН 0238 и депонирована 22 февраля 2001 г. (дата начального депозита) в International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan, под инвентарным номером FERM BP-7692. Escherichia coli JM109, трансформированную рРН 0238, инокулируют в 1 л среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при 37 С в течение 16 ч. После культивирования клетки, собранные центрифугированием, суспендируют в 34,3 мл буфера для обработки ультразвуком [50 мМ трис-НСl (рН 8,0), 1 мМ ЭДТК, 2 мМ фенилметансульфонилфторида] и обрабатывают ультразвуком. Супернатант, полученный центрифугированием обработанной ультразвуком суспензии при 12000 об./мин в течение 10 мин, греют при 80 С в течение 15 мин. Затем его снова центрифугируют при 12000 об./мин в течение 10 мин и собирают супернатант. Таким образом, получают 33,5 мл горячего супернатанта. Горячий супернатант загружают в колонку с RESOURCE Q (Amersham Pharmacia Biotech), уравновешенную буфером А [50 мМ трис-HCl (рН 8,0), 1 мМ ЭДТК], и хроматографируют с использованием системы FPLC (Amersham Pharmacia Biotech). В результате РНКаза НII протекает через колонку с RESOURCE Q. Диализуют 35,0 мл фракции РНКазы НII, протекшей через колонку, против 2 л буфера В (50 мМ трис-НСl (рН 7,0), 1 мМ ЭДТК) в течение 2 ч. Диализ повторяют еще 2 раза. Загружают 34,5 мл фракции диализованного раствора фермента в колонку с RESOURCE S (Amersham Pharmacia Biotech), уравновешенную буфером В, и элюируют линейным градиентом NaCl от 0 до 500 мМ с использованием системыFPLC. Получают фракцию, содержащую РНКазу НII, элюированную при примерно 155 мМ NaCl. Добавляют буфер В к 4,0 мл фракции, чтобы получить концентрацию NaCl 50 мМ. Смесь загружают в колонку с HiТrар-гепарином (Amersham Pharmacia Biotech), уравновешенную буфером В, содержащим 50 мМ NaCl, и элюируют линейным градиентом NaCl от 50 до 550 мМ с использованием системы FPLC. В результате получают фракцию, содержащую РНКазу НII, элюированную при примерно 160 мМ NaCl. Методом ультрафильтрации с использованием Centricon-10 (Amicon) концентрируют 6,9 мл фракции РНКазы НII. Делят на две порции 250 мкл концентрата и загружают в колонку для гель-фильтрации с суперозой 6 (Amersham Pharmacia Biotech), уравновешенную 50-мМ трис-HCl (рН 7,0), содержащим 100 мМ NaCl и 0,1 мМ ЭДТК, и элюируют тем же буфером. В результате РНКазу НII элюируют в позиции, соответствующей молекулярной массе 24,5 кДа. Такая молекулярная масса соответствует РНКазе НII в мономерной форме. Ферментативную активность препарата, полученного таким образом, измеряют так, как описывается в ссылочном примере 1. В результате в препарате наблюдают активность РНКазы Н.(3) Полипетид с активностью РНКазы Н, полученный из Archaeoglobus fulgidus. Была сконструирована Escherichia coli JM109, трансформированная плазмидой pAFU204, содержащей ДНК, кодирующую полипептид с активностью РНКазы Н, полученный из Archaeoglobus fulgidus, обозначена как Escherichia coli JM109/ pAFU204 и депонирована 22 февраля 2001 г (дата начального депозита) в International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan, под инвентарным номером FERM BP-7691. Escherichia coli JM109, трансформированную pAFU204, инокулируют в 2 л среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при 37 С в течение 16 ч. После культивирования клетки, собранные центрифугированием, суспендируют в 37,1 мл буфера для обработки ультразвуком [50 мМ трис-НСl (рН 8,0), 1 мМ ЭДТК, 2 мМ фенилметансульфонилфторида] и обрабатывают ультразвуком. Супернатант, полученный центрифугированием обработанной ультразвуком суспензии при 12000 об./мин в течение 10 мин, греют при 70 С в течение 15 мин. Затем его снова- 16006679 центрифугируют при 12000 об./мин в течение 10 мин и собирают супернатант. Таким образом, получают 40,3 мл горячего супернатанта. Горячий супернатант загружают в колонку с RESOURCE Q (Amersham Pharmacia Biotech), уравновешенную буфером А [50 мМ трис-HCl (рН 8,0), 1 мМ ЭДТК], и хроматографируют с использованием системы FPLC (Amersham Pharmacia Biotech). В результате РНКаза НII протекает через колонку с RESOURCE Q. Фракцию РНКазы НII, протекшую через колонку, загружают в колонку с RESOURCE S (Amersham(Amersham Pharmacia Biotech). В результате РНКаза НII протекает через колонку с RESOURCE S. В течение 2 ч диализуют 40,0 мл фракции РНКазы НII, протекшей через колонку, против 2 л буфера В (50 мМ трис-НСl (рН 7,0), 1 мМ ЭДТК), содержащего 50 мМ NaCl. Диализ повторяют еще 2 раза. Загружают 40,2 мл диализованного раствора фермента в колонку с HiTrap-гепарином (Amersham PharmaciaNaCl от 50 до 550 мМ с использованием системы FPLC. В результате получают фракцию, содержащую РНКазу НII, элюированную при примерно 240 мМ NaCl. Методом ультрафильтрации с использованием Centricon-10 (Amicon) концентрируют 7,8 мл фракции РНКазы НII. Примерно 600 мкл концентрата делят на четыре части и загружают в колонку для гельфильтрации с суперозой 6 (Amersham Pharmacia Biotech), уравновешенную 50-мМ трис-HCl (рН 7,0),содержащим 100 мМ NaCl и 0,1 мМ ЭДТК, 250 мкл, и элюируют тем же буфером. В результате РНКазу НII элюируют в позиции, соответствующей молекулярной массе 30,0 кДа. Такая молекулярная масса соответствует молекулярной массе РНКазы НII в мономерной форме. Ферментативную активность препарата, полученного таким образом, измеряют так, как описывается в ссылочном примере 1. В результате в препарате наблюдают активность РНКазы Н.Technology, AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan, под инвентарным номером PERM BP-7693. Escherichia coli HMS174(DE3), трансформированную pTU204, инокулируют в 10 мл среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют при встряхивании при 37 С в течение ночи. После культивирования клетки, собранные центрифугированием, обрабатывают так, как описано выше, и получают горячий супернатант. Ферментативную активность полученного таким образом горячего супернатанта измеряют так, как описывается в ссылочном примере 1. В результате в горячем супернатанте наблюдают активность РНКазы Н.(5) Полипетид с активностью РНКазы Н, полученный из Thermococcus celer. Была сконструирована Escherichia coli HMS174(DE3), трансформированная плазмидой рТСЕ 207,содержащей ДНК, кодирующую полипептид с активностью РНКазы Н, полученный из Thermococcusceler, обозначена как Escherichia coli HMS174(DE3)/рТСЕ 207 и депонирована 22 февраля 2001 г. (дата начального депозита) в International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan,под инвентарным номером FERM BP-7694. Escherichia coli HMS174(DE3), трансформированную рТСЕ 207, культивируют, и полученные клетки очищают, и получают горячий супернатант. Ферментативную активность полученного таким образом горячего супернатанта измеряют так, как описано выше в (4). В результате в горячем супернатанте наблюдают активность РНКазы Н. Ссылочный пример 3. Проверяют способ амплификации настоящего изобретения.(1) Осуществляют ПЦР с использованием праймера для ПЦР 150 выше pUC19 (SEQ ID NO: 1) и праймера для ПЦР pUC19 ниже NN (SEQ ID NO: 2), а также 100 пг плазмидной ДНК pUC19 в качестве матрицы. Полученный амплифицированный фрагмент очищают с использованием Microcon-100, выравнивают концы с использованием набора для выравнивания ДНК (Takara Shuzo) и субклонируют в сайтHindi плазмиды pUC19. Плазмиду со встроенным амплифицированным фрагментом используют для трансформации Escherichia coli JM109. Трансформант культивируют. Плазмиду со встроенной ДНКpUC19-150 выделяют из клеток в чистом виде с использованием QIAGEN plasmid mini kit (Qiagen). ПЦР осуществляют с использованием в качестве матрицы плазмиды со встроенной ДНК, а также праймеровMCS-F (SEQ ID NO: 3) и MCS-R (SEQ ID NO: 4). Путем очистки реакционной смеси с использованиемATP путем фосфорилирования по 5'-концу, и стерильную дистиллированную воду до 5 мкл, и также реакционную смесь, содержащую 30 пмоль праймера MR1 (SEQ ID NO: 6). Реакционную смесь денатурируют тепловой обработкой при 98 С в течение 2 мин и затем охлаждают до 55 С. В каждую реакционную смесь добавляют 20 мкл реакционной смеси (42,5 мМ трицинового буфера (рН 8,7), 12,5 мМ хлорида калия, 12,5 мМ сульфата аммония, 0,0125% BSA, 1,25% ДМСО, 5 мМ ацетата магния, 0,625 мМ каж- 17006679 дого dNTP), содержащей 1 Е ДНК-полимеразы BcaBEST. Полученные смеси реагируют при 55 С в течение 15 мин. По завершeнии реакции к 5 мкл каждой реакционной смеси добавляют 2,5 мкл раствора для прекращения реакции (95% формамида, 20 мМ ЭДТК, 0,05% бромфенолового синего, 0,5% ксиленцианола). Смеси денатурируют тепловой обработкой при 94 С в течение 3 мин. Каждую реакционную смесьMR1. Результаты показаны на фиг. 1 А. Лэддер на фиг. 1 А получают путем секвенирования одноцепочечной ДНК М 13mр 18 (Takara Shuzo) с использованием праймера MF2, меченного [-32P]ATP путем фосфорилирования, и используют для определения длины достроенного продукта. Полоса 1: сочетание праймеров MF2 и MR1; и полоса 2: MR1. Как видно на фиг. 1 А, детектируется полоса в 448 п.о., достроенная с праймера MR1 к концу матрицы,когда реакцию достраивания осуществляют, добавляя к матрице только праймер MR1. С другой стороны, при добавлении также праймера МР 2 кроме вышеуказанной полосы детектируется полоса в 373 п.о.,связанная с праймерами MR1 и MF2. Таким образом, подтверждается, что достраивание с праймера MR1 с использованием ПЦР-амплифицированного фрагмента как матрицы под действием ДНК-полимеразыBcaBEST переключается из-за переключения матрицы на достраивание с использованием цепи, достраиваемой с праймера MF2 как матрицы. Кроме того, переключение матрицы наблюдают, когда используют ДНК-полимеразу Кленова в качестве мезофильной ДНК-полимеразы, обладающей в подобных условиях активностью замещения цепи. С другой стороны, переключение матрицы не наблюдают с использованием ДНК-полимеразы TaKaRa Taq (Takara Shuzo) или PyroBEST (Takara Shuzo), которые не обладают активностью замещения цепи.(2) Проверяют реакцию переключения матрицы с использованием цепи матричной ДНК с отожженным к ней праймером. Фрагменты ДНК, к которым можно отжигать праймеры MF2 и MR1, получают следующим образом. Осуществляют ПЦР с использованием плазмиды pUC19 как матрицы и праймеровMCSF и RV (Takara Shuzo) или праймеров М 4 (Takara Shuzo) и MCSR. Реакционные смеси очищают с использованием Microcon-100 и получают ПЦР-амплифицированные фрагменты MCSP-RV (236 п.о.) иM4-MCSR (271 п.о.). Участок, связанный праймерами М 4 и RV, обычно присутствует в обоих ПЦРамплифицированных фрагментах. Затем получают матрицу-праймер (2)-1, где цепи матричной ДНК с отожженными к ним праймерами не отожжены друг с другом, и матрицу-праймер (2)-2, где цепи матричной ДНК с отожженными к ним праймерами отожжены друг с другом, как описывается далее.(2)-1. Реакционную смесь, содержащую 30 нг фрагмента MCSF-RV, 40 пмоль праймера MF2, меченного [-32P]ATP путем фосфорилирования по 5'-концу, пропилендиамин в конечной концентрации 0,01% и стерильную дистиллированную воду до 5 мкл, и реакционную смесь, содержащую 30 нг фрагмента M4-MCSR, 40 пмоль праймера MR1, пропилендиамин в конечной концентрации 0,01% и стерильную дистиллированную воду до 5 мкл, по отдельности денатурируют тепловой обработкой при 98 С в течение 2 мин и затем охлаждают до 55 С. Смешивают вместе по 2,5 мкл каждой реакционной смеси и получают матрицу-праймер.(2)-2. Реакционную смесь, содержащую 15 нг фрагмента MCSF-RV, 15 нг фрагмента М 4-MCSR, 20 пмоль праймера MF2, меченного [-32P]ATP путем фосфорилирования по 5'-концу, 20 пмоль праймера MR1, пропилендиамин в конечной концентрации 0,01% и стерильную дистиллированную воду до 5 мкл, денатурируют тепловой обработкой при 98 С в течение 2 мин и затем охлаждают до 55 С, и получают матрицу-праймер. К 5 мкл каждой реакционной смеси матрицы-праймера добавляют 20 мкл реакционной смеси (42,5 мМ трицинового буфера (рН 8,7), 12,5 мМ хлорида калия, 12,5 мМ сульфата аммония, 0,0125% BSA, 1,25% ДМСО, 5 мМ ацетата магния, 0,625 мМ каждого dNTP), содержащей 1 Е ДНК-полимеразы BcaBEST. Полученные смеси реагируют при 55 С в течение 15 мин. По завершeнии реакции к 5 мкл каждой реакционной смеси добавляют 2,5 мкл раствора для прекращения реакции (95% формамида, 20 мМ ЭДТК,0,05% бромфенолового синего, 0,5% ксиленцианола). Смеси денатурируют тепловой обработкой при 94 С в течение 3 мин. Каждую реакционную смесь (1,6 мкл) подвергают электрофорезу в 6% полиакриламидном геле, содержащем 8 М мочевины, регистрируют сигналы с использованием BAS2000 (Fujix) и детектируют продукты, достроенные с праймера MF2. Результаты показаны на фиг. 1 В. Лэддер на фиг. 1 В получают путем секвенирования одноцепочечной ДНК М 13mр 18 с использованием праймера MR1, меченного [-32P]ATP путем фосфорилирования, и используют для определения длины достроенного продукта. Полоса 1: цепи матричной ДНК не отожжены друг с другом; и полоса 2: цепи матричной ДНК отожжены друг с другом. Как видно на фиг. 1 В, только полоса в 161 п.о., достроенная с праймера МР 2 к концу матрицы, детектируется в случае матрицы-праймера, где цепи матричной ДНК с отожженными к ним праймерами не отожжены друг с другом. С другой стороны, кроме вышеуказанной полосы, детектируют полосу в 223 п.о.,связанную с праймерами МР 2 и MR1, в случае матрицы-праймера, где цепи матричной ДНК с отожженными к ним праймерами отожжены друг с другом. Таким образом, подтверждается, что реакция пере- 18006679 ключения матрицы происходит, если цепи матричной ДНК с отожженными к ним праймерами отожжены друг с другом. Пример 1. Проверяют способ детекции настоящего изобретения с использованием в качестве объектаMycobacterium tuberculosis. На основе нуклеотидной последовательности генома Mycobacterium tuberculosis,зарегистрированного в GeneBank под инвентарнымAL123456, синтезируют праймеры K-F-1033-2(SEQ ID NO: 7) и K-F-1133-2 (SEQ ID NO: 8) для амплификации участка с относительно низким содержанием GC в геноме Mycrobacterium tuberculosis. Длина участка, ограниченного парой праймеров, включая праймерные части, составляет 105 п.о. Геномную ДНК Mycobacterium tuberculosis как матрицу экстрагируют из сухой вакцины БЦЖ (Nippon BCG Seizo) обычным способом. Получают серийные разведения, содержащие от 100 фг до 10 пг геномной ДНК на 1 мкл стерильной воды. Реакции осуществляют следующим образом. Коротко, получают реакционные смеси в конечном объеме 25 мкл, содержащие в конечных концентрациях 32 мМ HEPES-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8); 100 мМ ацетата калия; 1% ДМСО; 0,01% BSA; 4 мМ ацетата магния; 500 мкМ каждого из dNTP; 50 пмоль каждого из праймеров KF-1033-2 и K-F-1133-2, 9,375 Е РНКазы НII из Pfu, 4,375 Е РНКазы НII из Afu или 4 Е РНКазы Н из Tli; 2,75 Е ДНК-полимеразы BcaBEST; 1 мкл одной из матриц и стерильную воду. Реакционные смеси помещают в термоячейку Personal, установленную на 62 С, и инкубируют в течение 60 мин. По завершении реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. В результате подтверждается, что продукт амплификации обнаруживают при использовании каждой РНКазы НII и любого количества (100 фг-10 пг) геномной ДНК как матрицы. Пример 2.(1) Проверяют способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени с использованием РНК-зонда. В качестве объекта выбирают Mycobacterium tuberculosis. В 50 мкл реакционной смеси добавляют в качестве матрицы 1 нг или 100 пг геномной ДНК БЦЖ, полученной в примере 1. С использованием синтезатора ДНК синтезируют праймеры MTIS2F (SEQ ID NO: 162) и MTIS2R (SEQ ID NO: 163), а также РНК-зонды для детекции MTIS (SEQ ID NO: 11) и MTIS-2 (SEQ ID NO: 12). Каждый зонд имеет флуоресцентные метки 6-FAM (Glen Research) и TAMRA (Glen Research) на 5'- и 3'-концах, соответственно. Реакции осуществляют так, как описывается в примере 1, за исключением того, что используют 4 Е ДНК-полимеразыBcaBEST и 18,75 Е РНКазы НII из Pfu. В каждую реакционную смесь добавляют (конечный объем 50 мкл) 5 пмоль РНК-зонда. Из 50 мкл каждой реакционной смеси 25 мкл используют для реакции ICAN при 58 С. Для реакций ICAN и детекции продуктов амплификации используют Smart Cycler (Takara Shuzo). Результаты показаны на фиг. 2 А. На фиг. 2 (А, В и С) продольные оси представляют интенсивность флуоресценции, а горизонтальные оси представляют время. Как видно на фиг. 2 А, только с использованием 1 нг или 100 пг матричной ДНК методом анализа с использованием Smart Cycler можно проверить амплифицированные фрагменты, представляющие интерес. Более того, подтверждается, что оба РНКзонда можно предпочтительно использовать для детекции в режиме реального времени.(2) Проверяют одностадийную систему детекции RT-ICAN с использованием интеркалятора. В качестве объекта выбирают геном HCV. РНК как матрицу получают следующим образом. Из 300 мкл сыворотки пациента с гепатитом С после информированного согласия с использованием реагента TRIzol(Life Technology) согласно инструкциям, прилагаемым к реагенту, получают образец РНК и окончательно растворяют в 20 мкл воды для инъекций (Otsuka Pharmaceutical). Образец РНК используют в качестве матрицы для ОТ-ПЦР. Реакцию осуществляют следующим образом. Получают 50 мкл реакционной смеси с использованием 2 мкл образца РНК, 20 пмоль каждого из праймеров SP6-HCV-F (SEQ ID NO: 13) иT7-HCV-R (SEQ ID NO: 14) и набора One-Step RNA PCR (Takara Shuzo) согласно руководству, прилагемому к набору. Реакционную смесь помещают в термоячейку Personal, проводят реакцию при 50 С в течение 15 мин и при 94 С в течение 2 мин и смесь подвергают 40 циклам реакций по следующей схеме: 94 С в течение 30 с, 60 С в течение 30 с и 72 С в течение 30 с. По завершении реакции реакционную смесь подвергают электрофорезу в агарозном геле с 2% SeaPlaque GTG и вырезают из геля представляющий интерес продукт амплификации в 350 п.о. ДНК извлекают с использованием EASYTRAP Ver. 2 (Takara Shuzo) согласно инструкциям, прилагаемым к набору. Синтезируют транскрибированную РНК с использованием извлеченной ДНК как матрицы и набора Competitive RNA Transcription (Takara Shuzo) согласно инструкциям, прилагаемым к набору. Используют РНК как матрицу для проверки одностадийной RT-ICAN. Добавляют матричную РНК, соответствующую 0,1 х 105, 1 х 106 или 1 х 107 копий. Получают реакционные смеси в конечном объеме 50 мкл, содержащие в конечных концентрациях 32 мМ HEPES-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 100 мМ ацетата калия, 1% ДМСО, 0,01% BSA, 4 мМ ацетата магния, 500 мкМ каждого из dNTP, 50 пмоль каждого из праймеров, представленных SEQ ID NOS: 15 и 16, 5 Е РНКазы НII из Afu, 4 Е ДНК-полимеразы BcaBEST, 20 Е ингибитора РНКазы, 2,5 Е ревертазы XL AMV (TaharaShuzo), 1 мкл транскрибированной РНК, соответствующей заданному числу копий, и 5 мкл 3000-кратного разведения исходного раствора SYBR Green I (нуклеиновая кислота SYBR Green I, Gel Stain, BioWhittaker Molecular Applications) стерильной водой в качестве интеркалятора. Для реакции ICAN при 53 С используют 25 мкл каждой реакционной смеси. Для реакций ICAN и детекции используют систему ABIPRISM 7700 (Applied Biosystems). Результаты показаны на фиг. 2 В. Как видно из фиг. 2 В, подтвержда- 19006679 ется, что нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить в режиме реального времени с использованием способа одностадийной RT-ICAN.(3) Проверяют систему детекции ICAN с использованим интеркалятора. В качестве объекта выбирают геном chlamydia. На основе нуклеотидной последовательности плазмиды Chlamydia trachomatis(GeneBank, инвентарныйХ 06707) синтезируют праймеры CT2F (SEQ ID NO: 17) и CT2R (SEQ ID NO: 18). Длина участка, ограниченного парой праймеров, включая праймерные части, составляет 109 п.о. Кроме того, также синтезируют праймеры CT-FB19-3 (SEQ ID NO: 19) и CT-RB23-2 (SEQ ID NO: 20) в качестве праймеров для амплификации chlamydia. Длина участка, ограниченного парой праймеров,включая праймерные части, составляет 107 п.о. Получают реакционные смеси в конечном объеме 50 мкл,содержащие, в конечных концентрациях, 32 мМ HEPES-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 100 мМ ацетата калия, 1% ДМСО, 0,01% BSA, 4 мМ ацетата магния, 500 мкМ каждого из dNTP, 50 пмоль каждого из праймеров CT2F и CT2R или праймеров CT-FB19-3 и CT-RB23-2, 35 Е РНКазы НII из Afu, 8 Е ДНК-полимеразы BcaBEST, 1 мкл образца и стерильную воду. К 22,5 мкл каждой реакционной смеси добавляют в качестве интеркалятора 2,5 мкл 3000-кратного разведения исходного раствора SYBR Green I и реакционные смеси подвергают реакции ICAN при 55 С. Для реакций ICAN и детекции используютSmart Cycler. Результаты показаны на фиг. 2 С. Как видно из фиг. 2 С, подтверждается, что нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить в режиме реального времени с использованием интеркалятора в системе для детекции chlamydia. Как описано выше, подтверждается, что способ настоящего изобретения можно использовать для детекции нуклеиновой кислоты-мишени в режиме реального времени. Пример 3. Устойчивость при хранении реагента, используемого для способа настоящего изобретения, проверяют следующим образом.ICAN, содержащий 1,6 мМ каждого из dNTPs, 101 мМ HEPES-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 317 мМ ацетата калия, 12,7 мМ ацетата магния, 0,03% бычьего сывороточного альбумина, 3,2% диметилсульфоксида, 0,56 Е/мкл РНКазы НII из Afu и 0,35 Е/мкл ДНК-полимеразы BcaBEST. К 7,875 мкл раствора-премикса для реакции ICAN добавляют 16,125 мкл водного раствора, содержащего 50 пмоль каждого из праймеров для детекции Mycobacterium tuberculosis K-F-1033 (68) (SEQ IDNO: 21) и K-R-1133 (68) (SEQ ID NO: 22). Кроме того, к смеси добавляют 1 мкл водного раствора, содержащего геномную ДНК БЦЖ, полученную в примере 1, в концентрации 100 или 10 пг/мкл. Полученные смеси подвергают реакции ICAN при 64 С в течение 1 ч. По завершении реакции 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3% агарозном геле для подтверждения амплификации. Процедуру повторяют после соответствующего периода хранения (в днях) и устойчивость растворапремикса для реакции ICAN оценивают, основываясь на продуктах амплификации по ICAN, обнаруженных после электрофореза. Результаты показаны на фиг. 3. Фиг. 3 представляет собой фигуру, показывающую электрофорез, представляющий результаты по устойчивости при хранении раствора-премикса настоящего изобретения. Фиг. 3 А показывает результаты при хранении при 4 С. Полоса 1: непосредственно после получения раствора-премикса, 100 пг геномной ДНК БЦЖ; полоса 2: непосредственно после получения, 10 пг; полоса 3: 9 дней после получения, 100 пг; полоса 4: 9 дней после получения, 10 пг; полоса 5: 18 дней после получения, 100 пг; полоса 6: 18 дней после получения, 10 пг; полоса 7: 28 дней после получения, 100 пг; и полоса 8: 28 дней после получения, 10 пг. Фиг. 3 В показывает результаты при хранении при 30 С. Полоса 1: непосредственно после получения раствора-премикса, 100 пг геномной ДНК БЦЖ; полоса 2: непосредственно после получения, 10 пг; полоса 3: 6 дней после получения, 100 пг; полоса 4: 6 дней после получения, 100 пг; полоса 5: 10 дней после получения, 100 пг; и полоса 6: 10 дней после получения, 10 пг. Как видно на фиг. 3, подтверждается, что раствор-премикс можно использовать для устойчивого осуществления реакции ICAN после хранения при 4 С в течение 28 дней или более после получения. Также подтверждается, что раствор-премикс можно использовать для устойчивого осуществления реакции ICAN после хранения при 30 С в течение 10 дней или более после получения. Таким образом, подтверждается, что реагент для амплификации с использованием способа ICAN можно хранить в течение длительного периода времени, когда его получают и хранят в виде раствора-премикса для реакции в условиях, описанных выше. Кроме того, подобные результаты получают, когда получают растворы-премиксы для ICAN, содержащие 3-, 10- или 30-кратное количество РНКазы НII из Afu и подвергают их испытаниям на хранение в условиях, описанных выше. Пример 4. Устойчивость и возможность длительного хранения реагента, используемого для способа настоящего изобретения, проверяют следующим образом.(1) Проверяют состав раствора-премикса в процессе хранения. Конкретно, получают раствор (I), содержащий 142 мМ HEPES-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 444 мМ ацетата калия, 0,044% бычьего сывороточного альбумина, 4,44% диметилсульфоксида, 0,8 Е/мкл РНКазы НII из Afu и 0,5 Е/мкл ДНК- 20006679 полимеразы BcaBEST. Получают премикс [А], премикс [В], премикс [С] и премикс [D], добавляя к 5,625 мкл раствора (I) для премикса [А] (без праймера) 1 мкл 100-мМ раствора ацетата магния и 1,25 мкл dNTPs; для премикса [В] (без dNTPs) по 1 мкл каждого из праймеров для детекции Mycobacterium tuberculosis KF-1033 (68) и K-R-1133 (68) (50 пмоль/мкл) и 1 мкл 100-мМ раствора ацетата магния; для премикса [С](без ацетата магния) 1 мкл каждого из K-F-1033 (68) и K-R-1133 (68) (50 пмоль/мкл) и 1,25 мкл 10-мМdNTPs; и для премикса [D] по 1 мкл каждого из K-F-1033 (68) и K-R-1133 (68) (50 пмоль/мкл), 1 мкл 100-мМ раствора ацетата магния и 1,25 мкл 10-мМ dNTPs. Растворы-премиксы хранят при 30 С в течение 2 ч. К 7,875 мкл премикса [А] добавляют 1 мкл каждого из K-F-1033 (68) и K-R-1133 (68) (50 пмоль/мкл); к 8,625 мкл премикса [В] добавляют 1,25 мкл 10-мМ dNTPs; и к 8,875 мкл премикса [С] добавляют 1 мкл 100-мМ ацетата магния. Затем к премиксу [А], премиксу [В] и премиксу [С] добавляют воду для инъекций или 9,875 мкл премикса [D] до объема 24 мкл.К каждой смеси добавляют 1 мкл геномной ДНК БЦЖ в концентрации 100 пг/мкл. Полученные смеси инкубируют при 64 С в течение 1 ч. По завершении реакции 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле для подтверждения амплификации. В результате подтверждается, что композиции премикса [А], премикса [В] и премикса [С] предпочтительны для стабилизации реагента.(2) Проверяют изменения при хранении с использованием раствора-премикса, содержащего все компоненты, необходимые для реакции ICAN, и растворов-премиксов, из которых удален праймер, Mg2+ или подобное. Конкретно, получают премикс (I), содержащий 69 мМ HEPES-гидроксидкалиевого буфера(рН 7,8), 215 мМ ацетата калия, 0,022% бычьего сывороточного альбумина, 2,2% диметилсульфоксида,8,6 мМ ацетата магния, 1,1 мМ каждого из dNTPs, 0,38 Е/мкл РНКазы НII из Afu, 0,24 Е/мкл ДНКполимеразы BcaBEST, 80 кБк/мкл [-32P]dATP (Amersham Pharmacia Biotech) и 5,2 мкл каждого из праймеров для детекции Mycobacterium tuberculosis K-F-1033 (68) и K-R-1133 (68). Кроме того, получают премикс (II), в котором из состава премикса (I) изъяты праймеры, и премикс (III), в котором из состава премикса (I) изъят ацетат магния. Из каждого премикса после хранения при 30 С в течение 2, 5 или 20 ч отбирают 3-мкл образцы и замораживают при -20 С. Образцы подвергают электрофорезу в 15% акриламидном геле. Гель работает в течение 1,5 ч, затем его сушат и подвергают авторадиографии. Результаты показаны на фиг. 4. Фиг. 4 представляет собой фигуру, демонстрирующую авторадиографию. Полоса 1: премикс (III), хранившийся в течение 2 ч; полоса 2: премикс (III), хранившийся в течение 5 ч; полоса 3: премикс (III), хранившийся в течение 20 ч; полоса 4: премикс (II), хранившийся в течение 2 ч; полоса 5: премикс (II), хранившийся в течение 5 ч; полоса 6: премикс (II), хранившийся в течение 20 ч; полоса 7: премикс (I), хранившийся в течение 2 ч; полоса 8: премикс (I), хранившийся в течение 5 ч; и полоса 9: премикс (I), хранившийся в течение 20 ч. Как видно на фиг. 4, подтверждается, что генерация высокомолекулярной ДНК во время хранения,обнаруживаемая для премикса (I), подавляется путем изменения состава до состава премикса (II) или премикса (III), которые соответствуют составу премикса (I) с устранением из него праймеров или ацетата магния. Таким образом, подтверждается, что побочную реакцию химерного олигонуклеотидного праймера можно подавить и реагент можно стабилизировать путем устранения из реакционной смеси химерного олигонуклеотидного праймера, соли магния или dNTPs.(3) Проверяют норму содержания (концентрацию соли) для хранения в растворе-премиксе, содержащем все компоненты, необходимые для реакции ICAN, за исключением праймеров. Конкретно, получают и хранят при 30 С раствор-премикс А для реакции ICAN, раствор-премикс В для реакции ICAN и раствор-премикс С для реакции ICAN, содержащие, соответственно, раствор-премикс А - 1,6 мМ каждого из dNTPs, 102 мМ HEPES-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 317 мМ ацетата калия, 13 мМ ацетата магния, 3,2% диметилсульфоксида, 0,03% бычьего сывороточного альбумина, 0,556 Е/мкл РНКазы НII изAfu и 0,349 Е/мкл ДНК-полимеразы BcaBEST; раствор-премикс В - 1 мМ каждого из dNTPs, 64 мМHEPES-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 200 мМ ацетата калия, 8 мМ ацетата магния, 2% диметилсульфоксида, 0,02% бычьего сывороточного альбумина, 0,35 Е/мкл РНКазы НII из Afu и 0,22 Е/мкл ДНКполимеразы BcaBEST; и раствор-премикс С - 0,57 мМ каждого из dNTPs, 36 мМ HEPES-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 114 мМ ацетата калия, 4,5 мМ ацетата магния, 1,1% диметилсульфоксида, 0,01% бычьего сывороточного альбумина, 0,2 Е/мкл РНКазы НII из Afu и 0,125 Е/мкл ДНК-полимеразы BcaBEST. Добавляют 50 пмоль каждого из праймеров для детекции Mycobacterium tuberculosis K-F-1033 (68) и К-R-l 133 (68), а также воду для инъекций до объема 24 мкл к 7,875 мкл раствора-премикса А, 12,5 мкл раствора-премикса В или 22 мкл раствора-премикса С. Затем к ним добавляют 1 мкл водного раствора,содержащего геномную ДНК БЦЖ в концентрации 100 или 10 пг/мкл. Полученные смеси подвергают реакции ICAN при 64 С в течение 1 ч. По завершении реакции 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле для подтверждения амплификации. Процедуру осуществляют с соответствующими интервалами и устойчивость растворов-премиксов оценивают на основании наличия продуктов ICAN-амплификации после электрофореза. Результаты показаны на фиг. 5. Фиг. 5 представляет собой фигуру, показывающую картину электрофореза, отражающую устойчивость при хранении растворов-премиксов настоящего изобретения А, В и С. Полоса 1: раствор-премикс А, 13 дней после получения, 100 пг геномной ДНК БЦЖ; полоса 2: раствор-премикс А, 13 дней после получения, 10 пг; полоса 3: раствор-премикс В, 13 дней после получения, 100 пг; полоса 4: раствор-премикс В, 13 дней- 21006679 после получения, 10 пг; полоса 5: раствор-премикс С, 13 дней после получения, 100 пг; полоса 6: раствор-премикс С, 13 дней после получения, 10 пг; полоса 7: раствор-премикс В, 18 дней после получения,100 пг; полоса 8: раствор-премикс В, 18 дней после получения, 10 пг; полоса 9: раствор-премикс С, 18 дней после получения, 100 пг; и полоса 10: раствор-премикс С, 18 дней после получения, 10 пг. Как видно из фиг. 5, подтверждается, что растворы-премиксы А и В можно хранить при 30 С в течение примерно 1 и 3 недель, соответственно. Раствор-премикс С можно использовать для осуществления реакции ICAN в течение 18 дней или более после получения. Таким образом, подтверждается, что концентрация соли, содержащейся в буфере для реакции, содержащем ферменты, предпочтительно составляет примерно конечную концентрацию соли после реакции. Конкретно, предпочтительные концентрации составляют 1,5 или менее крат от конечной концентрации соли после реакции.(4) Если раствор, содержащий фермент, необходимо хранить, устойчивость фермента, как правило,повышается за счет повышения концентрации фермента. Проверяют устойчивость премикса в отношении хранения. Премикс для хранения создают таким, чтобы концентрация фермента поддерживалась высокой за счет снижения концентрации соли и добавления соли непосредственно перед реакцией для компенсации ее недостатка для реакции ICAN. Конкретно, получают и хранят при 30 С раствор-премикс для реакции ICAN, содержащий 2,5 мМ каждого из dNTPs, 32 мМ HEPES-гидроксидкалиевого буфера(рН 7,8), 100 мМ ацетата калия, 4 мМ ацетата магния, 0,05% бычьего сывороточного альбумина, 0,875 Е/мкл РНКазы НII из Afu и 0,55 Е/мкл ДНК-полимеразы из BcaBEST. К 5 мкл раствора-премикса для реакции ICAN добавляют 19 мкл водного раствора, содержащего 50 пмоль каждого из праймеров для детекции Mycobacterium tuberculosis K-F-1033 (68) и K-R-1133 (68), 33,64 мМHEPES-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 105,22 мМ ацетата калия, 4,21 мМ ацетата магния и 1,32% диметилсульфоксида. К смеси добавляют 1 мкл водного раствора, содержащего геномную ДНК БЦЖ в концентрации 100 пг/мкл или 10 пг/мкл. Полученные смеси подвергают реакции ICAN при 64 С в течение 1 ч. По завершении реакции 5 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле для подтверждения амплификации. Процедуру осуществляют с соответствующими интервалами и устойчивость растворов-премиксов настоящего изобретения оценивают на основании наличия продукта ICAN-амплификации после электрофореза. Результаты показаны на фиг. 6. Фиг. 6 представляет собой фигуру, показывающую картину электрофореза, отражающую устойчивость при хранении растворов-премиксов настоящего изобретения А, В и С. Полоса 1: раствор-премикс непосредственно после получения, 100 пг геномной ДНК БЦЖ; полоса 2: раствор-премикс непосредственно после получения, 10 пг; полоса 3: 21 день после получения, 100 пг; полоса 4: 21 день после получения, 10 пг; полоса 5: 25 дней после получения, 100 пг; полоса 6: 25 дней после получения, 10 пг; полоса 7: 32 дня после получения, 100 пг; и полоса 8: 32 дня после получения, 10 пг. Как видно из фиг. 6, подтверждается, что раствор-премикс можно использовать для устойчивого осуществления реакции ICAN после хранения при 30 С в течение 32 дней или более. Таким образом, подтверждается, что реагент для амплификации с использованием способа ICAN можно хранить в течение длительного периода времени, когда раствор-премикс для реакции получают и хранят в условиях, описанных выше. Подобные результаты получают, когда проверку осуществляют так, как описывается выше в (1)-(4),с использованием сочетания ДНК-полимеразы BcaBEST и РНКазы Н Тli. Таким образом, подтверждается, что отношение норм содержания (отношение норма содержания фермента/норма содержания соли) составляет предпочтительно более 1, причем конечную концентрацию фермента (ДНК-полимеразы и/или РНКазы Н) или соли после реакции принимают за 1. Кроме того, подтверждается, что указанное отношение равно предпочтительно 5 или меньшей величине. Подобные результаты получают, когда проверку осуществляют так, как описывается выше в (1)-(4),увеличивая количество используемой РНКазы Н в 3, 10 или 30 раз. Пример 5. Проверяют детекцию Mycobacterium avium complex с использованием способа настоящего изобретения. Сначала получают положительный контроль для Mycobacterium avium и Mycobacterium intracellulare. Получают продукты амплификации в 560 п.о., соответствующие частям последовательностей РНК генов 16S из Mycobacterium avium и Mycobacterium intracellulare с нуклеотидными последовательностями SEQ IDNOS: 23 и 24, используя ДНК-полимеразу Ex Taq для реакций достраивания с последующими ПЦР с использованием десяти 74-мерных синтетических праймеров, согласно способу, описанному в BioTechniques,9(3):298-300 (1990). Продукты амплификации встраивают в вектор рТ 7 Blue Т с использованием набораDNA Ugation Kit ver. 2 (Takara Shuzo). Смеси для дотирования используют для трансформации Е. coliJM109 и получают плазмиды как положительный контроль для М. avium и М. intracellulare. Синтезируют праймеры Мусо-F-1, Myco-F-2, Myco-F-3, Myco-R-1, Myco-R-1-2, Myco-R-2I и Myco-R-2A, имеющие нуклеотдные последовательности SEQ ID NOS: 25-31. Реакции осуществляют следующим образом. Коротко, получают реакционные смеси в конечном объеме 25 мкл, содержащие в конечных концентрациях 32 мМ HEPES-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 100 мМ ацетата калия, 1% ДМСО, 0,01% BSA, 4 мМ ацетата магния, 500 мкМ каждого из dNTPs, 4,4 Е РНКазы НII из Afu или 4 Е РНКазы Н из Til, 4 Е ДНКполимеразы BcaBEST, 105 копий положительного контроля для М. avium или М. intracellulare в качестве- 22006679 матрицы и 25 пмоль каждого из предшествующего и последующего праймеров. Реакционные смеси помещают в термоячейку, установленную на 55 С, и инкубируют в течение 60 мин. Когда в качестве матрицы используют положительный контроль для М. avium, с использованием любой РНКазы Н и пары праймеров Мусо-F-1 и Myco-R-1; Myco-F-1 и Myco-R-1-2; Myco-F-1 и Myco-R-2A; Myco-F-2 и Myco-R-1;Myco-F-3 и Myco-R-2A после электрофореза в агарозном геле наблюдают представляющие интерес продукты амплификации в 101, 96, 96, 101, 96, 96, 106, 101 и 101 п.о. Продукт амплификации не наблюдают с использованием пар праймеров Мусо-F-1 и Myco-R-2I; Myco-F-2 и Myco-R-2I или Myco-F-3 и Myco-R-21. Когда в качестве матрицы используют положительный контроль для М. intracellulare, с использованием любой РНКазы Н и пары праймеров Myco-F-1 и Myco-R-1; Мусо-F-1 и Myco-R-1-2; Myco-F-1 иMyco-F-3 и Myco-R-1-2 или Мусо-F-3 и Myco-R-21 после электрофореза в агарозном геле наблюдают продукты амплификации, представляющие интерес, в 101, 96, 96, 101, 96, 96, 106, 101 и 101 п.о. Продукт амплификации не наблюдают с использованием пар праймеров Myco-F-1 и Myco-R-2A; Myco-F-2 иMyco-R-2A или Myco-F-3 и Myco-R-2A. На основании вышеуказанных результатов подтверждается, что М. avium можно отличить от М. intracellulare, используя праймер Myco-R-21 или Myco-R-2A, которые приводят к результату в матрицеспецифических реакциях. Гибридизацию методом дот-блоттинга с амплифицированными фрагментами осуществляют, как описано далее, с использованием avium-зонда (SEQ ID NO: 32) или intracellulareзонда (SEQ ID NO: 33), каждый из которых метят по 5'-концу биотином. Коротко, 1 мкл каждой реакционной смеси подвергают денатурации при 98 С в течение 5 мин, быстро охлаждают на льду и наносят каплями на Hybond-N (Amersham Pharmacia Biotech). После УФ-облучения мембрану помещают в гибридизационный мешочек. Добавляют в него 10 мл раствора для гибридизации (0,5 М динатрийгидрофосфата (рН 7,2), 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты и 7% лаурилсульфата натрия). Осуществляют предварительную гибридизацию при 42 С в течение 30 мин. Денатурируют тепловой обработкой 10 мкл раствора, содержащего avium-зонд или intracellulare-зонд в концентрации 100 нг/мкл, и добавляют в реакционную систему для предварительной гибридизации. После гибридизации при 42 С в течение 60 мин мембрану дважды промывают при комнатной температуре в течение 5 мин в растворе, содержащем 66,6 мМ хлорида натрия, 66,6 мМ гидрата тринатрийцитрата и 0,1% лаурилсульфата натрия. Мембрану инкубируют при 42 С в течение 12 мин в смеси, полученной путем добавления 2 мкл раствора, содержащего конъюгат стрептавидина и пероксидазы из хрена (Pierce) в концентрации 5 мг/мл, к 6 мл буфера для промывки (0,3 М хлорида натрия, 17,3 мМ дигидрата дигидрофосфатат натрия, 2,5 мМ ЭДТК и 0,1% лаурилсульфата натрия). Мембрану дважды промывают в буфере для промывки при комнатной температуре, а затем 10 мл 0,1 М нитратного буфера (рН 5,0) при комнатной температуре и вводят во взаимодействие в темноте в течение примерно 10 мин в смеси 5 мл 0,1 М нитратного буфера, 5 мкл 3% пероксида водорода и 250 мкл раствора, содержащего тетраметилбензидин (ТМВ, Nacalai Tesque) в этаноле в коцентрации 2 мг/мл. После появления окраски реакцию прекращают с помощью деионизованной воды. В результате сигнал для продукта амплификации от положительного контроля в случае М. avium можно наблюдать только с использованием avium-зонда, меченного по 5'-концу биотином, и сигнал нельзя наблюдать с использованием intracellulare-зонда, меченного по 5'-концу биотином. С другой стороны, сигнал для продукта амплификации от положительного контроля в случае М. intracellulare можно наблюдать только с использованием intracellulare-зонда, меченного по 5'-концу биотином, и сигнал нельзя наблюдать с использованием avium-зонда, меченного по 5'-концу биотином. На основании таких результатов подтверждается, что с использованием указанных зондов М. avium можно отличить от М. intracellulare. Пример 6. Проверяют детекцию gonococcus с использованием способа настоящего изобретения. Согласно способу, описанному в примере 5, получают фрагменты в 560 п.о., амплифицированные из гена СррВ Neisseria(M.NgoMIII) Neisseria gonorrhoeae с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NOS: 34-37. Подобным способом амплифицируют фрагмент в 490 п.о. из гена цитозинспецифической метилтрансферазы N4 Neisseria gonorrhoeae, используя десять 67-мерных синтетических праймеров. Продукты амплификации встраивают в вектор рТ 7 Blue Т и конструируют положительные контроли А, В, С и D. Синтезируют праймеры NEI-5103, NEI-5150, CppB-F1, CppB-F2, СррВ-F3, СррВ-R1, CppB-R2,CppB-R3, pJDB F-1, pJDB F-2, pJDB R-1, pJDB R-2, pJDB R-3, M.Ngo F-1, M.Ngo F-2, M.Ngo F-3, M.NgoR-1, M.Ngo R-2, M.Ngo R-3, M.Ngo R-4, цитозин-F-l, цитозин-F-2, цитозин-F-3, цитозин R-1, цитозин-R2, цитозин-R-3, pJDB10F и pJDB10R, имеющие нуклеотидные последовательности SEQ ID NOS: 38-63 и 164-165. Осуществляют реакции ICAN в условиях, описанных в примере 5, с использованием 106 копий положительного контроля В как матрицы и пары праймеров NEI-5103 и NEI-5150. В результате после электрофореза в агарозном геле наблюдают амплифицированные фрагменты в 69 п.о. с использованием любой РНКазы Н. Амплифицированные фрагменты наносят каплями на нейлоновую мембрану и осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга, как описано в примере 5, с использованием зонда NEI- 23006679 5130 (SEQ ID NO: 64), меченного по 5'-концу биотином. В результате наблюдают сигналы, представляющие интерес. Подобным образом осуществляют реакции ICAN в условиях, описанных в примере 5, с использованием 106 копий положительного контроля А как матрицы, а также пары праймеров CppB-F1 и CppB-R1,CppB-F1 и CppB-R2, CppB-F1 и CppB-R3, CppB-F2 и CppB-R1, CppB-F2 и CppB-R2, CppB-F2 и CppB-R3,CppB-F3 и CppB-R1, CppB-F3 и CppB-R2 или CppB-F3 и CppB-R3. Во всех случаях после электрофореза в агарозном геле наблюдают амплифицированные фрагменты в 60 п.о., представляющие интерес. Осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга, как описано в примере 5, с использованием зонда-1NEI-CppB (SEQ ID NO: 65), меченного по 5'-концу биотином. В результате наблюдают сигналы, представляющие интерес. Осуществляют реакции ICAN в условиях, описанных в примере 5, с использованием 106 копий положительного контроля А как матрицы, а также пары праймеров pJDB F-1 и pJDB R-1, pJDB F-1 и pJDBR-2, pJDB F-1 и pJDB R-3, pJDB F-2 и pJDB R-1, pJDB F-2 и pJDB R-2 или pJDB F-2 и pJDB R-3. Во всех случаях после электрофореза в агарозном геле наблюдают амплифицированные фрагменты в 91 п.о.,представляющие интерес. Осуществляют реакции ICAN в условиях, описанных в примере 5, с использованием пары праймеров pJDB10F и pJDB10R. После электрофореза в агарозном геле наблюдают амплифицированные фрагменты в 71 п.о., представляющие интерес, с использованием любой РНКазы Н. Амплифицированные фрагменты наносят каплями на нейлоновую мембрану и осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга, как описано в примере 5, с использованием зонда-2 NEI-CppB (SEQ ID NO: 66),меченного по 5'-концу биотином. В результате наблюдают сигналы, представляющие интерес. Подобным образом осуществляют реакции ICAN в условиях, описанных в примере 5, с использованием 106 копий положительного контроля С как матрицы, а также пары праймеров M.Ngo F-1 и M.NgoR-1, M.Ngo F-1 и M.Ngo R-2, M.Ngo F-1 и M.Ngo R-3, M.Ngo F-1 и M.Ngo R-4, M.Ngo F-2 и M.Ngo R-1,M.Ngo F-2 и M.Ngo R-2, M.Ngo F-2 и M.Ngo R-3, M.Ngo F-2 и M.Ngo R-4, M.Ngo F-3 и M.Ngo R-1,M.Ngo F-3 и M.Ngo R-2, M.Ngo F-3 и M.Ngo R-3 или M.Ngo F-3 и M.Ngo R-4. Во всех случаях после электрофореза в агарозном геле наблюдают амплифицированные фрагменты в 60 п.о., представляющие интерес. Осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга с использованием M.Ngo-зонда (SEQ IDNO: 67), меченного по 5'-концу биотином. В результате наблюдают сигналы, представляющие интерес. Кроме того, осуществляют реакции ICAN в условиях, описанных в примере 5, с использованием 106 копий положительного контроля D как матрицы, а также пары праймеров цитозин-F-1 и цитозин-R-1,цитозин-F-1 и цитозин-R-2, цитозин-F-1 и цитозин-R-3, цитозин-F-2 и цитозин-R-1, цитозин-F-2 и цитозин-R-2, цитозин-F-2 и цитозин-R-3, цитозин-F-3 и цитозин-R-1, цитозин-F-3 и цитозин-R-2 или цитозинF-3 и цитозин-R-3. Во всех случаях после электрофореза в агарозном геле наблюдают амплифицированные фрагменты в 70 п.о., представляющие интерес. Осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга с использованием цитозин-зонда (SEQ ID NO: 68), меченного по 5'-концу биотином. В результате наблюдают сигналы, представляющие интерес. Пример 7. Проверяют детекцию вируса гепатита В человека (HBV) с использованием способа настоящего изобретения. Конкретно, части гена белка Х HBV в 560 п.о., представленные SEQ ID NOS: 69 и 70, амплифицируют согласно способу, описанному в примере 5, встраивают в вектор рТ 7 Blue Т и используют в качестве HBV-положительного контроля 1-Т и HBV-положительного контроля 1-G. Синтезируют праймеры HBV-F-1, HBV-F-2, HBV-F-3, HBV-F-4, HBV-R-1, HBV-R-2, HBV-R-3 и HBV-R-4, имеющие нуклеотидные последовательности SEQ ID NOS: 71-78. Осуществляют реакции ICAN в условиях, описанных в примере 5, с использованием 106 копий HBV-положительного контроля 1-G или HBVположительного контроля 1-Т как матрицы, а также пары праймеров HBV-F-1 и HBV-R-1, HBV-F-1 иHBV-R-2, HBV-F-2 и HBV-R-1 или HBV-F-2 и HBV-R-2. После электрофореза в агарозном геле наблюдают представляющие интерес амплифицированные фрагменты в 81, 76, 76 и 71 п.о. Осуществляют реакции ICAN в условиях, описанных в примере 5, с использованием 106 копийHBV-положительного контроля 1-Т или 1-G как матрицы, а также пары праймеров HBV-F-3 и HBV-R-3,HBV-F-3 и HBV-R-4, HBV-F-4 и HBV-R-3 или HBV-F-4 и HBV-R-4. После электрофореза в агарозном геле наблюдают представляющие интерес амплифицированные фрагменты в 84, 79, 78 и 73 п.о. Амплифицированные фрагменты, полученные с использованием пар праймеров HBV-F-1 и HBV-R-1, HBV-F-1 и HBV-R-2, HBV-F-2 и HBV-R-1 и HBV-F-2 и HBV-R-2, наносят каплями на нейлоновую мембрану и осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга с использованием HBV-зонда 1 (SEQ ID NO: 79),меченного по 5'-концу биотином. В результате наблюдают сигналы, представляющие интерес. Подобным образом, амплифицированные фрагменты, полученные с использованием пар праймеров HBV-F-3 иHBV-R-3, HBV-F-3 и HBV-R-4, HBV-F-4 и HBV-R-3 и HBV-F-4 и HBV-R-4, подвергают гибридизации методом дот-блоттинга с использованием HBV-зонда 2 (SEQ ID NO: 80), меченного по 5'-концу биотином. В результате наблюдают сигналы, представляющие интерес. Пример 8. Проверяют детекцию HCV с использованием способа настоящего изобретения. Получают реакционные смеси в конечном объеме 50 мкл, содержащие в конечных концентрациях 32 мМ HEPES-гидрок- 24006679 сидкалиевого буфера (рН 7,8), 100 мМ ацетата калия, 1% диметилсульфоксида, 0,01% BSA, 4 мМ ацетата магния, 500 мкМ каждого из dNTPs, 50 пмоль каждого из праймеров HCV-A2-S и HCV-A2-A, HCV-A4-S и HCV-A4-A, HCV-A4-S19 и HCV-A4-A19, HCV-F1 и HCV-R1 или HCV-F2 и HCV-R2 (SEQ ID NOS: 8186 и 88-89), 20 Е РНКазы НII из Afu или 4 Е РНКазы Н из Til, 4 Е ДНК-полимеразы BcaBEST, 20 Е ингибитора РНКазы, 1,25 Е ревертазы XL из AMV и 106 копий транскрипта РНК, описанного в примере 2-(2),в качестве матрицы. Реакционные смеси помещают в термоячейку Personal, установленую на 53 С, и инкубируют в течение 60 мин. После реакции по 3 мкл каждой реакционной смеси подвергают электрофорезу в 3,0% агарозном геле. В результате наблюдают представляющие интерес амплифицированные фрагменты в 74, 76, 78, 61 и 61 п.о. с использованием любой РНКазы Н. Осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга амплифицированных фрагментов, полученных с использованим пар праймеровHCV-C (SEQ ID NO: 87), меченного по 5'-концу биотином. В результате наблюдают сигналы, представляющие интерес. Подобным образом осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга амплифицированных фрагментов, полученных с использованим пар праймеров HCV-F1 и HCV-R1 и HCV-F2 иHCV-R2 с использованием зонда HCV-D (SEQ ID NO: 92), меченного по 5'-концу биотином. В результате наблюдают сигналы, представляющие интерес. Пример 9. Проверяют применение способа настоящего изобретения в способе одностадийной амплификацииRT-ICAN. В качестве объекта выбирают ВИЧ.(1) Получение транскрибированной ДНК. Получают транскрибированную РНК как матрицу. Плазмиду (АТСС 40829), в которую встраиваютgag-участка ВИЧ, получают с использованием указанной плазмиды в качестве матрицы, пары праймеровSP6-HTV-F (SEQ ID NO: 93) и HTV-R (SEQ ID NO: 94) и ДНК-полимеразы Ex Taq. Транскрибированную РНК синтезируют с использованием продукта ПЦР-амплификации как матрицы и Competitive RNATranscription Kit (Takara Shuzo) согласно инструкциям, прилагаемым к набору. РНК используют в качестве РНК-матрицы для проверки одностадийной RT-ICAN.(2) Проверка праймера для детекции ВИЧ с использованием одностадийной RT-ICAN. Синтезируют праймеры HIV-F1, HIV-F2, HIV-F3, HIV-F4, HIV-R1, HIV-R2, HIV-R3, HIV-R4 иHTV-R4M, имеющие нуклеотидные последовательности SEQ ID NOS: 95-103. Реакции осуществляют следующим образом. Коротко, получают реакционные смеси в конечном объеме 25 мкл, содержащие, в конечных концентрациях 32 мМ HEPES-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 100 мМ ацетата калия, 1% ДМСО, 0,01% BSA, 7 мМ ацетата магния, 500 мкМ каждого из dNTPs, 2,2 Е РНКазы НII из Afu или 4 Е РНКазы Н из Tli, 5,5 Е ДНК-полимеразы BcaBEST, 0,625 Е ревертазы XL из AMV и 106 копий транскрибированной РНК, а также 25 пмоль каждого из предшествующего и последующего праймеров. Реакционные смеси помещают в термоячейку, установленную на 55 С, и инкубируют в течение 60 мин. После электрофореза в агарозном геле наблюдают представляющие интерес амплифицированные фрагменты в 100, 74, 76, 72, 72, 72, 74, 70, 70, 76, 78, 74 и 74 п.о. с использованием любой РНКазы Н и пары праймеров HIV-F1 и HIV-R1, HIV-F2 и HIV-R2, HIV-F2 и HIV-R3, HIV-F2 и HIV-R4, HIV-F2 и HIV-R4M, HIVF3 и HIV-R2 , HIV-F3 и HIV-R3, HIV-F3 и HIV-R4, HIV-F3 и HIV-R4M, HIV-F4 и HIV-R2, HIV-F4 и HIVR3, HIV-F4 и HIV-R4 и HIV-F4 и HIV-R4M. Осуществляют гибридизацию амплифицированных фрагментов методом дот-блоттинга с использованием зонда HTV-A (SEQ ID NO: 104) или зонда HIV-B (SEQID NO: 105), каждый из которых мечен по 5'-концу биотином. В результате сигнал, представляющий интерес, наблюдают для продукта амплификации, полученного с использованием пары праймеров HIV-F1 и HIV-R1, в случае зонда HTV-A, меченного по 5'-концу биотином, и сигналы, представляющие интерес,наблюдают для продуктов амплификации, полученных с использованием пар праймеров HIV-F2 и HIVR2, HIV-F2 и HIV-R3, HIV-F2 и HIV-R4, HIV-F2 и HIV-R4M, HIV-F3 и HIV-R2, HIV-F3 и HIV-R3, HIVF3 и HIV-R4, HIV-F3 и HIV-R4M, HIV-F4 и HIV-R2, HIV-F4 и HIV-R3, HIV-F4 и HIV-R4 и HIV-F4 иHIV-R4M, в случае зонда HTV-B, меченного по 5'-концу биотином. Пример 10. Проверяют детекцию Staphylococcus aureus с использованием способа настоящего изобретения. Представляющий интерес участок для амплификации выбирают из гена коагулазы Staphylococcus aureus. Сначала получают продукт амплификации в 221 п.о., осуществляя ПЦР с использованием праймеровcoa-PCR-F (SEQ ID NO: 106) и coa-PCR-R (SEQ ID NO: 107), генома Staphylococcus aureus в качестве матрицы и ДНК-полимеразы Ех Taq. Положительный контроль для соа-гена получают, встраивая амплифицированный фрагмент в вектор рТ 7 Blue Т. Синтезируют праймеры coa-F1, coa-F2, coa-F3, coa-F4, coa-F5, coa-R1, coa-R2, coa-R3, coa-R4 и coaR5, имеющие нуклеотидные последовательности SEQ ID NOS: 108-117. Осществляют реакции ICAN в условиях, описанных в примере 5, с использованием 106 копий положительного контроля для соа-гена в качестве матрицы и пары праймеров coa-F1 и coa-R1, coa-F1 и coa-R2, coa-F2 и coa-R1, coa-F2 и coa-R2,coa-F3 и coa-R3, coa-F3 и coa-R4, coa-F3 и coa-R5, соа-F4 и coa-R3, coa-F4 и coa-R4, coa-F4 и coa-R5, coaF5 и coa-R3, coa-F5 и coa-R4 или coa-F5 и coa-R5. В результате после электрофореза в агарозном геле- 25006679 наблюдают представляющие интерес амплифицированные фрагменты в 59, 69, 75, 85, 95, 101, 98, 89, 95,92, 107, 113 и 110 п.о. с использованием любой РНКазы Н. Осуществляют гибридизацию методом дотблоттинга продуктов амплификации, полученных с использованием пар праймеров coa-F1 и coa-R1, coaF1 и coa-R2, coa-F2 и coa-R1 и coa-F2 и coa-R2, согласно способу, описанному в примере 5, с использованием зонда соа-А (SEQ ID NO: 118), меченного по 5'-концу биотином. В результате для всех пятен наблюдают сигналы, представляющие интерес. Подобным образом, осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга продуктов амплификации, полученных с использованием пар праймеров coa-F3 и coa-R3,соа-F3 и coa-R4, coa-F3 и coa-R5, coa-F4 и coa-R3, coa-F4 и coa-R4, coa-F4 и coa-R5, coa-F5 и coa-R3, coaF5 и coa-R4 и coa-F5 и coa-R5, согласно способу, описанному в примере 5, с использованием зонда соа-В(SEQ ID NO: 119), меченного по 5'-концу биотином. В результате для всех пятен наблюдают сигналы,представляющие интерес. Пример 11.(1) Проверяют детекцию chlamydia с использованием способа настоящего изобретения. Позитивный контроль для chlamydia получают путем встраивания амплифицированного фрагмента в 560 п.о., соответствующего части гена chlamydia (SEQ ID NO: 120), в вектор рТ 7 Blue Т согласно способу, описанному в примере 5. Синтезируют праймеры CT-FB19, CT-FB19-3, CT-FB-19-3-21, CT-FB19-3-23, CT-RB21, CTRB23-2 и CT-RB23-2-24, имеющие нуклеотидные последовательности SEQ ID NOS: 121-127. Осуществляют реакции ICAN в условиях, описанных в примере 5, с использованием 106 копий хламидийположительного контроля как матрицы и пары праймеров CT-FB19 и СТ-RB21, CT-FB19 и CT-RB23-2, CTFB19-3 и CT-RB21, CT-FB19-3 и CT-RB23-2, CT-FB19-3 и CT-RB23-2-24, CT-FB19-3-21 и CT-RB23-2,CT-FB19-3-21 и CT-RB23-2-24, CT-FB19-3-23 и CT-RB23-2 или CT-FB19-3-23 и CT-RB23-2-24. В результате после электрофореза в агарозном геле наблюдают представляющие интерес амплифицированные фрагменты в 125, 116, 116, 107, 107, 107, 107, 107 и 107 п.о. с использованием любой РНКазы Н. Осуществляют гибридизацию амплифицированных фрагментов методом дот-блоттинга согласно способу, описанному в примере 5, с использованием СТ-зонда (SEQ ID NO: 128), меченного по 5'-концу биотином. В результате для всех пятен наблюдают сигналы, представляющие интерес.(2) Проверяют детекцию chlamydia с использованием в качестве мишени другого участка. Позитивный контроль для chlamydia 2 получают путем встраивания амплифицированного фрагмента в 560 п.о.,соответствующего части критического гена chlamydia (SEQ ID NO: 129), в вектор рТ 7 Blue Т согласно способу, описанному выше в (1). Синтезируют праймеры CT-F1212-20, СТ- F1212-21, СТ- F1212-22, CTR1272-20, СТ-R1272-21, CT-R1272-22, CT-F1215-4R-22 и CT-R1267-3R-18, имеющие нуклеотидные последовательности (SEQ ID NOS: 130-135 и 166-167). Осуществляют реакции ICAN в условиях, описанных выше в (1), с использованием 106 копий хламидийположительного контроля 2 как матрицы и пары праймеров CT-F1212-20 и CT-R1272-20, CT-F1212-20 и CT-R1272-21, CT-F1212-20 и CT-R1272-22, СТF1212-21 и CT-R1272-20, СТ- F1212-21 и CT-R1272-21, СТ- F1212-21 и CT-R1272-22, СТ- F1212-22 и CTR1272-20, СТ- F1212-22 и CT-R1272-21 или СТ- F1212-22 и CT-R1272-22. В результате после электрофореза в агарозном геле наблюдают представляющие интерес продукты амплификации в 61 п.о. с использованием любой РНКазы Н во всех случаях. Осуществляют гибридизацию амплифицированных фрагментов методом дот-блоттинга согласно способу, описанному в примере 5, с использованием зонда СТ 1234 (SEQ ID NO: 136), меченного по 5'-концу биотином. В результате для всех пятен наблюдают сигналы, представляющие интерес. Кроме того, осуществляют реакции ICAN с использованием пары праймеров СТ-F1215-R4-22 и CT-R1267-3R-18. В результате после электрофореза в агарозном геле наблюдают представляющие интерес продукты амплификации в 53 п.о. с использованием любой РНКазы Н. Осуществляют гибридизацию амплифицированных фрагментов методом дот-блоттинга согласно способу, описанному в примере 5, с использованием зонда СТ-1236 (SEQ ID NO: 168), меченного по 5'-концу биотином. В результате для всех пятен наблюдают сигналы, представляющие интерес. Пример 12. Проверяют детекцию Mycoplasma pneumoniae с использованием способа настоящего изобретения. Положительный контроль А для Mycoplasma pneumoniae и положительный контроль В для Mycoplasmapneumoniae получают путем встраивания амплифицированного фрагмента в 560 п.о., соответствующего частям гена-оперона аденозинтрифосфотазы Mycoplasma pneumoniae (SEQ ID NOS: 137 и 138), в вектор рТ 7 Blue Т согласно способу, описанному в примере 5. Синтезируют праймеры Мусо-140, Мусо-140-22,Мусо-706, MPF-910, Мусо-190, Мусо-190-22. Мусо-850 и MPR-1016, имеющие нуклеотидные последовательности SEQ ID NOS: 139-146. Осуществляют реакции ICAN в условиях, описанных в примере 5, с использованием 106 копий положительного контроля А для Mycoplasma pneumoniae как матрицы и пары праймеров Мусо-140 и Мусо-190, Мусо-140-22 и Мусо-190, Мусо-140-22 и Мусо-190-22 или Мусо-140 и Мусо-190-22. В результате после электрофореза в агарозном геле наблюдают представляющие интерес амплифицированные фрагменты в 63 п.о. с использованием любой РНКазы Н во всех случаях. Осуществляют реакции ICAN в условиях, описанных в примере 5, с использованием 106 копий положительного контроля А для Mycoplasma pneumoniae как матрицы и пары праймеров Мусо-706 и Мусо-850 или MPF910 и MPR-1016. В результате после электрофореза в агарозном геле наблюдают представляющие интерес амплифицированные фрагменты в 85 и 107 п.о. с использованием любой РНКазы Н. Осуществляют- 26006679 гибридизацию методом дот-блоттинга амплифицированных фрагментов, полученных с использованием пар праймеров Мусо-140 и Мусо-190, Мусо-140-22 и Мусо-190, Мусо-140-22 и Мусо-190-22 и Мусо-140 и Мусо-190-22, согласно способу, описанному в примере 5, с использованием зонда Мусо-170 (SEQ IDNO: 147), меченого по 5'-концу биотином. В результате для всех пятен наблюдают сигналы, представляющие интерес. Подобным образом осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга амплифицированных фрагментов, полученных с использованием пары праймеров Мусо-706 и Мусо-850, с использованием зонда Мусо-730 (SEQ Ш NO: 148), меченого по 5'-концу биотином. В результате наблюдают сигнал, представляющий интерес. Кроме того, осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга амплифицированных фрагментов, полученных с использованием пары праймеров MPF-910 и MPR-1016, с использованием зонда Мусо-952 (SEQ ГО NO: 149), меченого по 5'-концу биотином. В результате наблюдают сигнал, представляющий интерес. Пример 13. Проверяют детекцию устойчивого к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA) с использованием способа настоящего изобретения. Выбирают из МесА-гена участок для ампплификации, представляющий интерес. Положительные контроли А и В для МесА получают путем встраивания амплифицированных фрагментов в 560 п.о., соответствующих частям МесА-гена МесА-А и МесА-В (SEQ ID NOS: 150 и 151), в вектор рТ 7 Blue Т согласно способу, описанному в примере 5. Синтезируют праймеры MecA-S525, МесА-А 611, MecA-S1281 и МесА-А 1341, имеющие нуклеотидные последовательности SEQ ID NOS: 152-155. Осуществляют реакции ICAN в условиях, описанных в примере 5, с использованием 106 копий положительного контроля А для МесА как матрицы и пары праймеров MecA-S525 и МесА-А 611, или 106 копий положительного контроля В для МесА как матрицы и пары праймеров MecA-S1281 и МесА-А 1341. В результате после электрофореза в агарозном геле наблюдают амплифицированные фрагменты в 106 и 83 п.о. с использованием любой РНКазы Н. Реакционную смесь для ICAN (1 мкл), для которой амплифицированный фрагмент получают с использованием пары праймеров MecA-S525 и МесА-А 611, наносят каплями на нейлоновую мембрануHybond-N и осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга согласно способу, описанному в примере 5, с использованием зонда МесА-А (SEQ ID NO: 156), меченного по 5'-концу биотином. Кроме того,подобным образом амплифицированный фрагмент, полученный с использованием пары праймеровMecA-S1281 и МесА-А 1341, наносят каплями на нейлоновую мембрану и осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга с использованием зонда МесА-В (SEQ ID NO: 157), меченного по 5'-концу биотином. В результате наблюдают сигналы при использовании обоих зондов, подтверждающие амплификацию участков, представляющих интерес. Пример 14. Проверяют РНКазу Н, которую можно использовать в способе настоящего изобретения.(1) Синтезируют праймеры pDON-AI-1 (22) и pDON-AI-2 (23), имеющие нуклеотидные последовательности SEQ ID NOS: 158 и 159, на основе нуклеотидной последовательности упаковывающего участка в векторе-плазмиде pDON-AI (Takara Shuzo). Реакционные смеси общим объемом в 25 мкл каждая,содержащие 1 мкл раствора, содержащего 10 фг ДНК pDON-AI или воды для отрицательного контроля,100 пмоль каждого из праймеров, 0,5 мМ каждого из dNTPs, 32 мМ HEPES-гидроксидкалиевого буфераAfu, 4,69, 2,34, 1,17, 0,59, 0,29, 0,15 или 0,07 Е РНКазы НII из Pfu или 14, 7, 3,5, 1,75, 0,875 или 0,438 Е РНКазы НII из Pho, инкубируют при 64 С в течение 1 ч в термоячейке. По завершении реакции 5 мкл каждой реакционной смеси анализируют с использованием электрофореза в 3,0% агарозном геле. В результате наблюдают представляющие интерес продукты амплификации с использованием РНКазы НII изAfu несмотря на величину единицы. Кроме того, представляющие интерес продукты амплификации наблюдают с использованием 0,59-4,69 Е РНКазы НII из Pfu или 1,75-14 Е РНКазы НII из Pho. На основании таких результатов подтверждается, что все теплоустойчивые РНКазы НII можно предпочтительно использовать в способе настоящего изобретения.(2) Реакционную смесь общим объемом 50 мкл, содержащую 50 пмоль каждого из праймеров,имеющих нуклеотидные последовательности SEQ ID NOS: 160 и 161, синтезированные на основе нуклеотидной последовательности мРНК для мышиной индуцируемой NO синтазы (iNOS), 1 мкл кДНК,полученной согласно обычному способу из коммерчески доступных мышиных клеток (соответствующей 50 нг РНК), 5 мкл 10 х буфера Ex Taq (Takara Shuzo), 1,25 Е ДНК-полимеразы TaKaRa Ex Taq (TakaraShuzo) и 0,2 мМ каждого из dNTPs, вводят в реакцию с использованием термоячейки. Программа следующая: 1 цикл - 94 С в течение 2 мин; 30 циклов - 94 С в течение 30 с, 55 С в течение 30 с и 72 С в течение 30 с; и 1 цикл - 72 С в течение 5 мин. ПЦР-амплифицированный фрагмент из мышиной кДНКiNOS клонируют в плазмидный вектор рТ 7 Blue T (Novagen), который используют в качестве матрицы для способа настоящего изобретения. Реакционные смеси общим объемом в 25 мкл каждая, содержащие 1 мкл раствора, содержащего 10 фг плазмидной ДНК как матрицы или 1 мл воды для отрицательного контроля, 100 пмоль каждого из праймеров NS5 (SEQ ID NO: 9) и NS6 (SEQ ID NO: 10), 0,5 мМ каждого- 27006679 из dNTPs, 32 мМ HEPES-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 100 мМ ацетата калия, 4,0 мМ ацетата магния, 0,01% бычьего сывороточного альбумина, 1,0% диметилсульфоксида, 2,64 Е ДНК-полимеразы Вса и 10, 5, 2,5, 1,25, 0,125 Е РНКазы НII из Methanococcus jannashi (Mja), РНКазы НII из Tce или РНКазы НII из Tli, инкубируют при 62 С в течение 1 ч в термоячейке. РНКазу НII из Mja получают согласно способу, описанному в Structure, 8:897-904. По завершении реакции 5 мкл каждой реакционной смеси анализируют с использованием электрофореза в 3,0% агарозном геле. Результаты показаны на фиг. 7. Фиг. 7 представляет собой фигуру, показывающую электрофорез в агарозном геле продуктов амплификации, полученных с использованием трех типов РНКазы Н. Фиг. 7 (А, В и С) представляет результаты,полученные с использованием РНКазы НII из Methanococcus jannashi, РНКазы НII из Thermococcus celer и РНКазы НII из Thermococcus litoralis, соответственно. Полоса 1: 10 Е РНКазы НII; полоса 2:10 Е РНКазы НII, отрицательный контроль; полоса 3: 5 Е РНКазы НII; полоса 4: 5 Е РНКазы НII, отрицательный контроль; полоса 5: 2,5 Е РНКазы НII; полоса 6: 2,5 Е РНКазы НII, отрицательный контроль; полоса 7: 1,25 Е РНКазы НII; полоса 8: 1,25 Е РНКазы НII, отрицательный контроль; полоса 9: 0,25 Е РНКазы НII; полоса 10: 0,25 Е РНКазы НII, отрицательный контроль; полоса 11: 0,125 Е РНКазы НII; и полоса 12: 0,125 Е РНКазы НII, отрицательный контроль. Как видно из фиг. 7, представляющие интерес продукты амплификации наблюдают с использованием 0,125-10 Е РНКазы НII из Methanococcus jannashi, 1-5 Е РНКазы НII из Тсе или 0,125-5 Е РНКазы НII из Тli. На основании таких результатов подтверждается, что все теплоустойчивые РНКазы НII можно предпочтительно использовать в способе настоящего изобретения.(3) Способ настоящего изобретения также проверяют в условиях реакции, описанных в примере 5,за исключением того, что используют другие тип и количество РНКазы Н. В качестве РНКазы Н используют 1 Е РНКазы НII из Thermococcus litoralis или 8,75 Е Е РНКазы НII из Thermococcus celer. Реакции амплификации осуществляют с использованием 106 копий HBV-положительного контроля 1-Т как матрицы, а также пары праймеров HBV-F-2 и HBV-R-1, полученных в примере 7. В результате после электрофореза в агарозном геле наблюдают амплифицированные фрагменты в 76 п.о. с использованием любой РНКазы Н. На основании таких результатов подтверждается, что обе РНКазы НII можно предпочтительно использовать согласно настоящему изобретению. Пример 15. Проверяют способ детекции настоящего изобретения с использованием реакционной системы, содержащей внутренний стандарт. Сначала получают внутренний стандарт для Mycobacterium tuberculosis согласно способу, описанному в примере 5. Продукт амплификации в 169 п.о., имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 169, получают с использованием ДНК-полимеразы Ex Taq для реакции достраивания с последующей ПНР с использованием четырех 60-мерных синтетических праймеров согласно способу, описанному в BioTechniques, 9(3):298-300 (1990). Продукт амплификации встраивают в вектор рТ 7 Blue Т с использованием набора DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Bio). Смесь для лигирования используют для трансформации Е. coli JM109. Полученную плазмиду используют в качестве внутреннего стандарта для Mycobacterium tuberculosis. Синтезируют MTIS2F16 и MTIS2RAAC, имеющие нуклеотидные последовательности SEQ ID NOS: 170 и 171. Длина участка, амплифицированного с использованием пары праймеров, включая праймерные части, составляет 98 п.о. Реакции осуществляют следующим образом. Получают реакционные смеси в конечном объеме 25 мкл,содержащие в конечных концентрациях 32 мМ HEPES-гидроксидкалиевого буфера (рН 7,8), 100 мМ ацетата калия, 1% ДМСО, 0,01% BSA, 0,1% пропилендиамина, 4 мМ ацетата магния, 500 мкМ каждого изdNTPs, 25 пмоль каждого из праймеров MTIS2F16 и MTIS2RAAC, 103 копий внутреннего стандарта дляBcaBEST, 1 мкл матрицы и стерильную воду. В качестве матрицы используют 0,1 или 10 пг геномной ДНК БЦЖ, которую использовали в примере 1. Реакционные смеси помещают в термоячейку Personal,установленую на 60 С, и инкубируют в течение 60 мин. Образцы, полученные после реакций ICAN, наносят каплями на нейлоновую мембрану и осуществляют гибридизацию методом дот-блоттинга согласно способу, описанному в примере 5, с использованием зонда для детекции Mycobacterium tuberculosisMTIS-S-PROBE (SEQ ID NO: 172), меченного по 5'-концу биотином, или зонда для детекции внутреннего стандарта INTER-PROBE (SEQ ID NO: 173), меченного по 5'-концу биотином. В результате, когда наносят образцы, полученные после реакций ICAN без добавления геномной ДНК БЦЖ, с использованиемMTIS-S-PROBE сигнала не наблюдают, в то время как сигналы наблюдают при использовании INTERPROBE. Когда наносят образцы, полученные после реакций ICAN с добавлением 1 пг геномной ДНК БЦЖ, сигналы наблюдают при использовании как MTIS-S-PROBE, так и INTER-PROBE. Когда наносят образцы, полученные после реакций ICAN с добавлением 10 пг геномной ДНК БЦЖ, сигналы наблюдают при использовании MTIS-S-PROBE, но сигнал не наблюдают при использовании INTER-PROBE. Такие результаты подтверждают, что сигнал наблюдается с использованием MTIS-S-PROBE, если в качестве мишени амплифицируют геномную ДНК БЦЖ, в то время как с использованием INTER-PROBE сигнал наблюдается, если амплифицируют внутренний стандарт. Таким образом, подтверждается, что по способу настоящего изобретения нуклеиновую кислоту-мишень можно специфически детектировать даже в присутствии внутреннего стандарта.- 28006679 Промышленная применимость Настоящее изобретение относится к способу стабилизации и длительного хранения реагента для реакции в способе амплификации нуклеиновой кислоты-мишени, при котором подходящий для специфической амплификации участок в нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени амплифицируют реакцией синтеза ДНК с использованием химерного олигонуклеотидного праймера, или способа детекции нуклеиновой кислоты-мишени, включающего стадию детекции фрагмента, амплифицированного из нуклеиновой кислоты-мишени, полученного указанным способом амплификации. Настоящее изобретение также относится к способу детекции нуклеиновой кислоты-мишени, который используют для высокочувствительной и специфической детекции или количественного определения микроорганизма (в частности, патогенного микроорганизма), такого как вирус, бактерия, гриб или дрожжи, а также к химерному олигонуклеотидному праймеру и зонду для такого способа. Список последовательностейSEQ ID NO: 1: олигонуклеотидный праймер, названный "pUC19 выше 150", сконструированный для амплификации части плазмиды pUC19.SEQ ID NO: 2: олигонуклеотидный праймер, названный "pUC19 ниже NN", сконструированный для амплификации части плазмиды pUC19.SEQ ID NO: 3: олигонуклеотидный праймер, названный MCS-F, сконструированный для амплификации длинного фрагмента ДНК.SEQ ID NO: 4: олигонуклеотидный праймер, названный MCS-R, сконструированный для амплификации длинного фрагмента ДНК.SEQ ID NO: 5: олигонуклеотидный праймер, названный MF2, сконструированный для амплификации части ДНК плазмиды pUC19.SEQ ID NO: 6: олигонуклеотидный праймер, названный MR1, созданный для амплификации части ДНК плазмиды pUC19.SEQ ID NO: 7: химерный олигонуклеотидный праймер, названный K-F-1033-2, сконструированный для амплификации части ДНК Mycobacterium tuberculosis. "Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 8: химерный олигонуклеотидный праймер, названный K-R-1133-2, сконструированный для амплификации части ДНК Mycobacterium tuberculosis. "Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 9: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации части последовательности, кодирующей INOS от мыши. "Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 10: химерный олигонуклеотидный праймер, сконструированный для амплификации части последовательности, кодирующей INOS от мыши. "Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 11: олигонуклеотидный зонд, названный MTIS, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть последовательности Mycobacterium tuberculosis.SEQ ID NO: 12: олигонуклеотидный зонд, названный MTIS-2, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть последовательности Mycobacterium tuberculosis.SEQ ID NO: 13: олигонуклеотидный праймер, названный SP6-HCV-F, сконструированный для амплификации части HCV.SEQ ID NO: 14: олигонуклеотидный праймер, названный T7-HCV-R, сконструированный для амплификации части HCV.SEQ ID NO: 15: химерный олигонуклеотидный праймер, названный HCV-A2-S, сконструированный для амплификации части HCV. "Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 16: химерный олигонуклеотидный праймер, названный HCV-A2-A, сконструированный для амплификации части HCV. "Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 17: химерный олигонуклеотидный праймер, названный CT2F, сконструированный для амплификации части ДНК криптической плазмиды Chlamydia trachomatis . "Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 18: химерный олигонуклеотидный праймер, названный CT2R, сконструированный для амплификации части ДНК криптической плазмиды Chlamydia trachomatis. "Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 19: химерный олигонуклеотидный праймер, названный CT-FB19-3, сконструированный для амплификации части ДНК криптической плазмиды Chlamydia trachomatis. "Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 20: химерный олигонуклеотидный праймер, названный CT-RB23-2, сконструированный для амплификации части ДНК криптической плазмиды Chlamydia trachomatis. "Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 21: химерный олигонуклеотидный праймер, названный K-F-1033(68), сконструированный для амплификации части ДНК Mycobacterium tuberculosis. "Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 22: химерный олигонуклеотидный праймер, названный K-R-1133(68), сконструированный для амплификации части ДНК Mycobacterium tuberculosis. "Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 23: нуклеотидная последовательность рРНК 16S из Mycobacterium avium.SEQ ID NO: 24: нуклеотидная последовательность рРНК 16S из Mycobacterium intracellulare.SEQ ID NO: 25: химерный олигонуклеотидный праймер, названный Myco-F-1, сконструированный для амплификации части рРНК 16S Mycobacterium. "Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 26: химерный олигонуклеотидный праймер, названный Myco-F-2, сконструированный для амплификации части рРНК 16S Mycobacterium. "Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 27: химерный олигонуклеотидный праймер, названный Мусо-F-3, сконструированный для амплификации части рРНК 16S Mycobacterium. "Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 28: химерный олигонуклеотидный праймер, названный Myco-R-1, сконструированный для амплификации части рРНК 16S Mycobacterium. "Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 29: химерный олигонуклеотидный праймер, названный Myco-R-1-2, сконструированный для амплификации части рРНК 16S Mycobacterium. "Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 30: химерный олигонуклеотидный праймер, названный Myco-R-21, сконструированный для амплификации части последовательности, кодирующей рРНК 16S из Mycobacterium intracellulare."Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 31: химерный олигонуклеотидный праймер, названный Myco-R-2A, сконструированный для амплификации части последовательности, кодирующей рРНК 16S из Mycobacterium avium. "Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 32: олигонуклеотидный зонд как avium-зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть последовательности, кодирующей рРНК 16S из Mycobacterium avium.SEQ ID NO: 33: олигонуклеотидный зонд как intracellulare-зонд, сконструированный для детекции фрагмента ДНК, амплифицирующего часть последовательности, кодирующей рРНК 16S из MycobacteriumSEQ ID NO: 34: нуклеотидная последовательность гена СррВ из Neisseria gonorrhorae.SEQ ID NO: 35: нуклеотидная последовательность ДНК плазмиды pJD4 из Neisseria gonorrhorae.SEQ ID NO: 36: нуклеотидная последовательность гена M.NgoMIII из Neisseria gonorrhorae.SEQ ID NO: 37: нуклеотидная последовательность цитозинметилтрансферазы из Neisseria gonorrhorae.SEQ ID NO: 38: химерный олигонуклеотидный праймер, названный NEI-5103, сконструированный для амплификации части ДНК плазмиды pJDB4 из Neisseria gonorrhorae. "Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 39: химерный олигонуклеотидный праймер, названный NEI-5150, сконструированный для амплификации части ДНК плазмиды pJDB4 из Neisseria gonorrhorae. "Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 40: химерный олигонуклеотидный праймер, названный NEI-CppB-F1, сконструированный для амплификации части гена СррВ из Neisseria gonorrhorae. "Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 41: химерный олигонуклеотидный праймер, названный NEI-CppB-F2, сконструированный для амплификации части гена СррВ из Neisseria gonorrhorae. "Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 42: химерный олигонуклеотидный праймер, названный NEI-CppB-F3, сконструированный для амплификации части гена СррВ из Neisseria gonorrhorae. "Нуклеотиды 16-18 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 43: химерный олигонуклеотидный праймер, названный NEI-CppB-R1, сконструированный для амплификации части гена СррВ из Neisseria gonorrhorae. "Нуклеотиды 18-20 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 44: химерный олигонуклеотидный праймер, названный NEI-CppB-R2, сконструированный для амплификации части гена СррВ из Neisseria gonorrhorae. "Нуклеотиды 17-19 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."SEQ ID NO: 45: химерный олигонуклеотидный праймер, названный NEI-CppB-R3, сконструированный для амплификации части гена СррВ из Neisseria gonorrhorae. "Нуклеотиды 19-21 являются рибонуклеотидами - другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами."