Трансформанты talaromyces

Изобретение относится к трансформанту Talaromyces, содержащему один или несколько рекомбинантных генов, которые способны продуцировать целлюлазу в отсутствие индуктора целлюлазы в среде с глюкозой, активность целлюлазы которого равна 2 WSU/мл или больше, в надосадочной жидкости или бульоне, разведенных в 16 раз или больше. Лос Алрик Питер, Вонк Бренда, Берг Ван Ден Марко Александер, Дамвельд Роббертус Антониус, Сагт Корнелис Мария Якобус, Фоллебрехт Адрианус Вильхельмус Херманус, СхоневелдБергманс Маргот Элизабет Франсуаз(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. (NL) Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к способу получения трансформантов Talaromyces, к трансформантам Talaromyces и к способу получения полипептида с помощью трансформантов Talaromyces. Изобретение также относится к способу осахаривания лигноцеллюлозного материала, который контактирует с трансформантом или целлюлазой, гемицеллюлазой и/или пектиназой, продуцируемых трансформантом, в результате чего вырабатываются сахара. Кроме того, изобретение относится к способу получения продукта ферментации, например этанола, в котором эти сахара ферментируются ферментирующим микроорганизмом, предпочтительно дрожжами, с получением продукта ферментации. Предшествующий уровень техники Углеводы являются наиболее распространенными органическими соединениями на Земле. Однако многие из этих углеводов депонируются в сложных полимерах, включая крахмал (основной запасающий углевод в семенах и зернах), и агрегатах углеводов и лигнина, известных как лигноцеллюлоза. Основными углеводными компонентами лигноцеллюлозы являются целлюлоза, гемицеллюлоза и пектины. Эти сложные полимеры часто упоминаются под общим названием лигноцеллюлоза. Биопреобразование возобновляемой лигноцеллюлозной биомассы в поддающийся ферментации сахар, который затем ферментируется с получением спирта (например, этанола) в качестве альтернативы жидкому топливу привлекло пристальное внимание исследователей после 1970-х гг., когда из-за снижения добычи нефти ОПЕК разразился нефтяной кризис. В течение последних двух десятилетий этанол широко применялся в качестве 10% смеси с бензином в США или как чистое топливо для автомобилей в Бразилии. Совсем недавно специально для приложений чистого города внедрили Е 85, 85% этанольную смесь. Важность топливного биоэтанола будет расти параллельно с ростом цен на нефть и постепенным истощением ее источников. Кроме того, поддающиеся ферментации сахара применяются при получении пластиков, полимеров и другой биопродукции, и эта отрасль, как ожидается, будет в существенной степени расти, что приведет к повышению спроса на дешевые распространенные ферментируемые сахара,которые могут быть использованы в качестве сырья вместо сырья на основе нефти. Депонирование таких больших количеств углеводов в растительной биомассе обеспечивает изобильный источник потенциальной энергии в форме сахаров как пятиуглеродных, так и шестиуглеродных, которые могут быть применены во множестве промышленных и сельскохозяйственных процессов. Однако огромный энергетический потенциал этих углеводов в настоящее время используется недостаточно, поскольку эти сахара блокированы в сложных полимерах и, следовательно, не являются легко доступными для ферментации. Способы, с помощью которых получают сахара из растительной биомассы, обеспечат изобильный, экономически конкурентноспособный источник ферментируемого сырья для химических соединений, пластмасс, таких как, например, янтарная кислота и (био)топлива, включая этанол, метанол, бутанол, синтетическое жидкое топливо и биогаз. Независимо от типа целлюлозного сырья стоимость и гидролитическая эффективность ферментов являются основными факторами, которые ограничивают коммерциализацию процессов биопреобразования биомассы. Производственные затраты на микробно продуцируемые ферменты тесно связаны с продуктивностью вырабатывающего фермент штамма и выходом конечной активности в ферментативном бульоне. Несмотря на продолжающиеся в последние несколько десятилетий исследования, имеющие своей целью понимание ферментативной деградации лигноцеллюлозной биомассы и производство целлюлаз,желательным остается обнаружение или создание высокоактивных целлюлаз и гемицеллюлаз. Также было бы весьма желательно создать высокоэффективные ферментные композиции, способные осуществлять быструю и эффективную биодеградацию лигноцеллюлозных материалов. Такие ферментные композиции можно применять при получении сахаров для ферментации в химические соединения, пластики, такие как, например, янтарная кислота и (био)топливо, включая этанол,метанол, бутанол, синтетическое жидкое топливо и биогаз, для силосования, и также в качестве фермента в других индустриальных процессах, например в пищевой и кормовой промышленности, текстильной промышленности, целлюлозно-бумажной промышленности и в других видах промышленности. Одним из родов микроорганизмов, который, как известно, продуцирует ферменты, подходящие для ферментной деградации лигноцеллюлозной биомассы, является род Talaromyces. Talaromyces - это мицелиальный гриб. В работе Jain, S. et al., Mol. Gen. Genet (1992), 234, 489-493, раскрыта система трансформации грибаTalaromyces sp CL240. Экспрессия полипептидов не раскрывается. В работе Murray, F.R. et al., Curr. Genet (1997), 32, 367-375, раскрыта сверхэспрессия гена глюкозооксидазы из Talaromyces flavus в Talaromyces macrosporus. Было исследовано воздействие грибных изолятов на ингибирование роста V. dahliae. В WO 200170998 раскрыты -глюканазы Talaromyces emersonii. В описании на стр. 16 говорится о том, что полинуклеотид -глюканазы можно гетерологично экспрессировать в хозяине, например в дрожжевой клетке. В WO 200224926 раскрывается ксиланаза из Talaromyces emersonii. В описании на стр. 24 в 5 абзаце-1 021636 говорится о том, что выработка полипептида может быть достигнута рекомбинантной экспрессией последовательности ДНК ксиланазы в подходящей гомологичной или гетерологичной клетке-хозяине. В абзаце 7 указывается, что клетка-хозяин может сверхэкспрессировать полипептид, а способы достижения сверхэспрессии хорошо известны из WO 99/32617. WO 99/32617 имеет отношение к клонированию для экспрессии, но в нем не раскрыто клонирование в хозяине, принадлежащем к Talaromyces. В WO 2007091231 раскрыты штаммы Talaromyces emersonii, которые являются термостабильными и которые кодируют термостабильные ферменты, а также раскрыты ферментные композиции, продуцируемые штаммами Talaromyces emersonii. He раскрыто получение гомологичных или гетерологичных полипептидов. В табл. 1 показано, что индуцирующие источники углерода были добавлены в количестве 0,2-0,6%. "Solka floc" и глюкозу (2%) включали для сравнения. На стр. 78 в строке 28 сказано, что глюкоза не полностью репрессирует продуцирование экзоглюкозидазы штаммами Т. emersonii (табл. 31 А). В табл. 31 А показано, что IMI393751 вырабатывает активность -глюкозидазы, равную 31,90 ME, с глюкозой в качестве источника углерода, но не продуцирует активностей других целлюлаз, например глюканаз или ксиланаз. Из-за утраты активностей таких ферментов штамм IMI393751 не подходит для выработки целлюлаз для преобразования лигноцеллюлозы на глюкозе в качестве источника углерода. Сущность изобретения Присутствие индуктора целлюлаз, до сих пор необходимого в способах продуцирования целлюлаз вTalaromyces, имеет несколько недостатков. Во-первых, индуктор, такой как растительный материал, может иметь изменчивую композицию, которая является невыгодной для контролируемости процесса выработки целлюлаз. Во-вторых, для стерилизации растительного материала для индукции необходима энергия. В-третьих, растительный материал сильно загрязняет окружающую среду. В-четвертых, индуктор может привести к повышенной вязкости среды продуцирования целлюлазы. В-пятых, присутствие индуктора, в частности, если он был предварительно обработан, может привести к выработке ингибиторов, которые могут быть вредны для Talaromyces. Таким образом, существует потребность в улучшенном способе и улучшенных штаммах Talaromyces для выработки полипептидных композиций, подходящих для ферментативной деградации лигноцеллюлозной биомассы в Talaromyces. В связи с этим задача изобретения заключается в обеспечении штаммами Talaromyces, подходящими для преобразования лигноцеллюлозы в сахар. Дополнительная задача изобретения заключается в обеспечении таких штаммов Talaromyces, которые могут работать без индукторов целлюлазы в среде,содержащей глюкозу. Итак, в изобретении предлагается способ получения трансформанта Talaromyces,включающий стадии:(a) обеспечения одной или нескольких экспрессирующих кассет, способных продуцировать один или несколько представляющих интерес полипептидов, и содержащих один или несколько представляющих интерес полинуклеотидов, кодирующих целлюлазу, гемицеллюлазу и/или пектиназу и, по меньшей мере, один промотор для экспрессии полинуклеотида;(b) обеспечения селективного маркера, включенного в экспрессирующую кассету (а) или включенного в специально предназначенный полинуклеотид селективного маркера;(c) трансфекции хозяина из Talaromyces одной или несколькими экспрессирующими кассетами из(а) и/или селективным маркером из (b);(d) отбора трансформанта Talaromyces, который содержит один или несколько полинуклеотидов,кодирующих целлюлазу, гемицеллюлазу и/или пектиназу; и(e) выделения трансформанта Talaromyces. В изобретении дополнительно предлагаются трансформанты Talaromyces, содержащие один или несколько рекомбинантных генов, способных продуцировать целлюлазу в отсутствии индуктора целлюлазы в среде с глюкозой, у которых активность целлюлазы равна 2 WSU/мл или больше, в надосадочной жидкости или бульоне разведенных в 16 раз или больше, получаемые согласно вышеупомянутому способу. Трансформанты Talaromyces изобретения можно культивировать в среде, содержащей подходящий источник углерода, такой как сахар, например глюкоза, без индуктора целлюлазы (глюкоза в данном документе не является индуктором целлюлазы, т.е. индуктор целлюлазы не включает глюкозу) и продуцировать целлюлазы, которые обладают способностью деградировать лигноцеллюлозы. Изобретение дополнительно относится к способу получения полипептидной композиции из одной или нескольких целлюлаз, гемицеллюлаз и/или пектиназ, который включает стадии:(a) обеспечения одной или нескольких экспрессирующих кассет, способных продуцировать один или несколько представляющих интерес полипептидов, и содержащих один или несколько представляющих интерес полинуклеотидов, кодирующих целлюлазу, гемицеллюлазу и/или пектиназу и по меньшей мере один промотор для экспрессии полинуклеотида;(b) обеспечения селективного маркера, включенного в экспрессирующую кассету (а) или включенного в специально предназначенный полинуклеотид для селективного маркера;(c) трансфекции хозяина из Talaromyces одной или несколькими экспрессирующими кассетами из(а) и/или селективным маркером из (b);(d) необязательно, отбора трансформанта Talaromyces, который содержит один или несколько по-2 021636 линуклеотидов, кодирующих целлюлазу, гемицеллюлазу и/или пектиназу; и(e) получения полипептида культивированием трансформанта Talaromyces в подходящей культуральной среде, в которой индуктор целлюлазы фактически отсутствует; и(f) необязательно, извлечения полипептидной композиции. Другие воплощения описаны ниже в подробном описании изобретения. Краткое описание чертежей Фиг. 1. Обнаружение фрагментов ПЦР гена -лактамазы из pAN8-1. На агарозном геле представлен фрагмент ПЦР -лактамазы длиной 278 нуклеотидов из трансформантов Т. emersonii. Дорожки 1-10 содержат фрагменты ПЦР из реакций, в которых в качестве матрицы использовали хромосомную ДНК 10 трансформантов Т. emersonii pAN8-1; дорожка 11 содержит маркер молекулярных масс; дорожка 12 содержит фрагмент ПЦР из реакции, в которой в качестве матрицы для ПЦР использовали плазмиду pAN81; дорожка 13 содержит реакционную смесь ПЦР, в которой в качестве матрицы использовали хромосомную ДНК пустого штамма. Фиг. 2. Обнаружение интеграции pAN8-1 в геноме Т. emersonii. Обнаружение ДНК pAN8-1 блоттингом по Саузерну с помощью меченного зонда к -лактамазе. Дорожка 1 содержит маркер молекулярной массы; дорожки 2 и 3 содержат соответственно 0,5 и 5 нг плазмидной ДНК pAN8-1; дорожки 4 и 5 содержат гидролизованную MluI хромосомную ДНК двух различных трансфорантов Т. emersonii сpAN8-1 (специфические полосы указаны стрелками); дорожка 6 содержит гидролизованную MluI хромосомную ДНК пустого штамма. Фиг. 3. Карта pGBFINEBA7 для экспрессии меченого FLAG СЕВ белка -глюканазы Т. emersonii.pGBFINEBA7 является плазмидой на основе pGBFIN5. Изображен меченый FLAG белок СЕВ глюканазы из Т. emersonii (EBA7+FLAG), экспрессируемый промотором глюкоамилазы Aspergillus niger(PglaA). Кроме того, изображены ген маркера селекции (amdS), экспрессируемого промотором глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (Pgpd) из Aspergillus nidulans и фланги глюкоамилазы (3'glaA и 3"glaA) экспрессирующей кассеты. Фиг. 4. Обнаружение меченого FLAG белка СЕВ -глюканазы из Т. emersonii, экспрессируемого в Т. emersonii.emersonii, выращенных в среде 1 для Talaromyces (дорожки 1-3) и среде 2 для Talaromyces (дорожки 5-7) с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ). Надосадочные жидкости трансформантов Т. emersonii pGBFINEBA7 16 (дорожки 1, 5) и 114 (дорожки 2, 6) собирали после 72-часового культивирования; дорожки 3 и 7 содержат надосадочные жидкости 72 часовой культуры пустого штамма; дорожка 4 содержит маркер молекулярных масс.emersonii, выращенных в среде 1 для Talaromyces (дорожки 2-7) и среде 2 для Talaromyces (дорожки 914) с помощью Вестерн-блоттинга антителом, специфичным к метке FLAG. Дорожки 1 и 8 содержат маркер молекулярных масс; дорожки 2, 3, 9 и 10 содержат надосадочные жидкости трансформанта Т.emersonii pGBFINEBA7 16, собранные после 72-часового (дорожки 2, 9) и 96-часового (дорожки 3, 10) культивирования; дорожки 4, 5, 11 и 12 содержат надосадочные жидкости трансформанта Т. emersoniipGBFINEBA7 114, собранные после 72-часового (дорожки 4, 11) и 96-часового (дорожки 5, 12) культивирования; дорожки 6 и 13, 7 и 14 содержат надосадочные жидкости, соответственно, 72-часовых и 96 часовых культур пустого штамма.(4 С). Определение количества копий в трансформантах с помощью ПЦР. Агарозный гель, демонстрирующий ПЦР-фрагмент экспрессирующей кассеты, длиной 1285 нуклеотидов, и ПЦР-фрагмент геномного контроля/эталона актина, длиной 373 нуклеотида, трансформантов Т. emersonii. Интенсивность ПЦР-фрагмента гена ЕВА 7 длиной 1285 нуклеотидов свидетельствует о количестве копий гена после нормализации 1285 нк ПЦР-сигнала с 373 нк актиновым геномным эталонным сигналом. ПЦРфрагменты трансформантов pGBFINEBA7 16 и 114 показаны в дорожках 1 и 2 соответственно; в дорожке 4 показан маркер молекулярных масс; ПЦР-фрагменты трансформантов pGBFIN-Pgpd-EBA7 814,818 и 832 показаны в дорожках 4, 5 и 6 соответственно. Фиг. 5. Карта pGBFIN-Pgpd-EBA7 для экспрессии меченного FLAG белка СЕВ -глюканазы из Т.emersonii под контролем промотора gpd. pGBFIN-Pgpd-EBA7 является плазмидой на основе pGBFIN38. Изображен меченый FLAG белок СЕВ -глюканазы из Т. emersonii (EBA7+FLAG), экспрессируемый промотором глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из Aspergillus nidulans (Pgpd). Кроме того, изображены ген маркера селекции (amdS), экспрессируемого промотором глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназы (Pgpd) из Aspergillus nidulans и фланги глюкоамилазы (3'glaA и 3"glaA) экспрессирующей кассеты. Фиг. 6. Сравнение экспрессии белка СЕВ -глюканазы из Т. emersonii в Т. emersonii под контролем либо промотора glaA из A. niger, либо промотора gpd из А. nidulans. Вестерн-блоттингом показан меченый FLAG белок СЕВ -глюканазы из Т. emersonii, экспрессируемый в Т. emersonii. Дорожки 1, 10 и 11 содержат 15 л (дорожка 1), 15 л 10-кратно-разведенной на-3 021636 досадочной жидкости (дорожка 10) и 5 л (дорожка 11) надосадочной жидкости 72-часовой культуры пустого штамма; дорожки 3-5 содержат 15 л 10-кратно-разведенной надосадочной жидкости (дорожка 3), 5 л (дорожка 4) и 15 л (дорожка 5) надосадочной жидкости трансформанта Т. emersonii с pGBFINPgpd-EBA7 814 собранной 72-часовой культуры; дорожки 6-8 содержит 15 л 10-кратно-разведенной надосадочной жидкости (дорожка 6), 5 л (дорожка 7) и 15 л (дорожка 8) надосадочной жидкости трансформанта Т. emersonii с pGBFIN-Pgpd-EBA7 818 собранной 72-часовой культуры; дорожки 12-14 содержат 15 л 10 кратно-разведенной надосадочной жидкости (дорожка 12), 5 л (дорожка 13) и 15 л(дорожка 14) надосадочной жидкости трансформанта Т. emersonii с pGBFIN-Pgpd-EBA7 832 собранной 72-часовой культуры; дорожки 9 и 15 содержат 15 л 100-кратно-разведенной надосадочной жидкости трансформанта Т. emersonii с pGBFINEBA7 16 (промотор glaA) собранной 72-часовой культуры (из-за сильного сигнала полосы переэкспонированы); дорожка 2 содержит маркер молекулярных масс. Фиг. 7. Карта pGBTOPEBA205 для экспрессии CBHI из Т. emersonii в Т. emersonii. Изображенное является ЕВА 205, экспрессируемым промотором глюкоамилазы (PglaA). Кроме того, изображена фланкирующая область глюкоамилазы (3'glaA) экспрессирующей кассеты. Фиг. 8: Карта pGBFINEBA176 для экспрессии CBHII из Т. emersonii в Т. emersonii. pGBFINEBA176 является плазмидой на основе pGBFIN11. Изображенное является геном ЕВА 176, экспрессируемым промотором глюкоамилазы (PglaA). Кроме того, изображены ген селективного маркера (amdS), экспрессируемого промотором глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (Pgpd) из Aspergillus nidulans и фланги глюкоамилазы (3'glaA и 3"glaA) экспрессирующей кассеты. Фиг. 9. Обнаружение множества рекомбинантных целлюлаз из Т. emersonii в Т. emersonii.pGBTOPEBA4, pGBTOPEBA8, pGBFINEBA176 и pGBTOPEBA205. В 96-луночных планшетах вырастили примерно 400 трансформантов и проверили на предмет экспрессии по меньшей мере одной целлюлазы посредством анализа в геле "E-PAGE". Представляющие интерес трансформанты выращивали в перемешиваемых колбах, содержащих среду на основе глюкозы, а белки в надосадочной жидкости, собранной из 72-часовых культур, осаждали ТХУ и анализировали с помощью гель-электрофореза в полиакриаламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ). FBG142 является пустым штаммом.(9 В). График, демонстрирующий выраженную в WSU активность трансформантов. Трансформанты выращивали в течение 72 ч в среде на основе глюкозы и определяли выраженную в WSU активность в разведенных в 16 раз надосадочных жидкостях культур. FBG142 является пустым штаммом. Краткое описание списка последовательностейSEQ ID NO: 1 представляет последовательность ДНК праймера 1 для ПЦР.SEQ ID NO: 2 представляет последовательность ДНК праймера 2 для ПЦР.SEQ ID NO: 3 представляет аминокислотную последовательность меченого FLAG СЕВ -глюканазы (белка) из Т. emersonii.SEQ ID NO: 5 представляет последовательность ДНК праймера 3 для ПЦР.SEQ ID NO: 6 представляет последовательность ДНК праймера 4 для ПЦР.SEQ ID NO: 7 представляет последовательность промотора gpd и последовательности Козак; промотор gpd: 1-870, сайты рестрикции: 871-882, последовательность Козак: 883-892.SEQ ID NO: 8 представляет последовательность ДНК праймера 5 для ПЦР.SEQ ID NO: 9 представляет последовательность ДНК праймера 6 для ПЦР.SEQ ID NO: 10 представляет аминокислотную последовательность целлобиогидролазы I из Т. emersonii.SEQ ID NO: 12 представляет аминокислотную последовательность СЕА -глюканазы (белок) из Т.SEQ ID NO: 14 представляет аминокислотную последовательность -глюкозидазы (белок) из Т. emersonii.SEQ ID NO: 16 представляет аминокислотную последовательность целлобиогидролазы II (белок) из Т. emersonii.SEQ ID NO: 17 представляет последовательность, кодирующую последовательность дикого типа целлобиогидролазы II (ДНК, кодирующая область) из Т. emersonii.SEQ ID NO: 18 представляет аминокислотную последовательность неизвестного белка из Т. emer-4 021636SEQ ID NO: 19 представляет последовательность, кодирующую неизвестный белок из Т. emersonii,который имеет аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 18.SEQ ID NO: 20 представляет аминокислотную последовательность сволленина из Т. emersonii.SEQ ID NO: 21 представляет последовательность, кодирующую сволленин из Т. emersonii.SEQ ID NO: 22 представляет аминокислотную последовательность ацетилксиланэстеразы из Т. emersonii.SEQ ID NO: 23 представляет последовательность, кодирующую ацетилксиланэстеразу из Т. emersonii.SEQ ID NO: 24 представляет аминокислотную последовательность ксиланазы из Т. emersonii.SEQ ID NO: 25 представляет последовательность, кодирующую ксиланазу из Т. emersonii. Подробное описание изобретения По всему данному описанию и в сопровождающих пунктах формулы изобретения слова "содержать", "включать" и их вариации, такие как "содержит", "содержащий", "включает" и "включающий",должны толковаться включительно. То есть эти слова призваны передать идею возможного включения других элементов или целых, специально не перечисленных, там, где позволяет контекст. Слова, употребляемые в единственном числе, также подразумевают и множественное число. К примеру, элемент может обозначать один элемент или больше одного элемента. Итак, согласно настоящему изобретению было показано, что вышеуказанные методы трансформации могут быть использованы при получении высокой экспрессии гетерологичных полипептидов или для усиления выработки гомологичных полипептидов в Talaromyces. При использовании в данном документе "трансформант" означает клетку, которая была целью трансформации. "Трансформант" и "рекомбинатная клетка" используются в данном документе как синонимы."Трансформация" в данном документе означает генетическое изменение клетки посредством рекомбинантной технологии. Трансформация может быть результатом захвата, включения и экспрессии генетического материала (ДНК, РНК или белка) или мутации или делеции генетического материала в клетке посредством вмешательства человека. Нуклеотидный конструкт: термин "нуклеотидный конструкт" при использовании в данном документе относится к молекуле нуклеиновой кислоты либо одно-, либо двухцепочной, которая выделена из естественного гена или которая была модифицирована так, чтобы она содержала сегменты нуклеиновых кислот в том виде, в котором они не существуют в природе. Термин "нуклеотидный конструкт" является синонимом термина "экспрессирующая кассета", если нуклеотидный конструкт содержит контрольные последовательности, требуемые для экспрессии кодирующей последовательности настоящего изобретения. При использовании в данном документе термины "ген" или "рекомбинантный ген" относятся к молекулам нуклеиновой кислоты, которые могут быть выделены из хромосомной ДНК, и которые включают открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, например целлюлазу, к примеру, целлобиогидролазу. Ген может включать кодирующие последовательности, некодирующие последовательности, интроны и регуляторные последовательности. Более того, термин "ген" может относиться к определенной в данном документе выделенной молекуле нуклеиновой кислоты. При использовании в данном документе выражение "гетерологичные полипептиды" означают полипептиды, не продуцируемые Talaromyces, тогда как "гомологичные полипептиды" означают полипептиды, продуцируемые Talaromyces. Субстрат (также называемый сырьем) в данном документе используется для обозначения вещества, которое содержит углеводный материал, которое может быть обработано ферментами по изобретению, в результате чего углеводный материал в нем модифицируется. В дополнение к углеводному материалу субстрат может содержать любой другой компонент, включая без ограничения перечисленным, неуглеводный материал и крахмал. Углевод в данном контексте включает все сахариды, например полисахариды, олигосахариды, дисахариды или моносахариды. "Индуктор целлюлазы" в данном документе определен как соединение, которое индуцирует выработку целлюлазы в Talaromyces. Примерами индукторов целлюлазы являются чистая целлюлоза, целлобиоза, софороза и гентиобиоза или любой лигноцеллюлозный материал. Полипептид по изобретению может модифицировать углеводный материал, модифицируя его химически или физически. Химическая модификация углеводного материала может привести к деградации такого материала, например, гидролизом, окислением или другой химической модификацией, такой как действие лиазы. Физическая модификация может проводиться вместе с химической модификацией или без нее. Ниже подробно описаны различные воплощения изобретения. Трансформанты Talaromyces В изобретении предлагаются трансформанты Talaromyces. Трансформанты Talaromyces получают трансформацией рекомбинантно вводимой ДНК хозяина из Talaromyces, такого как Talaromyces emer-5 021636sonii. Как указано выше, в изобретении предлагается трансформант Talaromyces, способный вырабатывать целлюлазу в среде с глюкозой в отсутствии индуктора целлюлазы, у которого активность целлюлазы равна 2 WSU/мл или больше в разведенной в 16 раз или больше надосадочной жидкости или бульоне,получаемые согласно вышеупомянутому способу. В любом из воплощений трансформант Talaromyces имеет активность целлюлазы, равную 3 WSU/мл или больше в разведенной в 16 раз надосадочной жидкости или бульоне или в еще более разведенной надосадочной жидкости или бульоне, в дополнительном воплощении трансформант Talaromyces имеет активность целлюлазы, равную 5 WSU/мл или больше в разведенной в 16 раз надосадочной жидкости или бульоне или в еще более разведенной надосадочной жидкости или бульоне. В дополнительном воплощении трансформант Talaromyces имеет активность целлюлазы, равную 2 WSU/мл или больше в разведенных в 16-1000 раз надосадочной жидкости или бульоне, 3 WSU/мл в разведенных в 16-5000 раз надосадочной жидкости или бульоне, 3 WSU/мл или больше в разведенных в 16-2500 раз надосадочной жидкости или бульоне. В любом из воплощений трансформант Talaromyces имеет активность эндонуклеазы, равную 50WBCU/мл или больше. В любом из воплощений трансформант Talaromyces имеет общее содержание целлюлазы, определенное APEX, 38% или больше, 39% или больше, 40% или больше, 41% или больше, 42% или больше,43% или больше, 44% или больше, 45% или больше, 46% или больше, 47% или больше и/или 48% или больше. В дополнительном воплощении трансформанты Talaromyces по любому из пп.1-4 содержат два или большее количество рекомбинантных генов, способных экспрессировать целлюлазу. ТрансформантыTalaromyces по изобретению содержат два или большее количество генов, способных экспрессировать целлюлазу, включая гены целлобиогидролазы, эндоглюканазы и/или -глюкозидазы. Изобретение также включает воплощение трансформанта Talaromyces, в котором ген целлобиогидролазы является целлобиогидролазой I и/или целлобиогидролазой II. В любом из воплощений в трансформанте Talaromyces один или несколько генов интегрированы в геном Talaromyces. В дополнительном воплощении трансформант Talaromyces является безмаркерным. Клетки-хозяева. Клетки-хозяева, используемые согласно изобретению, являются клетками рода Talaromyces. Предпочтительно, если хозяин из Talaromyces является Talaromyces emersonii, Talaromyces stipitatus, Talaromyces marxianus или Talaromyces flavus. В любом из воплощений хозяином является Talaromyces emersonii, например Talaromyces emersonii АТСС 16479. Трансформация. Трансформация хозяина может быть проведена любым подходящим известным способом, включая,например, способы электропорации, бомбардировки частицами или баллистической трансфекции, способы с протопластами и опосредуемая агробактериями трансформация. Предпочтительно используют способ с протопластами. Процедуры трансформации описаны J.R.S. Fincham, Transformation in fungi. 1989, microbiological reviews. 53, 148-170. Для получения трансформантов способом с протопластами оптимизировали протокол трансформации. Для получения протопластов собирали мицелий из культур, растущих в течение от 8 вплоть до 72 ч,предпочтительно от 14 до 24 ч. Мицелий ресуспендировали в буфере, содержащем осмотический стабилизатор и препарат литического фермента. Осмотический стабилизатор может быть выбран из группы,включающей, без ограничения перечисленным, сахарозу, сорбит, маннит, KCl, NH4Cl, NaCl, MgSO4 иNaCl, предпочтительно сахарозу, сорбит или KCl, в концентрации 0,4-1,4 М, предпочтительно 0,8-1,2,наиболее предпочтительно 1,0 М. Препараты литических ферментов могут быть выбраны из группы,включающей, без ограничения перечисленным, "Glucanex 200G", "Novozyme 234", "Caylase C3", "Zymolyase" и "Driselase", предпочтительно "Glucanex 200G". Расщепление может быть проведено при температуре между 30 и 37 С в ротационном шейкере в течение 1-3 ч. Протопласты могут быть отделены от мицелия с помощью фильтра "Miracloth", фильтра из пористого стекла, марли, 30 м сита или градиента сорбита, центрифугирования, и после осаждения мицелия осуществляют последующий сбор протопластов декантацией. После отмывки протопластов в буфере с осмотическим стабилизатором к 104-109 протопластов добавляют 0,1-40 г ДНК и, необязательно, ингибитор нуклеаз, такой как ауринтрикарбоновая кислота, в буфере, содержащем осмотический стабилизатор и 10-50 мМ CaCl2, предпочтительно 50 мМCaCl2. Смесь необязательно инкубируют в течение 15-30 мин при 4 С или при комнатной температуре. Полиэтиленгликоль (PEG4000, PEG6000 или PEG8000, предпочтительно PEG4000) добавляют к смеси с конечной концентрацией 6-55%. Добавление PEG может быть осуществлено последовательными стадиями, в которых концентрация PEG постепенно увеличивается. Между добавлениями PEG суспензию инкубируют в течение 5-30 мин при 4-37 С. Предпочтительно, если 6% PEG4000 (конечная концентрация) добавляют к протопластам и суспензии ДНК, инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре и затем добавляют второе количество PEG4000 вплоть до конечной концентрации 51% с последующей инкубацией в течение 15 мин при 25 С. Аликвоту смеси либо напрямую добавляют к мягкому агару и разливают на селективные восстанавливающие чашки, либо протопласты отмывают и рассевают-6 021636 на селективных восстанавливающих чашках. Мягкий агар содержит ростовую среду с осмотическим стабилизатором, с селективным маркером или без него и низкую концентрацию агара, что позволяет разливать агар при 40-60 С. Среда для восстановления содержит ростовую среду с осмотическим стабилизатором, который может быть таким же осмотическим стабилизатором, что и используемый при получении протопластов. Полинуклеотидом может быть ДНК или РНК. В случае ДНК вектор используют вместе с промотором, кодирующей областью, последовательностью терминатора, что также называют экспрессирующей кассетой. С помощью требуемой полинуклеотидной последовательности в качестве зонда для гибридизации молекулы нуклеиновой кислоты (т.е. гены) согласно изобретению могут быть выделены посредством стандартной гибридизации и методов клонирования (например, как описано в руководстве Sambrook, J., Fritsh, E.F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Нуклеиновая кислота по изобретению может быть амплифицирована с использованием кДНК,мРНК или, в ином случае, с геномной ДНК в качестве матрицы и подходящих олигонуклеотидных праймеров в соответствии со стандартными методами амплификации ПЦР. Амплифицированная таким образом нуклеиновая кислота может быть клонирована в подходящий вектор и охарактеризована по анализу последовательности ДНК. Более того, олигонуклеотиды, соответствующие или поддающиеся гибридизации с нуклеотидной последовательностью по изобретению, могут быть получены с помощью стандартных синтетических методов, например с помощью автоматического синтезатора ДНК. В зависимости от требуемой функциональности результат способа трансформации по изобретению может быть (гетерологичной) экспрессией, сверхэкспрессией, контролируемой регуляцией и/или удалением конкретных генов. Поли- или олигонуклеотиды в данном документе могут быть синтетическими полинуклеотидами. Введение генов в хозяина может быть эписомальным, с помощью плазмиды с представляющим интерес геном, или ген может быть интегрирован в геном хозяина в ходе трансформации одной или несколькими копиями. Могут быть изготовлены соответствующие экспрессирующие конструкты. В любом из воплощений изобретения трансформацию проводят в виде совместной трансформации,т.е. трансформации двумя или большим количеством типов рекомбинантной ДНК. Например, совместная трансформация может быть осуществлена а) вектором, содержащим маркер, и b) вектором, содержащим один или несколько представляющих интерес генов. В любом из воплощений при трансформации возможно применение библиотек ДНК, геномной ДНК, РНК, кДНК или белков. Трансформация хозяина из Talaromyces осуществляется с селективным маркером. При стабильной трансформации клеток Talaromyces мы обнаружили, что в зависимости от экспрессирующего вектора и используемого способа трансформации интеграция чужеродной ДНК в геном происходит только в малой части клеток. В целях идентификации и отбора этих интегрантов вместе с представляющим интерес геном в клетки-хозяева, как правило, вводят ген, который кодирует селективный маркер (например, ген устойчивости к антибиотику). Подходящими селективными маркерами являются, например, amdS, argB(ортнитинкарбамоилтрансфераза), bar (фосфинотрицин-ацетилтрансфераза), устойчивость к карбоксину,hemA (5-аминолевулинат), hemB (порфобилиногенсинтаза), ble (устойчивость к флеомицину), hygB (гигромицин-фосфотрансфераза), natR (устойчивость к нурсеотрицину), niaD (нитратредуктаза), pyrG (оротидин-5'-фосфат-декарбоксилаза), DHFR, sC (сульфатаденилтрансфераза), trpC (антранилатсинтаза), pyroA, riboB. Подходящими для применения в клетках Talaromyces являются ген amdS (ЕР 635574 B1, WO 97/06261), ген ble (Mattern, I.E., Punt, P.J., Van den Hondel, C.A.M.J.J., 1988. A vector of Aspergillus transformation conferring phleomycin resistance. Fungal Genet. Newsl. 35, 25) и ген hygB (Punt P.J., Oliver R.P.,Dingemanse M.A., Pouwels P.H., van den Hondel C.A.M.J.J., 1987. Transformation of Aspergillus based on thehygromycin В resistance marker from Escherichia coli.Gene. 56:117-24). В одном воплощении применяют ген amdS, например ген amdS из A. nidulans или A. niger. В любом из воплощений геном селективного маркера является кодирующая последовательность amdS из A. Nidulans, слитая с промотором gpdA из A.nidulans (см. ЕР 635574 В 1). Также можно использовать гены AmdS из других мицелиальных грибов(WO 97/06261). В частности, было показано, что отбор штаммов Talaromyces, трансформированных ДНК, кодирующей требуемый полипептид, возможно при использовании генов маркеров, применяемых при трансформации A. niger. Из-за фенотипической дистанции между последним грибом и Talaromyces этого нельзя было предсказать. В любом из воплощений трансформация может быть осуществлена больше чем один раз, т.е. трансформированный штамм может быть трансформирован снова, однократно, двукратно или большее количество раз. В любом из воплощений хозяин для трансформации во второй трансформации является трансформантом Talaromyces, выделенным из первой трансформации, и подобным образом для последующей трансформации во множестве трансформаций предшествующим является хозяин изTalaromyces. В любом из воплощений в одной или нескольких различных стадиях трансформации может-7 021636 быть применен другой маркер, например, в качестве различных маркеров возможно применение флеомицина и гигромицина. Полученные после множественных трансформаций штаммы в данном документе обозначаются как множественные трансформанты. Соответственно, в любом из воплощений изобретение относится к способу получения множественного трансформанта Talaromyces, в котором трансформантTalaromyces, выделенный в первой трансформации, используют в качестве хозяина из Talaromyces и трансформируют во второй трансформации, а в стадии (е) второй трансформации выделяют множественный трансформант Talaromyces. В любом из воплощений в первой трансформации используют селективный маркер, который отличается от маркера во второй трансформации, например, в качестве различных маркеров используют флеомицин и гигромицин. В любом из воплощений селективный маркер удаляют из трансформированной клетки-хозяина после введения экспрессирующего конструкта таким образом, чтобы получить продуцирующие полипептид трансформированные клетки-хозяева без генов-селективных маркеров, т.е. без маркеров. Подобный подход описан в ЕР 0635574 и может быть применен в данном изобретении. При множественных трансформациях, как описано выше, можно избежать применения различных маркеров. Векторы. Полинуклеотиды по изобретению могут быть встроены в рекомбинантный реплицирующийся вектор, например вектор для клонирования или экспрессии. Вектор может быть использован для репликации нуклеиновой кислоты в подходящей хозяйской клетке. Таким образом, в дополнительном воплощении в изобретении предлагается способ получения полинуклеотидов по изобретению путем введения полинуклеотида по изобретению в реплицирующийся вектор, путем введения вектора в подходящую клетку-хозяин и путем выращивания клетки-хозяина в условиях, которые приводят к репликации вектора. Вектор может быть выделен из клетки-хозяина. Подходящие клетки-хозяева описаны ниже. Следовательно, в дополнительном аспекте изобретение относится к векторам, включая векторы для клонирования и экспрессии, которые содержат полинуклеотид по изобретению, кодирующий полипептид или его функциональный эквивалент, и относится к способам выращивания, трансформации или трансфекции таких векторов в подходящую клетку-хозяин, например, в условиях, в которых происходит экспрессия полипептида по изобретению. Использованный здесь термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой они связаны. Вектора по изобретению могут быть использованы in vitro, например, для продуцирования РНК или могут быть использованы при трансфекции или трансформации клетки-хозяина. Вектор может дополнительно включать последовательности, фланкирующие полинуклеотиды, которые содержат последовательности, гомологичные эукариотическим геномным последовательностям или вирусным геномным последовательностям. Это позволяет внедрять полинуклеотиды по изобретению в геном клетки-хозяина. Векторная система может быть одиночным вектором, таким как одиночная плазмида, двумя или несколькими векторами, такими как две или несколько плазмид, которые вместе содержат общую ДНК,вводимую в геном клетки-хозяина. Вектор, в который вставляется экспрессирующая кассета или полинуклеотид по изобретению, может быть любым вектором, который может быть удобно подвергнут процедурам рекомбинатных ДНК, и выбор вектора часто будет зависеть от клетки-хозяина, в которую он вводится. Вектор по изобретению может быть автономно реплицирующимся вектором, т.е. вектором, который существует как экстрахромосомная сущность, репликация которой независима от репликации хромосом, например может быть плазмидой. В ином случае, вектор может быть вектором, который при введении в клетку-хозяин интегрируется в геном клетки-хозяина и реплицируется вместе с хромосомой(ами), в которую он был интегрирован. Одним типом вектора является "плазмида", которая представляет собой кольцевой, замкнутый фрагмент двухцепочечной ДНК, с которым могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы проявляют способность к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные вектора млекопитающих) интегрируются в геном клетки-хозяина при введении в клеткухозяин и, таким образом, реплицируются вместе с хозяйским геномом. Более того, некоторые векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. В данном документе такие векторы называются "экспрессирующими векторами". В общем, экспрессирующие векторы, используемые в методах рекомбинантных ДНК, часто представлены в виде плазмид. Термины "плазмида" и "вектор" в данном документе могут быть использованы взаимозаменяемо, поскольку плазмида является наиболее часто используемой формой вектора. Однако изобретение имеет целью включить другие формы экспрессирующих векторов, таких как космиды, вирусные векторы (например, репликативнодефектные ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы) и фаговые векторы, которые выполняют аналогичные функции.-8 021636 Вектор по изобретению может быть использован in vitro, например, для продуцирования РНК или использован для трансфекции или трансформации клетки-хозяина. При получении стабильных трансформантов предпочтительно, если вектор или экспрессирующий конструкт интегрирован в геном клетки-хозяина. В дополнительном воплощении вектор или экспрессирующий конструкт является микрохромосомой или искусственной хромосомой. Автономно поддерживаемый клонирующий вектор может содержать последовательность АМА 1 (см., например, Aleksenko andClutterbuck (1997), Fungal Genet. Biol. 21: 373-397). В случае, если экспрессирующая конструкция интегрирована в геном хозяйской клетки, конструкция интегрируется либо в случайные локусы в геноме, либо в заранее определенные целевые локусы с помощью гомологичной рекомбинации, в случае которой целевые локусы предпочтительно содержат сильно экспрессирующийся ген. Вектор по изобретению может содержать два или большее количество, например три, четыре или пять, полинуклеотидов по изобретению, например, для сверхэкспрессии. Рекомбинантные экспрессирующие векторы по изобретению содержат нуклеиновую кислоту по изобретению в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, что означает,что рекомбинантный экспрессирующий вектор включает одну или несколько регуляторных последовательностей, выбранных на основании используемых для экспрессии клеток-хозяев, которые функционально связаны с экспрессируемой последовательностью нуклеиновой кислоты. В рекомбинантном экспрессирующем векторе "функционально связанный" означает, что представляющая интерес нуклеотидная последовательность связана с регуляторной последовательностью(ями) таким образом, чтобы позволять экспрессию нуклеотидной последовательности (например, в in vitro системе трансляции/транскрипции или в клетке-хозяине, когда вектор введен в клетку-хозяин), т.е. термин"функционально связанный" относится к непосредственному соседству, в котором описанные компоненты находятся во взаимодействии, позволяющем им функционировать нужным образом. Регуляторная последовательность, такая как промотор, энхансер или другие регуляторные сигналы экспрессии, "функционально связанные" с кодирующей последовательностью, позиционируются таким образом, чтобы экспрессия кодирующей последовательности достигалась в условиях, сравнимых с экспрессией контрольных последовательностей или последовательностей, расположенных так, чтобы они действовали согласовано с их прямым назначением, например, транскрипция инициируется на промоторе и продвигается по последовательности ДНК, кодирующей пептид. Вектор или экспрессирующий конструкт для данной клетки-хозяина может, таким образом, содержать следующие элементы, функционально связанные друг с другом в последовательном порядке от 5'конца к 3'-концу относительно цепи последовательности, кодирующей полипептид первого изобретения:(1) промоторная последовательность, способная управлять транскрипцией нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид в данной клетке-хозяине; последовательность инициации трансляции,включая последовательность Козак (см. WO 2006/077258); (2) необязательно, сигнальная последовательность, способная направлять секрецию полипептида из данной клетки-хозяина в культуральную среду; необязательно, пре-про-последовательность для эффективной секреции; (3) последовательность ДНК по изобретению, кодирующая зрелую и предпочтительно активную форму полипептида, обладающего активностью целлюлазы; и предпочтительно также (4) область терминации транскрипции (терминатор),способная останавливать транскрипцию ниже нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид. В WO 2006/07725 см. также оптимальный сигнал терминации транскрипции. Он также включает сигнал полиаденилирования для получения поли-А+ мРНК. Контрольная последовательность также может быть последовательностью полиаденилирования, последовательность которой функционально связана с 3'-концом нуклеотидной последовательности, и которая при транскрипции распознается клеткой мицелиального гриба в качестве сигнала и добавления остатков полиаденозина к транскрибируемой мРНК. В настоящем изобретении может быть использована любая последовательность полиаденилирования, которая является функциональной в клетке. Необязательные последовательности полиаденилирования для клеток мицелиальных грибов получают из генов, кодирующих амилазу TAKA из A. oryzae,глюкоамилазу из А. niger, антранилатсинтазу из A. nidulans, трипсиноподобную протеазу из Fusariumoxysporum и -глюкозидазу из A. niger. Контрольная последовательность также может быть последовательностью подходящего транскрипционного терминатора, последовательностью, которая распознается клеткой мицелиального гриба при терминации транскрипции. Последовательность терминатора функционально связана с 3'-концом последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Любой терминатор, который является функциональным в клетке, может быть использован в настоящем изобретении. Необязательные терминаторы для клеток мицелиальных грибов получают из генов, кодирующих амилазу TAKA из A. oryzae, глюкоамилазу (glaA) из A. niger, антранилатсинтазу из A. nidulans, ген trpC и трипсиноподобную протеазу из Fusarium oxysporum. Ниже нуклеотидной последовательности по изобретению может располагаться 3'-нетранслируемая область, содержащая один или несколько участков терминации транскрипции (например, терминатор). Точка начала терминации является менее критичной. Терминатор может, например, быть естественным терминатором последовательности ДНК, кодирующей пептид. Предпочтительно, если терминатор мице-9 021636 лиальных грибов используется в клетках-хозяевах из мицелиальных грибов. Более предпочтительно, если терминатор является эндогенным терминатором клетки-хозяина (в которой экспрессируется нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид). В транскрибируемой области может присутствовать участок связывания с рибосомами. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессируемых конструкциями, будет включать инициирующий трансляцию триплет AUG в начале и кодон терминации в соответствующей позиции в конце транслируемого полипептида. См. также примечания относительно Козак и стоп, как в WO 2006/07725). Термин "промотор" определяется в данном документе как последовательность ДНК, которая связывает РНК-полимеразу и направляет полимеразу к правильному нижележащему участку начала транскрипции нуклеотидной последовательности, кодирующей биологическое соединение для инициации транскрипции. РНК-полимераза эффективно катализирует сборку матричной РНК, которая комплементарна соответствующей цепи ДНК кодирующей области. Термин "промотор" также будет пониматься как включающий 5'-некодирующую область (между промотором и стартом трансляции) для трансляции после транскрипции в мРНК, цис-действующие контрольные элементы, такие как энхансеры, и другие нуклеотидные последовательности, способные взаимодействовать с факторами транскрипции. Промотор может быть последовательностью любого соответствующего промотора, подходящего для эукариотической или прокариотической клетки-хозяина, который демонстрирует транскрипционную активность,включая мутантный, укороченный и гибридные промоторы, и может быть получен из генов, кодирующих экстраклеточные и внутриклеточные полипептиды, либо гомологичные (естественные), либо гетерологичные (инородные) по отношению к клетке. Промотор может быть конститутивным или индуцируемым. Примерами индуцируемых промоторов, которые могут быть использованы, являются промоторы, индуцируемые крахмалом, медью, олеиновой кислотой. Промотор может быть выбран из группы,которая включает, но не ограничивается промоторами, полученными из генов, кодирующих амилазуTAKA из А. oryzae, аспарагиновую протеазу из Rhizomucor miehei, нейтральную -амилазу из А. niger,кислотостабильную -амилазу из A. niger, глюкоамилазу (glaA) из A. niger или A. awamori, липазу из R.miehei, щелочную протеазу из A. oryzae, триозофосфатизомеразу из A. oryzae, ацетамидазу из A. nidulans,NA2-три промотор (гибрид промоторов из генов, кодирующих нейтральную -амилазу из A. niger и триозофосфатизомеразу из А. oryzae), промоторы, полученные из генов, кодирующих cbh1, cbh2, eg1,eg2, eg3, eg5, eg6, xln1, xln2 или xyl1, и их мутантные, укороченные или гибридные промоторы. В любом из воплощений промотор выбирают из промотора последовательности ДНК, кодирующей полипептид,или гетерологичного промотора, выбранного из группы, состоящей из промоторов glaA из A. niger, cbhl из Т. emersonii и bg из Т. emersonnii или их функциональных частей, которым необязательно выше предшествуют активирующие последовательности. В другом воплощении промоторы для применения в клетках мицелиальных грибов являются промотором или его функциональной частью из гена протеазы, например из трипсинподобной протеазы изF. oxysporum (США 4288627), гена щелочной протеазы (alp) из A. oryzae, гена расА из A. niger, гена щелочной протеазы из A. oryzae, гена нейтральной металлопротеазы из A. oryzae, гена протеазы аспергиллопепсина рерА из А. niger или гена трипсина из F. venenatum, гена аспарагиновой протеазы рерВ из A.niger. Другие промоторы являются промоторами, описанными в WO 2006/092396 и WO 2005/100573,которые включены в данный документ ссылкой. Применение множества промоторов в одиночной цепи описано в WO 2008/098933. Раскрытие WO 2008/098933 может быть использована в этом изобретении. Специалисту в данной области следует понимать, что конструирование экспрессирующего вектора может зависеть от таких факторов, как желаемый уровень экспрессии полипептида и т.п. Векторы изобретения, такие как экспрессирующие векторы, могут быть введены в клетки-хозяева для того, чтобы посредством этого продуцировать полипептид или пептиды, кодируемые нуклеиновыми кислотами, описанными в данном документе (например, полипептиды, мутантные формы полипептидов, фрагменты,варианты или их функциональные эквиваленты). Соответственно, полезные в настоящем изобретении экспрессирующие векторы включают векторы, полученные на основе хромосом, эписом и вирусов, например векторы, полученные из бактериальных плазмид, бактериофагов, дрожжевой эписомы, дрожжевых хромосомных элементов, вирусов, таких как бакуловирусы, паповавирусы, вирусы осповакцины,аденовирусы, вирусы оспы-дефтерита птиц, вирусы псевдобешенства и ретровирусы, и векторы, полученные на основе их комбинаций, таких как те, что получены из генетических элементов плазмид и бактериофагов, такие как космиды и фагмиды. Согласно изобретению используют культуральную среду и культуральные условия, описанные в данном документе в примерах, или используют альтернативную среду и культуральные условия, которые обладают схожей эффективностью. Интеграция. В соответствии с любым воплощением изобретения осуществляют интеграцию. В таком воплощении интегрирующий клонирующий вектор может интегрировать в случайном или заданном локусемишени в хромосоме клетки-хозяина, в которую он интегрируется. В любом из воплощений изобретения для направленной интеграции клонирующего вектора в заданный локус, интегрирующий клонирующий- 10021636 вектор содержит фрагмент ДНК, который является гомологичным последовательности ДНК в заданном локусе-мишени в геноме клетки-хозяина. Для стимуляции направленной интеграции вектор для клонирования предпочтительно линеаризуют перед трансформацией клеток-хозяев. Линеаризацию предпочтительно осуществляют так, чтобы по меньшей мере один, но предпочтительно и другой конец клонирующего вектора фланкировался последовательностями, гомологичными локусу-мишени. Длина гомологичных последовательностей, фланкирующих локус-мишень, предпочтительно равна по меньшей мере 0,1 тыс. п.о., например равна по меньшей мере 0,2 тыс. п.о., еще более предпочтительно равна по меньшей мере 0,5 тыс. п.о., еще более предпочтительно равна по меньшей мере 1 тыс. п.о., наиболее предпочтительно равна по меньшей мере 2 тыс. п.о. Предпочтительно, если родительские штаммы-хозяева могут быть модифицированы для повышения частоты адресной интеграции ДНК, как описано в WO 05/095624 и/или WO 2007/115886. Предпочтительно, если эффективность адресной интеграции в геном клетки-хозяина, т.е. интеграции в заданный локус-мишень, повышается посредством усиленной способности к гомологичной рекомбинации клетки-хозяина. Такой фенотип клетки предпочтительно включает дефицит по генам hdfA илиhdfB, как описано в WO 2005/095624. В WO 2005/095624 раскрыт способ получения клетки мицелиального гриба, включающий повышенную эффективность адресной интеграции. Вектор может содержать полинуклеотид по изобретению ориентированный в антисмысловом направлении для обеспечения продуцирования антисмысловой РНК. Синтетические полинуклеотиды могут быть оптимизированы по использованию кодонов, предпочтительно согласно способам, описанным вWO 2006/077258 и/или РСТ/ЕР 2007/055943, которые включены в данный документ ссылкой. В PCT/EP 2007/055943 рассматривается оптимизация кодоновых пар. Оптимизация кодоновых пар представляет собой способ, в котором нуклеотидные последовательности модифицируют в соответствии с частотой использования их кодонов, в частности используемых кодоновых пар, для получения улучшенной экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, и/или для улучшенной выработки кодируемого полипептида. Кодоновые пары определяются как набор двух последовательных триплетов(кодонов) в кодирующей последовательности. Прикладные воплощения. Если полипептид по изобретению будет секретироваться клеткой-хозяином в среду для культивирования, то в полипептид может быть добавлена соответствующая сигнальная последовательность для направления синтезированного de novo полипептида в путь секреции клетки-хозяина. Специалист в данной области знает, как выбрать подходящую сигнальную последовательность для конкретного хозяина. Сигнальная последовательность может быть естественной для клетки-хозяина или может быть инородной для клетки-хозяина. Например, может быть использована сигнальная последовательность из полипептида, естественного для клетки-хозяина. Предпочтительно, если указанный естественный полипептид является сильно секретируемым полипептидом, т.е. полипептидом, который секретируется в количествах более высоких, чем 10% от общего количества секретируемых полипептидов. В качестве альтернативы сигнальной последовательности полипептид изобретения может быть слит с секретируемым полипептидом-носителем или с его частью. Такой химерный продукт направляется по пути секреции с помощью сигнальной последовательности полипептида-носителя или его части. Кроме того, полипептид-носитель обеспечит стабилизирующий эффект для полипептида по изобретению или может усилить растворимость. Такой полипептид-носитель может быть любым полипептидом. Предпочтительно, если хорошо секретируемый полипептид используют в качестве полипептида-носителя. Полипептид-носитель может быть естественным или инородным по отношению к полипептиду по изобретению. Полипептид-носитель может быть естественным или может быть инородным по отношению к клетке-хозяину. Примерами таких полипептидов носителей являются глюкоамилаза, пре-пропоследовательность -фактора спаривания, целлюлозосвязывающий домен целлюлозосвязывающего полипептида А из Clostridium cellulovorans, глутатион-S-трансфераза, хитинсвязывающий домен хитиназы А 1 из Bacillus circulans, мальтозосвязывающий домен, кодируемый геном malE из Е. coli K12 галактозидаза и щелочная фостфатаза. Необязательным полипептидом-носителем для экспрессии такого химерного конструкта в клетках Aspergillus является глюкоамилаза. Полипептид-носитель и полипептид по изобретению может содержать конкретный аминокислотный мотив для облегчения выделения полипептида; полипептид по изобретению может быть высвобожден специальным высвобождающим агентом. Высвобождающим агентом может быть протеолитический фермент или химический агент. Примером такого аминокислотного мотива является участок расщепления протеазы KEX, который хорошо известен специалистам в данной области. Сигнальная последовательность может быть использована для облегчения секреции и выделения полипептида или полипептида изобретения. Сигнальные последовательности, как правило, характеризуются ядром гидрофобных аминокислот, которые, как правило, отрезаются от зрелого белка в процессе секреции за один или два шага расщепления. Такие сигнальные пептиды содержат сайты процессирования, которые позволяют отрезать сигнальную последовательность от зрелых полипептидов, как только они проходят через секреторный путь. Сигнальная последовательность направляет секрецию полипепти- 11021636 да, например, из эукариотического хозяина, в который трансформирован экспрессирующий вектор, и сигнальная последовательность последовательно или параллельно отрезается. Затем полипептид может быть легко очищен от внеклеточной среды известными способами. В ином случае сигнальная последовательность может быть связана с представляющим интерес полипептидом с последовательностью, которая облегчает очистку, например, такой как домен GST. Так, например, последовательность, кодирующая полипептид, может быть объединена с последовательностью маркера, например с последовательностью, кодирующей пептид, который способствует очистке химерного полипептида. В некоторых воплощениях этого аспекта изобретения маркерная последовательность представляет собой пептид гексагистидина, такой как, среди прочего, метка, предоставляемая вектором pQE (Qiagen, Inc.). Как описано в работе Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), например, гексагистидин обеспечивает удобную очистку химерного белка. НА-метка является другим полезным для очистки пептидом, который соответствует эпитопу, полученному из белка-гемагглютинина гриппа, который, например, был описан в работе Wilson et al., Cell 37:767 (1984). Как правило, трансформант может быть создан путем снижения или устранения экспрессии некоторых генов. Редукция или удаление этих генов может быть благоприятной, поскольку может повысить выход требуемых полипептидов и может также снизить деградацию требуемых полипептидов под влиянием полипептида, экспрессируемого редуцируемым или удаленным геном. Редукция или делеция могут быть осуществлены с помощью одного или нескольких способов, хорошо известных в данной области, например вставкой, разрушением, заменой или удалением. Способами редукции или удаления являются способы сайт-направленного или неспецифического мутагенеза. Модифицируемая или инактивируемая часть гена может быть, например, кодирующей областью или регуляторным элементом, требуемым для экспрессии кодирующей области. Примером такой регуляторной или контролирующей последовательности может быть последовательность промотора или ее функциональная часть, т.е. часть, которая достаточна для воздействия на экспрессию полипептида. Другие контрольные последовательности для возможной модификации включают, без ограничения перечисленным, лидерную последовательность, последовательность пропептида, препропептид, последовательность Козак, последовательность инициации транскрипции, сигнальную последовательность, последовательность терминатора транскрипции, последовательность активатора транскрипции, участок инициации трансляции и участок терминации трансляции. В любом из воплощений полинуклеотиды настоящего изобретения, описанные в данном документе,могут быть сверхэкспрессированы в микробном штамме изобретения по сравнению с родительским микробным штаммом, в котором указанный ген не сверхэкспрессирован. Сверхэкспрессия полинуклеотидной последовательности определяется в данном документе как экспрессия последовательности указанного гена, которая приводит к появлению активности фермента, кодируемого указанной последовательностью в микробном штамме, которая составляет по меньшей мере около 1,2 активности фермента в родительском микробном штамме; по меньшей мере 1,5 активности, предпочтительно активность указанного фермента составляет по меньшей мере около 2, по меньшей мере около 3, по меньшей мере около 4, по меньшей мере около 5, по меньшей мере около 10, по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 100, по меньшей мере около 200, по меньшей мере около 500, по меньшей мере около 1000 активностей фермента в родительском штамме. В одном воплощении может быть получен химерный полипептид. Так, например, фрагменты ДНК,кодирующие различные полипептидные последовательности, лигируют с сохранением рамки считывания в соответствии с обычными методами, например, путем применения лигирования по тупым или липким концам, гидролиза рестрикционными ферментами для обеспечения необходимых концов, заполнения липких концов в случае необходимости, обработки щелочной фосфатазой для предотвращения нежелательного объединения и энзиматического лигирования. В другом воплощении химерный ген может быть синтезирован традиционными методами, включая автоматические синтезаторы ДНК. В ином случае может быть проведена амплификация ПЦР генных фрагментов с помощью якорных праймеров, которые дают начало комплементарному перекрытию между двумя последовательными генными фрагментами, которые могут быть последовательно отожжены и реамплифицированы при образовании химерной генной последовательности (см., например, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. JohnWileySons: 1992). Более того, множество коммерчески доступных экспрессирующих векторов уже кодируют химерный функциональный компонент (например, полипептид GST). Кодирующая нуклеиновая кислота может быть клонирована в такой экспрессирующий вектор, в котором химерная функциональная составляющая связывается в рамке считывания с белком полипептидом таким образом, чтобы химерные полипептиды находились в рамке считывания и экспрессия химерного полипептида находилась под контролем того же промотора(ов) и терминатора. Гибридные полипептиды могут содержать комбинацию частичной или полной полипептидных последовательностей, полученных по меньшей мере из двух различных полипептидов, среди которых один или несколько могут быть гетерологичными по отношению к клетке-хозяину.- 12021636 Экспрессия/получение полипептида. Согласно изобретению полипептид экспрессируется трансформантом Talaromyces. ТрансформантTalaromyces, таким образом, может быть использован при получении полипептида согласно изобретению. Такой способ включает культивирование клетки-хозяина (например, трансформированной, как описано выше) в условиях, которые обеспечивают экспрессию последовательности, кодирующей полипептид, и, необязательно, извлечение экспрессируемого полипептида. В контексте настоящего изобретения термин "рекомбинантный" относится к любой генетической модификации, не обязательно вовлеченной в естественные процессы и/или генетические модификации,индуцированные в клетке-хозяине неспецифическим мутагенезом, а также, например, разрушениями и/или делециями и/или специфическим мутагенезом генов. Следовательно, комбинации рекомбинантного и естественного процессов и/или генетических модификаций, индуцированных в клетке-хозяине неспецифическим мутагенезом, трактуются как рекомбинантные. Рекомбинантные клетки Talaromyces (трансформанты) по изобретению можно культивировать с помощью процедур, известных в данной области. Для каждой комбинации промотора и хозяйской клетки доступны культуральные условия, которые способствуют экспрессии последовательности ДНК, кодирующей полипептид. После достижения требуемой плотности клеток или титра полипептида рост культуры останавливают и выделяют полипептид с помощью известных способов. Ферментационная среда может содержать культуральную среду, содержащую источник углерода(например, глюкозу, мальтозу, патоку, крахмал, целлюлозу, ксилан, пектин, гидролизат лигноцеллюлолитической биомассы и т.п.), источник азота (например, сульфат аммония, нитрат аммония, хлористый аммоний и т.д.), источники органического азота (например, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт,пептон и т.п.), источники неорганических питательных веществ (например, фосфата, магния, калия, цинка, железа и т.п.). Необязательно, может быть включен индуктор (например, целлюлоза, пектин, мальтоза, мальтодекстрин или ксилогалактуронан). Выбор подходящей среды может быть основан на выборе экспрессирующего хозяина и/или может быть основан на потребностях экспрессирующей конструкции. Такие среды известны специалистам в данной области. Среда может, при необходимости, содержать дополнительные компоненты, оказывающие благоприятное воздействие на трансформированных экспрессирующих хозяев по сравнению с потенциально контаминирующими организмами. Ферментация может быть осуществлена в течение 0,5-30 дней. Ферментация может быть периодическим процессом, непрерывным процессом, периодическим процессом с добавлением субстрата, при соответствующей температуре в диапазоне, например, от около 20 до около 90 С, предпочтительно 2055 С, более предпочтительно 40-50 С и/или при рН, например, от около 2 до около 8, предпочтительно от около 3 до около 5. Соответствующие условия, как правило, выбирают исходя из выбора экспрессирующего хозяина и полипептида, который будет экспрессироваться. После ферментации, если необходимо, клетки могут быть удалены из ферментационного бульона центрифугированием или фильтрацией. После остановки ферментации или после удаления клеток полипептид изобретения может быть извлечен и, если требуется, очищен и выделен обычными средствами. Полипептид/полипептидные композиции. В изобретении предлагаются полипептид или полипептидная композиция, которые содержат целлюлазу и/или гемицеллюлазу и/или пектиназу. В данном документе целлюлаза является любым полипептидом, который способен деградировать или модифицировать целлюлозу и/или глюканы. Полипептид, который способен деградировать целлюлозу, является полипептидом, катализирующим процесс разрушения целлюлозы на более мелкие единицы либо частично, например, на целлодекстрины, либо полностью на глюкозные мономеры. Целлюлаза по изобретению может дать смешанную популяцию целлодекстринов и глюкозных мономеров при контакте с целлюлозой. Такая деградация будет, как правило, проводится путем реакции гидролиза. В данном документе гемицеллюлаза является любым полипептидом, который способен деградировать или модифицировать гемицеллюлозу. Иначе говоря, гемицеллюлаза может быть способна деградировать или модифицировать один или несколько из числа ксилана, арабана, глюкуроноксилана, арабиногалактана, арабиноксилана, глюкоманнана, галактоманнана и ксилоглюкана. Полипептид, который способен деградировать гемицеллюлозу, является ферментом, катализирующим процесс разрушения гемицеллюлозы на более мелкие полисахариды либо частично, например, на олигосахариды, либо полностью на мономерные сахара, например гексозный или пентозный сахарные мономеры. Гемицеллюлаза по изобретению может дать смешанную популяцию олигосахаридов и сахарных мономеров при контакте с гемицеллюлазой. Такая деградация будет, как правило, проводиться путем реакции гидролиза. В данном документе пектиназа является любым полипептидом, способным деградировать или модифицировать пектин. Полипептид, который способен деградировать пектин, является полипептидом,катализирующим процесс разрушения пектина на более мелкие единицы либо частично, например, в олигосахариды, либо полностью в сахарные мономеры. Пектиназа по изобретению может дать смешанную популяцию олигосахаридов и сахарных мономеров. Такая деградация будет, как правило, проводиться гидролизом.- 13021636 Соответственно, композиция изобретения может содержать любую целлюлазу, например целлобиогидролазу, и эндо 1,4-глюканазу, -глюкозидазу или -(1,3)(1,4)-глюканазу. В данном документе целлобиогидролазой (ЕС 3.2.1.91) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз 1,4D-гликозидных связей в целлюлозе или целлотетраозе, высвобождая целлобиозу с невосстанавливающих концов цепей. Этот фермент может также называться целлюлазой 1,4 целлобиозидазой, 1,4 целлобиогидролазой, 1,4D-глюканцеллобиогидролазой, авицелазой,экзо-1,4D-глюканазой, экзоцеллобиогидролазой или экзоглюканазой. В данном документе эндо 1,4-глюканазой (ЕС 3.2.1.4) является любой полипептид, который способен катализировать эндогидролиз 1,4D-глюкозидных связей в целлюлозе, лихенине или -Dглюканах зерновых. Такой полипептид также может быть способен гидролизовать 1,4-связи в -Dглюканах, также содержащих 1,3-связи. Этот фермент может также называться целлюлазой, авицелазой,-1,4-эндоглюкангидролазой, -1,4-глюканазой, карбоксиметилцеллюлазой, целлудекстриназой, эндо 1,4D-глюканазой, эндо-1,4D-глюканогидролазой, эндо-1,4 глюканазой или эндоглюканазой. В данном документе -глюкозидазой (ЕС 3.2.1.21) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз концевых, невосстанавливающих остатков -D-глюкозы с высвобождением D-глюкозы. Такой полипептид может обладать широкой специфичностью по отношению к -Dглюкозидам и может также гидролизовать одно или несколько из представленных: -D-галактозид, -Lарабинозид, -D-ксилозид или -D-фукозид. Этот фермент также может называться амигдалазой, -Dглюкозидглюкогидролазой, целлобиазой или гентобиазой. В данном документе -(1,3)(1,4)-глюканазой (ЕС 3.2.1.73) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз 1,4D-глюкозидных связей в -D-глюканах, содержащих 1,3- и 1,4 связи. Такие полипептиды могут действовать на лихенин и -D-глюканы зерновых, но не на -Dглюканы, содержащие только 1,3- или 1,4-связи. Этот фермент может также называться лихениназой,1,3-1,4D-глюкан-4-глюканогидролазой, -глюканазой, эндо 1,3-1,4-глюканазой, лихеназой или глюконазой смешанных связей. Альтернативой для этого типа фермента является ЕС 3.2.1.6, который описан как эндо-1,3(4)глюконазой. Этот тип фермента гидролизует 1,3- или 1,4-связи в -D-глюканах,когда остаток глюкозы, чья восстанавливающая группа участвует в образовании гидролизуемой связи,самозамещается по С-3. Альтернативные названия включают эндо-1,3 глюканазу, ламинариназу, 1,3(1,3;1,4)D-глюкан-3(4)-глюканогидролазу; субстраты включают ламинарин, лихенин и -D-гликаны зерновых. Композиция изобретения может содержать любую гемицеллюлазу, например эндоксиланазу, ксилозидазу, -L-арабинофуранозидазу, 1,4D-арабиноксиланарабинофурангидролазу, ацетилксиланэстеразу, -D-глюкуронидазу, целлобиогидролазу, феруоилэстеразу, коумароилэстеразу, -галактозидазу,-галактозидазу, -маннаназу или -маннозидазу. В данном документе эндоксиланаза (ЕС 3.2.1.8) является ферментом, который способен катализировать эндогидролиз 1,4D-ксилозидных связей в ксиланах. Этот фермент также называют эндо-1,4-ксиланазой или 1,4D-ксиланксиланогидролазой. Альтернативой является ЕС 3.2.1.136, глюкоуроноарабиноксиланэндоксиланаза, фермент, который способен гидролизовать 1,4-ксилозидные связи в глюкуроноарабиноксиланах. В данном документе -ксилозидазой (ЕС 3.2.1.37) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз 1,4D-ксиланов, удалять последовательные остатки D-ксилозы с невосстанавливающих концов. Такие ферменты могут также гидролизовать ксилобиозу. Этот фермент также называется ксилан-1,4 ксилозидазой, 1,4D-ксиланксилогидролазой, экзо-1,4 ксилозидазой или ксилобиазой. В данном документе -L-арабинофуранозидазой (ЕС 3.2.1.55) является любой полипептид, который способен действовать на -L-арабинофуранозиды, -L-арабинаны, содержащие (1,2)-, и/или (1,3)-, и/или(1,5)-связи, арабиноксиланы и арабиногалактаны. Этот фермент может также называться -Nарабинофуранозидаза, арабинофуранозидаза или арабинозидаза. В данном документе -D-глюкуронидазой (ЕС 3.2.1.139) является полипептид, который способен катализировать реакцию следующего вида: -D-глюкоронозид + H2O = спирт + D-глюкуронат. Этот фермент может также называться -глюкуронидазой или -глюкозидуроназой. Эти ферменты также могут гидролизовать 4-О-метилированную глюкуроновую кислоту, которая также может присутствовать в качестве заместителя в ксиланах. Альтернативой является ЕС 3.2.1.131: ксилан-альфа-1,2 глюкуронозидаза, которая катализирует гидролиз -1,2-(4-О-метил)глюкуронозильных связей. В данном документе целлобиогидролазой (ЕС 3.1.1.72) является любой полипептид, который способен катализировать деацетилирование ксиланов и ксилоолигосахаридов. Такой полипептид может катализировать гидролиз ацетильных групп на полимерном ксилане, ацетилированной ксилозе, ацетилированной глюкозе, -нафтилацетате или р-нитрофенилацетате, но, как правило, не на триацетилглицерине. Такой полипептид, как правило, не действует на ацетилированный маннан или пектин.- 14021636 В данном документе ацетилксиланэстеразой (ЕС 3.2.1.6) является фермент, который способен гидролизовать специфически эфирные связи ацетильных групп в позиции 2 и/или в позиции 3 ксилозных составляющих природного ксилана. В данном документе феруоилэстеразой (ЕС 3.1.1.73) является любой полипептид, который способен катализировать реакцию вида феруоил-сахарид + H2O = ферулат + сахарид. Сахарид может быть, например, олигосахаридом или полисахаридом. Он может, как правило, катализировать гидролиз 4-гидрокси 3-метроксициннамоильной (феруоильной) группы с этерифицированного сахара, которым обычно является арабиноза в "естественных" субстратах, р-нитрофенолацетат и метилферулат, как правило, являются более слабыми субстратами. Этот фермент также называют гидролазой циннамоилового эфира, эстеразой феруловой кислоты или гидроксициннамоилэстеразой. Он также может называться вспомогательным ферментом гемицеллюлазы, поскольку он может помогать ксиланазам и пектиназам разрушать гемицеллюлозу и пектин клеточной стенки растений. В данном документе кумароилэстеразой (ЕС 3.1.1.73) является любой полипептид, который способен катализировать реакцию вида кумароил-сахарид + H2O = кумарат + сахарид. Сахарид может быть,например, олигосахаридом или полисахаридом. Этот фермент также называют транс-4 кумароилэстеразой, транс-р-кумароилэстеразой, р-кумароилэстеразой или эстеразой р-кумаровой кислоты. Этот фермент также входит в ЕС 3.1.1.73, так что также может называться ферруоилэстеразой. В данном документе -галактозидазой (ЕС 3.2.1.22) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз конечных, невосстанавливающих -D-галактозных остатков в -Dгалактозидах, включая галактозные олигосахариды, галактоманнаны, галактаны и арабиногалактаны. Такой полипептид может быть способен гидролизовать -D-фукозиды. Этот фермент может также называться мелибиазой. В данном документе -галактозидазой (ЕС 3.2.1.23) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз концевых невосстанавливающих остатков -D-галактозы в -D-галактозидах. Такой полипептид может быть способен гидролизовать -L-арабинозиды. Этот фермент также может упоминаться как экзо-(14)D-галактаназа или лактаза. В данном документе -маннаназой (ЕС 3.2.1.78) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз 1,4D-маннозидных связей в маннанах, галактоманнанах и глюкоманнанах. Этот фермент может также называться маннаноэндо-1,4 маннозидазой или эндо-1,4-маннаназой. В данном документе -маннозидазой (ЕС 3.2.1.25) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз концевых невосстанавливающих остатков -D-маннозы в -D-маннозидах. Этот фермент может также называться манноназой или манназой. Композиция изобретения может содержать любую пектиназу, например эндополигалактуроназу,пектинметилэстеразу, эндогалактаназу, -галактозидазу, пектинацетилэстеразу, эндопектинолиазу, пектатлиазу, -рамнозидазу, экзогалактуроназу, экзополигалактуронатлиазу, рамногалактуронангидролазу,рамногалактуронанлиазу, рамногалактуронанацетилэстеразу, рамноглактуронангалактуроногидролазу и ксилогалактуроназу. В данном документе эндополигалактуроназа (ЕС 3.2.1.15) является любым полипептидом, который способен катализировать случайный гидролиз 1,4D-галактозидуроновых связей в пектате и других галактуронанах. Этот фермент может также называться полигалактуроназа пектиндеполимераза, пектиназа, эндополигалактуроназа, пектолаза, пектингидролаза, пектинполигалактуроназа, поли 1,4 галактуронидгликангидролаза,эндогалактуроназа; эндо-D-галактуроназа или поли(1,4Dгалактуронид)гликангидролаза. В данном документе пектинметилэстераза (ЕС 3.1.1.11) является любым ферментом, который способен катализировать реакцию пектин + n H2O = n метанол + пектат. Фермент может быть также известен как пектинэстераза, пектиндеметоксилаза, пектинметоксилаза, пектинметилэстераза, пектаза, пектиноэстераза или пектинпектилгидролаза. В данном документе эндогалактаназа (ЕС 3.2.1.89) является любым ферментом, который способен катализировать эндогидролиз 1,4D-галактозидных связей в арабиногалактанах. Данный фермент может быть также известен как арабиногалактанэндо-1,4 галактозидаза, эндо-1,4 галактаназа, галактаназа, арабиногалактаназа или арабиногалактан-4D-галактаногидролаза. В данном документе пектинацетилэстераза определяется как любой фермент, который имеет ацетилэстеразную активность, которая катализирует деацетилирование ацетильных групп на гидроксильных группах остатков GalUA пектина. В данном документе эндопектинлиаза (ЕС 4.2.2.10) является любым ферментом, который способен катализировать элиминирующее расщепление (14)D-галактуронанметилового эфира для получения олигосахаридов с 4-деокси-6-О-метилD-галакт-4-энуронозиловых групп на их невосстанавливающих концах. Данный фермент также может быть известен как пектинлиаза, пектин-транс-элиминаза; эндопектинлиаза, полиметилгалактуроновая трансэлиминаза, пектинметилтрансэлиминаза, пектолиаза, PL, PNL или PMGL или (14)-6-О-метилD-галактуронанлиаза.- 15021636 В данном документе пектатлиаза (ЕС 4.2.2.2) является любым ферментом, способным катализировать элиминирующее расщепление (14)D-галактоуронана с тем, чтобы дать олигосахариды с 4 деоксиD-галакт-4-энуронозиловыми группами на их невосстанавливающих концах. Данный фермент также может быть известен как полигалактуроновая трансэлиминаза, трансэлиминаза пектиновой кислоты, полигалактуронатлиаза, эндопектинметилтрансэлиминаза, пектаттрансэлиминаза, эндогалактуронаттрансэлиминаза, лиаза пектиновой кислоты, пектиновая лиаза, лиаза -1,4-D-эндополигалактуроновой кислоты, PGA-лиаза, РРаза-N, лиаза эндо 1,4-полигалактуроновой кислоты, лиаза полигалактуроновой кислоты, пектинтрансэлиминаза, трансэлиминаза полигалактуроновой кислоты или (14)Вгалактуронанлиаза. В данном документе -рамнозидаза (ЕС 3.2.1.40) является любым полипептидом, который способен катализировать гидролиз концевых невосстанавливающих остатков -L-рамнозы в -L-рамнозидах или,в ином случае, в рамногалактоуронане. Этот фермент может быть также известен как -L-рамнозидаза Т,-L-рамнозидаза N или -L-рамнозидрамногидролаза. В данном документе экзогалактуроназа (ЕС 3.2.1.82) является полипептидом, способным гидролизовать пектиновую кислоту на невосстанавливающем конце, высвобождая дигалактуронат. Фермент также может быть известен как экзополигалактуронозидаза, экзополигалактуронозидаза или экзополигалактуранозидаза. В данном документе экзогалактуроназой (ЕС 3.2.1.67) является любой полипептид, который способен катализировать реакцию (1,4D-галактуронид)n + H2O = (1,4D-галактуронид)n-i + D-галактуронат. Фермент может быть также известен как 1,4 галактуронидаза, экзополигалактуроназа, поли(галакуронат)гидролаза, экзо-D-галактуроназа, экзо-D-галактуронаназа, экзополи-D-галактуроназа или поли(1,4D-галактуронид)галактуроногидролаза. В данном документе экзополигалакуронатлиазой (ЕС 4.2.2.9) является любой полипептид, который способен катализировать элиминирующее расщепление 4-(4-дезоксиD-галакт-4-энуронозил)-Dгалактуроната на восстанавливающем конце пектата, т.е. катализировать деэтерифицированного пектина. Этот фермент может быть известен как пектатдисахаридлиаза, пектатэкзолиаза, трансэлиминаза экзопектиновой кислоты, экзопектатлиаза, экзополигалактуроновая кислота-транс-элиминаза, РАТЕ, экзо-РАТЕ,экзо-PGL или (14)D-галактуронандисахаридлиаза восстанавливающих концов. В данном документе рамногалактуронангидролазой является любой полипептид, который способен гидролизовать связь между галактозилуроновой кислотой и рамнопиранозилом в любой эндоформе в строго переменных рамногалактуронановых структурах, состоящих из дисахарида [(1,2L-рамноил(1,4)галактозилуроновой] кислоты. В данном документе рамногалактоуронанлиазой является полипептид, который является любым полипептидом, способным расщеплять связи -L-Rhap-(14)D-GalpA в эндоформе в рамногалактоуронане посредством -элиминации. В данном документе рамногалактоуронанацетилэстеразой является любой полипептид, который катализирует деацетилирование каркаса перемежающихся остатков рамнозы и галактуроновой кислоты в рамногалактуронане. В данном документе рамногалактоуронангалактуроногидролазой является любой полипептид, который способен гидролизовать галактуроновую кислоту на невосстанавливающем конце строго перемежающейся структуры рамногалактуронана в экзоформе. В данном документе ксилогалактуроназой является любой полипептид, который действует на ксилогалактуронан посредством отщепления -ксилозозамещенного каркаса из галактуроновой кислоты в эндо-форме. Данный фермент также может быть известен как ксилогалактуронангидролаза. В данном документе -L-арабинофуранозидазой (ЕС 3.2.1.55) является любой полипептид, который способен действовать на -L-арабинофуранозиды, -L-арабинаны, содержащие (1,2)-, и/или (1,3)-, и/или(1,5)-связи, арабиноксиланы и арабиногалактаны. Этот фермент может также называться -Nарабинофуранозидаза, арабинофуранозидаза или арабинозидаза. В данном документе эндоарабинозидазой (ЕС 3.2.1.99) является любой полипептид, который способен катализировать эндогидролиз 1,5 арабинофуранозидных связей в 1,5-арабинанах. Фермент может быть также известен как эндоарабиназа, арабинанэндо-1,5L-арабинозидаза, эндо-1,5Lарабинаназа, эндо 1,5-арабаназа; эндоарабаназа или 1,5L-арабинан-1,5L-арабинаногидролаза. Композиция по изобретению, как правило, будет содержать по меньшей мере одну целлюлазу,и/или по меньшей мере одну гемицеллюлазу, и/или по меньшей мере одну пектиназу (одна из которых является полипептидом по изобретению). Композиция изобретения может содержать целлобиогидролазу, эндоглюканазу и/или -гликозидазу. Такая композиция может также содержать одну или несколько гемицеллюлаз и/или одну или несколько пектиназ. В композиции изобретения могут присутствовать один или несколько (например, две, три, четыре или все) из числа амилазы, протеазы, липазы, лигниназы, гексозилтрансферазы или глюкуронидазы."Протеаза" включает ферменты, которые гидролизуют пептидные связи (пептидазы), а также фер- 16021636 менты, которые гидролизуют связи между пептидами и другими составляющими, такими как сахара(гликопептидазы). Множество протеаз, относящихся к классу ЕС 3.4 и подходящих для применения в изобретении, включены в данный документ ссылкой. Некоторые специфичные типы протеаз включают цистеиновые протеазы, включая пепсин, папаин, и сериновые протеазы, включая химотрипсины, карбоксипептидазы и металлоэндопептидазы."Липазы" включают ферменты, которые гидролизуют липиды, жирные кислоты и ацилглицериды,включая фосфоглицериды, липопротеины, диацилглицерины и т.п. В растениях липиды используются в качестве структурных компонентов для ограничения потерь воды и патогенных инфекций. Эти липиды включают воски, полученные из жирных кислот, а также кутин и суберин."Лигниназа" включает ферменты, которые могут гидролизовать или разрушать структуру лигниновых полимеров. Ферменты, которые могут разрушить лигнин, включают лигнинпероксидазы, марганецпероксидазы, лакказы и феруоилэстеразы и другие описанные в данной области ферменты, известные своей способностью деполимеризовать или, в ином случае, разрушать лигниновые полимеры. Также включенными являются ферменты, способные гидролизовать связи, образованные между гемицеллюлозными сахарами (в частности, арабинозой) и лигнином. Лигниназы включают, без ограничения перечисленным, следующие группы ферментов: лигнинпероксидазы (ЕС 1.11.1.14), марганецпероксидазы (ЕС 1.11.1.13), лакказы (ЕС 1.10.3.2) и феруоилэстеразы (ЕС 3.1.1.73)."Гексозилтрансфераза" (2.4.1) включает ферменты, которые способны переносить гликозильные группы, более конкретно гексозильные группы. В дополнение к переносу гликозильных групп из гликозилсодержащего донора к другому гликозилсодержащему соединению, акцептору фермент может также переносить гликозильную группу на воду в качестве акцептора. Данная реакция также известна как реакция гидролиза, а не реакция переноса. Примером гексозилтрансферазы, которая может быть использована в изобретении, является -глюканозилтрансфераза. Такой фермент может быть способен катализировать деградацию (1,3)(1,4)-глюкана и/или целлюлозы и/или продукта деградации целлюлозы."Глюкуронидаза" включает ферменты, которые катализируют гидролиз глюкуронозида, например-глюкуронозида, с получением спирта. Было охарактеризовано множество глюкуронидаз, которые могут подходить для применения в изобретении, например глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.31), гиалуроноглюкуронидаза (ЕС 3.2.1.36), глюкуронозил-дисульфглюкозамин-глюкуронидаза (3.2.1.56), глицирризинат-глюкуронидаза (3.2.1.128) или -D-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.139). Композиция изобретения может содержать экспансин или экспансиноподобный полипептид, такой как сволленин (см. Salheimo et al., Eur. J. Biohem. 269, 4202-4211, 2002) или своллениноподобный полипептид. Экспансины вовлечены в ослабление структуры клеточной стенки в ходе роста растительной клетки. Предполагается, что экспансины разрушают водородные связи между целлюлозой и другими полисахаридами клеточной стенки без осуществления гидролитической активности. Таким образом, они, как считается, позволяют раздвинуть целлюлозные волокна и расширить клеточную стенку. Сволленин, экспансиноподобный белок, содержит домен N-концевого углеводсвязывающего модуля семейства I (CBD) и С-концевой экспансиноподобный домен. Для целей изобретения экспансиноподобный белок или своллениноподобный белок могут содержать один или оба таких домена и/или могут привести к разрушению клеточных стенок (например, нарушая структуру целлюлозы), необязательно, без выработки детектируемых количеств восстанавливающих сахаров. Альтернативные полипептиды, которые могут присутствовать, например, выбирают из группы, состоящей из каталазы, лакказы, фенолоксидазы, оксидазы, оксидоредуктаз, целлюлазы, ксиланазы, пероксидазы, липазы, гидролазы, эстеразы, кутиназы, протеазы и других протеолитических ферментов, аминопептидазы, карбоксипептидазы, фитазы, лиазы, пектиназы и других пектинолитических ферментов,амилазы, глюкоамилазы, -галактозидазы, -галактозидазы, -глюкозидазы, -глюкозидазы, маннозидазы, изомеразы, инвертазы, трансферазы, рибонуклеазы, хитиназы, мутаназы и деоксирибонуклеазы. Изобретение также относится к композициям, содержащим один или несколько полипептидов по изобретению. В одном воплощении полипептидом изобретения является гемицеллюлаза, и композиция изобретения будет, как правило, содержать целлюлазу и/или пектиназу в дополнение к полипептиду изобретения. В дополнительном воплощении полипептидом изобретения является пектиназа, и композиция изобретения будет, как правило, содержать целлюлазу и/или гемицеллюлазу в дополнение к полипептиду изобретения. В дополнительном воплощении полипептидом изобретения является целлюлаза, и композиция изобретения будет, как правило, содержать гемицеллюлазу и/или пектиназу в дополнение к полипептиду изобретения. В любом из воплощений целлюлаза является одной или несколькими из числа СВН I, СВН II, EG или BG. Полипептид может быть одиночной целлюлазой и/или гемицеллюлазой или пектиназой или смесью целлюлазы и/или гемицеллюлазы и/или пектиназы и других полипептидов. В любом из воплощений полипептид является целлюлазой, которая является смесью двух полипептидов, выбранной из- 17021636 СВН I, СВН II, EG или BG. Предпочтительно, если целлюлаза является смесью, содержащей СВН I, СВН II, EG и BG. Композиция изобретения может содержать один, два или три класса целлюлаз, например одну, две или все из числа эндо-1,4 глюканазы (EG), экзоцеллобиогидролазы (СВН) и -глюкозидазы (BG). Композиция изобретения может содержать полипептид, который обладает схожей ферментативной активностью, например активностью схожего типа целлюлазы, гемицеллюлазы и/или пектиназы что и та,что обеспечена полипептидом изобретения. Композиция изобретения может содержать полипептид, который имеет другой тип целлюлазной активности, и/или гемицеллюлазной активности, и/или пектиназной активности, чем та, что обеспечена полипептидом изобретения. Например, композиция изобретения может содержать один тип целлюлазной, и/или гемицеллюлазной, и/или пектиназной активности, обеспеченной полипептидом изобретения,и второй тип целлюлазной, и/или гемицеллюлазной, и/или пектиназной активности, обеспеченной дополнительной целлюлазой/гемицеллюлазой/пектиназой. Композиция изобретения может содержать полипептидный продукт целлюлозоинтегрирующего фермента, скаффолдин или скаффолдиноподобный полипептид, например CipA или CipC из Clostridiumthermocellum или Clostridium cellulolyticum соответственно. Скаффолдины и целлюлозоинтегрирующие полипептиды являются мультифункциональными интегрирующими субъединицами, которые могут организовать целлулолитические субъединицы в мультиферментный комплекс. Организация достигается за счет взаимодействия двух комплементарных классов доменов, т.е. домена сцепления на скаффолдине и стыковочного домена на каждой ферментной единице. Субъединица скаффолдина также несет модуль связывания с целлюлозой (cellulose-binding module (CBM, который опосредует прикрепление целлюлосомы к ее субстрату. Скаффолдин или целлюлозоинтегрирующий полипептид для целей изобретения может содержать один или оба таких домена. В одном воплощении полипептидная композиция может содержать полипептиды, которые образуются из других микроорганизмов, отличных от Talaromyces, например CBH I из Trichoderma, CBH II изTrichoderma, BG из Trichoderma и/или EG из Trichoderma, -D-гликозид-глюкогидролазу, эндогалактаназу, сволленин, Cip1, Cip2, ксиланазу III, -ксиланазу XylA, ацетилксиланэстеразу, хитиназу, манназу. Композиция изобретения может содержать полипептид, индуцируемый или модулируемый целлюлозой полипептид, например кодируемый геном cip1 или cip2 или подобными генами из Trichodermareesei/Hypocrea jacorina (см. Foreman et al., J. Biol. Chem. 278(34), 31988-31997, 2003). Полипептидные продукты этих генов являются бимодулярными полипептидами, которые содержат целлюлозосвязывающий модуль и домен, чья функция или активность может быть не связана с известными гликозилгидролазными семействами. Кроме того, наличие целлюлозосвязывающего модуля и корегуляции экспрессии этих генов компонентами целлюлазы, указывает на ранее не известные активности с потенциальной ролью в деградации биомассы. Композиция изобретения может состоять из членов каждого из упомянутых выше классов, нескольких членов одного полипептидного класса или любой комбинации этих полипептидных классов. Композиция изобретения может состоять из полипептидов, например ферментов, полученных (1) от коммерческих поставщиков; из (2) клонированных генов, экспрессирующих полипептиды, например ферменты; (3) сложной жидкой питательной среды (такой, которая получается в результате роста микробного штамма в среде, где штаммы секретируют ферменты в среду; (4) клеточных лизатов штаммов,растущих как в (3); и/или (5) растительного материала, экспресирующего полипептиды, например ферменты. Различные полипептиды, например ферменты, в композиции изобретения могут быть получены из различных источников. Применение полипептидов. Полипептиды и полипептидные композиции по изобретению могут быть использованы во множестве различных применений. Например, они могут быть использованы для получения ферментируемых сахаров. В одном воплощении они могут быть использованы в способе осахаривания лигноцеллюлозного материала, в котором лигноцеллюлозный материал, который необязательно предварительно обрабатывают, контактирует с трансформантом Talaromyces по изобретению, или целлюлазой, гемицеллюлазой или пектиназой по изобретению, и вырабатывается один или несколько сахаров. Ферментируемые сахара затем могут быть преобразованы как часть способа получения биотоплива в биогаз или этанол, бутанол, изобутанол, 2 бутанол или другие подходящие вещества. Кроме того, изобретение относится к способу получения продукта ферментации, например этанола, где сахара ферментируются ферментирующим микроорганизмом,предпочтительно дрожжами, с получением продукта ферментации. В ином случае полипептиды и их композиции могут быть использованы в качестве фермента, например, при производстве продуктов питания, в детергентных композициях, в целлюлозно-бумажной промышленности и в антибактериальных составах, в фармацевтических продуктах, таких как таблетки для рассасывания, зубные пасты и жидкости для полоскания рта. Некоторые из применений далее будут- 18021636 проиллюстрированы подробно. В данных применениях и способах, описанных ниже, компоненты композиции, описанные выше,могут быть предоставлены одновременно (т.е. в качестве отдельной композиции по сути) или отдельно или последовательно. Изобретение также относится к применению полипептида по изобретению и композиций, содержащих такой фермент в промышленных способах. Несмотря на многолетний опыт, полученный с этими способами, полипептид по изобретению может отличаться множеством различных преимуществ относительно используемых в настоящее время ферментов. В зависимости от конкретного применения эти преимущества могут включать такие аспекты,как низкая себестоимость, высокая специфичность к субстрату, пониженная антигенность, пониженная нежелательная побочная активность, повышенный выход при выработке в соответствующем микроорганизме, более подходящие температурные и рН диапазоны, отсутствие ингибирования гидрофобными,полученными из лигнина продуктами или меньшее ингибирование продуктом или, в случае пищевой промышленности, лучшие вкусовые качества или текстуры конечного продукта, а также пищевой и кошерный аспекты. В принципе, полипептид или композиция изобретения могут быть применены в любом способе, в котором требуется обработка материала, содержащего полисахарид. Таким образом, полипептид или композиция изобретения могут быть применены при обработке некрахмального полисахаридного материала. В данном документе полисахаридным материалом является материал, который содержит или состоит существенным образом из одного или, что чаще, более чем одного полисахарида. Как правило, растения и материал, полученный из них, содержат значительные количества некрахмального полисахаридного материала. Соответственно, полипептид изобретения может быть применен при обработке растительного или грибного материала или материала, полученного из него. Лигноцеллюлоза. Полипептиды преимущественно можно применять для деградации лигноцеллюлозного материала. Основными полисахаридами являются целлюлоза (глюканы), гемицеллюлозы (ксиланы, гетероксиланы и ксилоглюканы). Кроме того, некоторые гемицеллюлозы могут присутствовать в виде глюкоманнанов,например, в сырье, полученном из древесины. Ферментативный гидролиз этих полисахаридов на растворимые сахара, например глюкозу, ксилозу, арабинозу, галактозу, сахарозу, фруктозу, маннозу, рамнозу,рибозу, D-галактоуроновую кислоту и другие гексозы и пентозы, происходит под действием различных ферментов, действующих совместно. Кроме того, пектины и другие пектиновые вещества, такие как арабинаны, могут составить значительную долю сухой массы обычной клеточной стенки тканей недревесного растения (от около четверти до половины сухой массы могут быть пектинами). Целлюлоза является линейным полисахаридом, состоящим из глюкозных остатков, связанных 1,4-связями. Линейная природа целлюлозных волокон, а также стехиометрия -связанной глюкозы (относительно ) образует структуры более склонные к образованию водородных связей между цепями,нежели сильно разветвленные -связанные структуры крахмала. Таким образом, целлюлозные полимеры, в общем, менее растворимы и образуют более тесно связанные волокна, чем волокна, обнаруженные в крахмале. Гемицеллюлоза является сложным полимером, и его композиция часто широко варьирует от организма к организму и от одного типа ткани к другому. В общем, основным компонентом гемицеллюлозы является -1,4-связанная ксилоза, пятиуглеродный сахар. Однако эта ксилоза часто ветвиться на О-3 и/или О-2 и может быть замена связями с арабинозой, галактозой, маннозой, глюкуроновой кислотой,галактуроновой кислотой или этерификацией уксусной кислотой (и этерификацией ферруловой кислотой арабинозы). Гемицеллюлоза может также содержать глюкан, который является общим названием для связанных шестиуглеродных сахаров (таких как -(1,3)(1,4) глюканы и гетероглюканы, упомянутые выше) и дополнительно глюкоманнаны (в которых как глюкоза, так и манноза присутствуют в линейном каркасе, связанные друг с другом -связями). Пектиновые вещества включают пектины, арабинаны, галактаны и арабиногалактаны. Пектины являются наиболее сложными полисахаридами в клеточной стенке растений. Они надстраиваются вокруг основной цепи из -(1,4)-связанных единиц галактуроновой кислоты, чередующейся в определенном порядке с L-рамнозой. В любой клеточной стенке существует множество структурных единиц, которые соответствуют этому описанию и, в общем, считается, что они являются одиночной пектиновой молекулой, в которой основные цепи и различные структурные единицы непрерывно следуют друг за другом. Основными типами структурных единиц являются галактоуронан (гомогалактоуронан), который может быть замещен метанолом по карбоксильной группе и ацетатом по О-2 и О-3; рамногалктоуронан I(RGI), в котором единицы галактуроновой кислоты чередуются с единицами рамнозы, несущими боковые цепи с (1,4)-связанным галактаном и (1,5)-связанным арабинаном. Арабинановые боковые цепи могут быть прикреплены напрямую к рамнозе или ненапрямую через галактановые цепи; ксилогалактуронан, с одиночными ксилозильными единицами на О-3 галактуроновой кислоты (тесно ассоциированной сRGI); и рамногалактуронан II (RGII), особенно сложная минорная единица, содержащая необычные сахара, например апиозу. Единица RGII может содержать два апиозных остатка, которые в подходящих ионных условиях могут обратимо образовывать эфиры с боратом. Композиция, природа заместителя и степень разветвленности гемицеллюлозы очень отличаются у двудольных растений (двудольных, т.е. растений, чьи семена имеют два котиледона или семядоли, такие как лимская фасоль, арахис, миндаль, горох, фасоль) по сравнению с однодольными растениями (однодольными, т.е. растениями, имеющими одиночный котиледон или семядолю, такие как кукуруза, пшеница, рис, травы, ячмень). У двудольных гемицеллюлоза состоит главным образом из ксилоглюканов, которые являются 1,4 связанными цепями глюкозы с 1,6 связанными ксилозильными боковыми цепями. В однодольных, включая большинство зерновых культур, основными компонентами гемицеллюлозы являются гетероксиланы. Они главным образом содержат 1,4 связанные ксилозные каркасные полимеры с 1,3 связями с арабинозой, галактозой, маннозой и глюкуроновой кислотой или 4-Ометилглюкуроновой кислотой, а также ксилозой, модифицированной уксусной кислотой, связанной посредством эфирной связи. Также присутствуют -гликаны, содержащие 1,3- и 1,4 связанные гликозильные цепи. В однодольных целлюлоза, гетероксиланы и -глюканы могут присутствовать в примерно равных количествах, на каждое из которых приходится около 15-25% сухого вещества клеточных стенок. Также различные растения могут содержать различные количества и различные композиции пектиновых веществ. Например, сахарная свекла содержит около 19% пектина и около 21% арабинана в пересчете на сухое вещество. Соответственно, композиция изобретения может быть адаптирована с учетом определенного сырья(также называемого субстратом), которое будет использоваться. Иными словами, спектр активностей композиции изобретения может варьировать в зависимости от рассматриваемого сырья. Ферментные комбинации или физические обработки могут быть проведены одновременно или последовательно или отдельно. Ферменты могут быть получены экзогенно из микроорганизмов, дрожжей,грибов, бактерий или растений, затем выделены и добавлены к лигноцеллюлозному сырью. В ином случае, ферменты продуцируют, но не выделяют, и среда ферментации с сырой клеточной массой или растительный материал (такой как кукурузная солома) и т.п. добавляют в сырье. В ином случае, сырая клеточная масса или среда для продуцирования фермента или растительный материал могут быть обработаны для предотвращения дальнейшего микробного роста (например, нагреванием или добавлением антимикробных средств), а затем добавлены к сырью. Эти сырые ферментные смеси могут включать организм, продуцирующий фермент. В ином случае, фермент может быть получен при ферментации, в которой используется сырье (такое как кукурузная солома) для обеспечения питания организма, который продуцирует фермент(ы). Таким образом, растения, которые продуцируют ферменты, могут служить в качестве лигноцеллюлозного сырья и могут быть добавлены в лигноцеллюлозное сырье. Углеводные полимеры (целлюлоза и гемицеллюлоза) тесно связаны с лигнином водородными и ковалентными связями. Соответственно, полипептид изобретения может быть применен при обработке лигноцеллюлозного материала. В данном документе лигноцеллюлозным материалом является материал, который содержит(или состоит из) в основном лигноцеллюлозу. Таким образом, в способе по изобретению для обработки некрахмального полисахарида некрахмальным полисахаридом может быть лигноцеллюлозный материал/биомасса. Соответственно, в изобретении предлагается способ обработки субстрата, содержащего некрахмальный полисахарид, в котором обработка содержит деградацию, и/или гидролиз, и/или модификацию целлюлозы, и/или гемицеллюлозы, и/или пектинового вещества. Эндо-1,4 глуюканазы (EG) и экзоцеллобиогидролазы (СВН) катализируют гидролиз нерастворимой целлюлозы на целлоолигосахариды (целлобиоза как основной продукт), в то время как глюкозидазы (BG) преобразуют олигосахариды, главным образом целлобиозу и целлотриозу, в глюкозу. Ксиланазы вместе с другими вспомогательными ферментами, например с -L-арабинофуранозидазами, ферулоил- и ацетилксиланэстеразами, глюкуронидазами и -ксиланазами, катализируют гидролиз гемицеллюлоз. Пектиназа, например эндополигалактуроназа, пектинметилэстераза, эндогалактаназа, галактозидаза, пектинацетилэстераза, эндопектинолиаза, пектатлиаза, -рамнозидаза, экзогалактуроназа,экзополиглактуронатлиаза, рамноглактуронангидролаза, рамногалактуронанлиаза, рамногалактуронанацетилэстераза, рамноглактуронангалактуроногидролаза, ксилогалактуроназа, -арабинофуранозидаза. Деградация в данном контексте означает, что обработка в результате дает образование продуктов гидролиза целлюлозы и/или гемицеллюлозы и/или пектинового вещества, т.е. в результате обработки получаются более короткие олигосахариды, чем присутствуют в аналогичном необработанном некрахмальном полисахариде. Таким образом, деградация в данном контексте может приводить к высвобождению олигосахаридов и/или сахарных мономеров. Все растения содержат некрахмальные полисахариды, также как и практически все полисахаридные материалы, полученные из растений. Соответственно, в способе изобретения для обработки субстрата,содержащего некрахмальный полисахарид, указанный субстрат может быть предоставлен в виде расте- 20021636 ния или материала, полученного из растений, или материала, содержащего растения, или материала, полученного из растений, например растительную пульпу, растительный экстракт, продукт питания или его ингредиент, ткань, текстильное изделие или предмет одежды. Лигноцеллюлозная биомасса, подходящая для применения в изобретении, может включать первичную биомассу и/или непервичную биомассу, такую как сельскохозяйственная биомасса, коммерческая органика, строительный и городской мусор, твердые бытовые отходы, макулатура и садовые отходы. Распространенные формы биомассы включают деревья, кустарники и травы, пшеницу, пшеничную солому, жмых сахарного тростника, кукурузу, кукурузную солому, листовую обертку початков кукурузы,стержни кукурузных початков, зерна кукурузы, включая волокна из зерен, продукты и побочные продукты помола зерен, таких как кукуруза, пшеница или ячмень (включая влажный и сухой способы помола),часто называемые "отруби или волокна", а также твердые бытовые отходы, макулатуру и садовые отходы. Биомасса может также быть, без ограничения перечисленным, травянистым материалом, отходами сельского хозяйства, отходами лесного хозяйства, твердыми бытовыми отходами, макулатурой, пульпой или отходами бумажного производства. "Сельскохозяйственная биомасса" включает ветки, кусты, тростники, кукурузу и листовую обертку початков кукурузы, энергетические культуры, лесоматериал, фрукты, цветы, зерно, травянистые культуры, листья, кору, иголки, бревна, корни, саженцы, древенистые культуры с коротким циклом, кустарники, просо, деревья, овощи, фруктовые корки, виноград, жом сахарной свеклы, пшеничную крупку, шелуху овса и твердую и мягкую древесины (не включая древесину с вредными материалами). Кроме того, сельскохозяйственная биомасса включает материалы органических отходов, образованных в ходе сельскохозяйственных процессов, включая фермерскую и лесоводческую активности, особенно включая древесные отходы лесного хозяйства. Сельскохозяйственная биомасса может быть отдельно любой из вышеизложенных или любой комбинацией или смесью. Дополнительными примерами подходящей биомассы являются садовые обрезки, чапарель, отходы лесопильного производства, городские древесные отходы, городские отходы, отходы лесозаготовок, отходы, полученные при прореживании леса, деревянистые структуры культур с коротким циклом, индустриальный мусор, пшеничная солома, овсяная солома, рисовая солома, ячменная солома, ржаная солома, льняная солома, соевая шелуха, рисовая шелуха, рисовая солома, кукурузный глютеновый корм, овсяная шелуха,сахарный тростник, кукурузная солома, стебли кукурузы, стержни кукурузных початков, кукурузная шелуха, бородач, трипсакум, лисохвост, свекловичный жом, мякоть цитрусовых плодов, семенные оболочки, целлюлозосодержащие животные отходы, настриг с лужаек, хлопок, морские водоросли, деревья,кустарники, травы, пшеница, пшеничная солома, жмых сахарного тростника, кукуруза, листовые обертки початка кукурузы, кукурузная сердцевина, кукурузное зерно, волокна из зерна, продукты и побочные продукты помола злаков мокрым или сухим способом, твердые бытовые отходы, макулатура, садовые отходы, травянистый материал, сельскохозяйственные отходы, отходы лесного хозяйства, твердые бытовые отходы, пульпа, отходы бумажного производства, ветки, кустарники, тростники, кукуруза, кукурузная шелуха, энергетическая сельскохозяйственная культура, лесоматериал, фрукты, цветы, зерно, трава,травянистые культуры, листья, кора, иглы, бревна, корни, саженцы, кусты, просо, деревья, овощи, фруктовая кожура, виноград, жом сахарной свеклы, пшеничные отруби, овсяная шелуха, твердое или мягкое дерево, материал органических отходов, полученный в ходе сельскохозяйственного процесса, древесные отходы лесного хозяйства или комбинация любого из двух или нескольких из них. Помимо первичной биомассы или сырья, уже обработанного в пищевой, кормовой или бумажной и целлюлозной отраслях, биомасса/сырье может быть дополнительно обработано тепловой, механической и/или химической модификацией или любой комбинацией таких способов в целях усиления ферментативной деградации. Предварительная обработка. Перед ферментативной обработкой лигноцеллюлозный материал можно предварительно обработать. Предварительная обработка может включать воздействие на лигноцеллюлозный материал кислотой, основанием, растворителем, нагреванием, пероксидом, озоном, механическим измельчением, дроблением, перемалыванием или быстрым сбросом давления или комбинацией любых двух или нескольких из перечисленного. Данную химическую предварительную обработку часто объединяют с термической предварительной обработкой, например, в диапазоне 150-220 С в течение от 1 до 30 мин. После стадии предварительной обработки может быть проведена стадия ожижения/гидролиза или предварительного осахаривания, включающая инкубацию с ферментом или ферментной смесью. Стадия предварительной обработки может быть осуществлена при множестве различных температур. В любом из воплощений предварительную обработку проводят при температуре наиболее подходящей для тестируемой ферментной смеси или при предсказанном оптимуме для тестируемого фермента. Температура предварительной обработки может находиться в диапазоне от около 10 до около 95 С, от около 20 до около 85 С, от около 30 до около 70 С, от около 40 до около 60 С, от около 37 до около 50 С, предпочтительно от около 37 до около 80 С, более предпочтительно около 60-70 С, еще более предпочтительно вблизи 65 С. рН предварительно обработанной смеси может находится в диапазоне от около 2,0 до около 10,0, но предпочтительно от около 3,0 до около 7,0, более предпочтительно от около 4,0 до около 6,0,еще более предпочтительно от около 4,0 до около 5,0. Опять же, рН может быть скорректирована для- 21021636 максимизации активности и может быть скорректирована с добавлением фермента. Сравнение результатов анализов этого теста позволит кому-либо модифицировать способ для лучшего соответствия проходящим тестирование ферментам. Стадия ожижения/гидролиза или предварительного осахаривания может длиться в течение от нескольких минут до нескольких часов, например от около 1 до около 120 ч, предпочтительно от около 2 до около 48 ч, более предпочтительно от около 2 до около 24 ч, наиболее предпочтительно в течение от около 2 до около 6 ч. Обработка ферментом, деградирующим неуглевод, может происходить в течение от нескольких минут до нескольких часов, например от около 6 до около 120 ч, предпочтительно от около 12 до около 72 ч, более предпочтительно от около 24 до 48 ч. Осахаривание. В изобретении предлагается способ получения сахара из лигноцеллюлозного материала, который включает контакт полипептида изобретения, композиции изобретения с лигноцеллюлозным материалом. Такой способ позволяет свободным сахарам (мономерам) и/или олигосахаридам образоваться из лигноцеллюлозной биомассы. Эти способы включают преобразование лигноцеллюлозной биомассы в свободные сахара и малые олигосахариды с помощью полипептида или композиции изобретения. Процесс преобразования сложного углевода, такого как лигноцеллюлоза, в сахара предпочтительно позволяет получать ферментируемые сахара. Такой способ может называться "осахариванием". Соответственно, способ изобретения может давать в результате высвобождение одного или нескольких гексозных и/или пентозных сахаров, таких как один или несколько из числа глюкозы, целлобиозы, ксилозы,арабинозы, галактозы, галактуроновой кислоты, глюкуроновой кислоты, маннозы, рамнозы, сахарозы и фруктозы. Соответственно, другой аспект изобретения включает способы, в которых используют композицию,описанную выше, вместе с дополнительными ферментами или физическими обработками, такими как температура и рН, для преобразования лигноцеллюлозной растительной биомассы в сахара и олигосахариды. Хотя композиция обсуждалась в качестве отдельной смеси, следует признать, что ферменты могут быть добавлены последовательно, при этом температура, рН и другие условия могут быть изменены для увеличения активности каждого индивидуального фермента. В ином случае, оптимальные рН и температура могут быть определены для ферментной смеси. Ферменты взаимодействуют с субстратом при любых соответствующих условиях. Например, ферменты можно инкубировать при температуре около 25, около 30, около 35, около 37, около 40, около 45,около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90 С или выше. То есть их можно инкубировать при температуре от около 20 до около 95 С, например, в буферах с ионной силой от низкой до средней и/или при рН от низкого до нейтрального. Под "средней ионной силой" понимается буфер, который имеет концентрацию ионов около 200 миллимолярную (мМ) или менее для какого-либо одного ионного компонента. рН может находиться в диапазоне от около 2,5, около 3,0, около 3,5, около 4,0, около 4,5 около 5, около 5,5, около 6, около 6,5, около 7, около 7,5, около 8,0 до около рН 8,5. Как правило, диапазон рН будет от около 3,0 до около 7. Для получения этанола может быть использована кислая среда, например рН 4, тогда как при выработке биогаза может быть использовано нейтральное значение рН 7. Инкубация ферментных комбинаций в этих условиях в результате дает высвобождение или освобождение значительных количеств сахара из лигноцеллюлозного материала. Под значительным количеством понимается по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% или большее количество сахаров. Полипептиды, такие как ферменты, могут быть получены экзогенно в микроорганизмах, дрожжах,грибах, бактериях или растениях, затем выделены и добавлены к лигноцеллюлозному сырью. В ином случае, ферменты продуцируют, но не выделяют, и ферментационная среда с сырой клеточной массой или растительный материал (такой как кукурузная солома или пшеничная солома) и т.п. могут быть добавлены, например, в сырье. В ином случае, сырая клеточная масса или среда для продуцирования фермента или растительный материал могут быть обработаны для предотвращения дальнейшего микробного роста (например, нагреванием или добавлением антимикробных средств), а затем добавлены в сырье. Эти сырые ферментные смеси могут включать организм, продуцирующий фермент. В ином случае, фермент может быть получен при ферментации, в которой используется сырье (такое как кукурузная солома) для обеспечения питания организма, который продуцирует фермент(ы). Таким образом, растения,которые продуцируют ферменты, могут служить в качестве лигноцеллюлозного сырья и могут быть добавлены в лигноцеллюлозное сырье. Ферментация сахаров. Поддающиеся ферментации сахара могут быть преобразованы в полезные ферментационные продукты с дополнительными положительными характеристиками, не ограничивающие примеры которых включают аминокислоты, витамины, лекарства, добавки к кормам для животных, химические продукты тонкого органического синтеза, химическое сырье, пластмассы, растворители, топливо или другие органические полимеры, молочную кислоту и этанол, включая топливный этанол. В частности, сахара могут быть использованы в качестве сырья для ферментации в химические вещества, пластики, такие как на- 22021636 пример, янтарная кислота и (био)топливо, включая этанол, метанол, бутанол, синтетические жидкие топлива и биогаз. Например, в способе изобретения фермент или комбинация ферментов действует на лигноцеллюлозный субстрат или на растительную биомассу, выступающую в качестве сырья, с тем чтобы преобразовать этот сложный субстрат в простые сахара и олигосахариды для получения этанола или других полезных продуктов ферментации. Сахара, высвобождаемые из биомассы, могут быть преобразованы в полезные продукты ферментации, которые включают, без ограничения перечисленным, аминокислоты, витамины, лекарства, кормовые добавки для животных, химические продукты тонкого органического синтеза, химическое сырье,пластмассы, этанол, включая топливный этанол. Соответственно, в изобретении предлагается способ получения продукта ферментации, где способ включает:b) ферментацию полученного материала с получением посредством этого продукта ферментации. Такая ферментация может быть проведена в аэробных или анаэробных условиях. Предпочтительно,если способ проводится в микроаэрофильных условиях или условиях с ограниченным кислородом. Способ анаэробного сбраживания в данном документе определен как способ сбраживания, запускаемый в отсутствии кислорода или в котором фактически не потребляется кислород, предпочтительно менее чем около 5, около 2,5 или около 1 ммоль/л/ч, и в котором органические молекулы служат как донорами электронов, так и акцепторами электронов. Процесс ферментации при ограничении кислорода является процессом, в котором потребление кислорода ограничивается переносом кислорода из газа в жидкость. Степень ограничения кислорода определяется количеством и композицией входящего потока газа, а также актуальными свойствами перемешивания/переноса массы в используемом для ферментации оборудовании. Предпочтительно, если процесс проводится в условиях с ограниченным кислородом, и скорость потребления кислорода составляет по меньшей мере 5,5, более предпочтительно по меньшей мере 6, еще более предпочтительно по меньшей мере 7 ммоль/л/ч. Способ получения продукта ферментации необязательно может содержать извлечение продукта ферментации. Ферментация с одновременным осахариванием. Ферментация и осахаривание также могут быть осуществлены в режиме ферментации с одновременным осахариванием (англ. Simultaneous Saccharification Fermentation, SSF). Одно из преимуществ этого режима заключается в снижении ингибирования сахарами ферментативного гидролиза (ингибирование сахарами целлюлаз описано Caminal BB Vol XXVII Pp 1282-1290). Продукты ферментации. Продукты ферментации, которые могут быть получены в соответствии с изобретением, включают аминокислоты, витамины, лекарственные средства, добавки к кормам для животных, химические продукты тонкого химического синтеза, химическое сырье, пластмассы, растворители, топливо или другие органические полимеры, молочную кислоту, этанол, включая топливный этанол (под термином "этанол" понимается включение этилового спирта или смесей этилового спирта и воды). Конкретные продукты с добавленной стоимостью, которые могут быть получены способами изобретения, включают, без ограничения перечисленным, биотопливо (включая этанол, бутанол и биогаз); молочную кислоту; пластмассы; химические продукты тонкого органического синтеза; органические кислоты, в том числе лимонную кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту, итаконовую кислоту и малеиновую кислоту; 3-гидроксипропионовую кислоту, акриловую кислоту, уксусную кислоту, 1,3 пропандиол; этилен, глицерин; растворитель; добавку для питания животных, лекарство, такое как лактамные антибиотики или цефалоспорины; витамины, аминокислоты, такие как лизин, метионин,триптофан, треонин, и аспарагиновая кислота; промышленные ферменты, такие как протеазы, целлюлазы, амилазы, глюканазы, лактазы, липазы, лиазы, оксидоредуктазы, трансферазы или ксиланазы, и химическое сырье. Биогаз. В изобретении также предлагается применение описанных в данном документе полипептида или композиции в способе получения биогаза. Биогаз, как правило, относится, к газу, продуцируемому при биологическом разложении органического материала, например материала, содержащего некрахмальный углевод, в отсутствии кислорода. Биогаз происходит из биогенного материала и является типом биотоплива. Один тип биогаза продуцируется анаэробным расщеплением или ферментацией биодеградируемых материалов, таких как биомасса, навоз, силос или сточные воды, бытовые отходы или энергетические культуры. Этот тип биогаза содержит, главным образом, метан и диоксид углерода. Газ метан можно сжигать или окислять кислородом. Воздух содержит 21% кислорода. Это высвобождение энергии позволяет использовать биогаз в качестве топлива. Биогаз можно использовать в качестве дешевого топлива в любой стране для любых нагревательных целей, таких как приготовление пищи. Он также может быть- 23021636 использован в современных предприятиях по переработке отходов, где он может быть использован для функционирования любого типа тепловых машин, для образования либо механической, либо электрической энергии. Первая стадия при производстве микробного биогаза состоит в ферментативной деградации полимеров и сложных субстратов (например, некрахмального углевода). Соответственно, в изобретении предлагается способ получения биогаза, в котором субстрат, содержащий некрахмальный углевод, контактирует с полипептидом или композицией изобретения, тем самым приводя к получению ферментируемого материала, который может быть преобразован в биогаз организмом, таким как микроорганизм. В таком способе полипептид изобретения может быть предоставлен, к примеру, организмом, например микроорганизмом, который экспрессирует такой полипептид. Применение ферментов в пищевых продуктах. Полипептиды и композиции изобретения могут быть использованы в способе обработки растительного материала для деградации или модификации целлюлозных или гемицеллюлозных или пектиновых составляющих клеточных стенок растительного или грибного материала. Такие способы могут быть полезны при получении пищевых продуктов. Соответственно, в изобретении предлагается способ получения пищевого продукта, который включает введение полипептида или композиции изобретения в ходе приготовления пищевого продукта. В изобретении также предлагается способ обработки растительного материала, который включает контакт растительного материала с полипептидом или композицией изобретения для деградации или модификации целлюлозы в (растительном) материале. Предпочтительным растительным материалом является растительная пульпа или растительный экстракт, такой как соки. Настоящее изобретение также относится к способу снижения вязкости, прозрачности и/или фильтруемости растительного экстракта, который включает контакт растительного экстракта с полипептидом или композицией изобретения в количестве, эффективном при деградации целлюлозы или гемицеллюлозы или пектиновых веществ, содержащихся в растительном экстракте. Растительные материалы и материалы, содержащие целлюлозу/гемицеллюлозу/пектиновые вещества, включают растительную пульпу, части растений и растительные экстракты. В контексте этого изобретения экстракт из растительного материала является любым веществом, которое может быть получено из растительного материала экстракцией (механической и/или химической), обработкой или другими методами разделения. Экстрактом может быть сок, нектар, основа или концентраты, сделанные из них. Растительный материал может содержать или может быть получен из овощей, например, из моркови,сельдерея, лука, бобов или растений семейства бобовых (сои, соевого боба, гороха), или фруктов, например мясистый семечковый плод или семечковый плод (например, яблоки, груши, айва и т.п.), винограда,помидора, цитрусовых (апельсина, лимона, лайма, мандарина), дыни, сливы, вишни, черной смородины,красной смородины, малины, клубники, клюквы, ананаса и других тропических фруктов, деревьев и их частей (например, пыльцы сосны), или зерновых (овса, ячменя, пшеницы, кукурузы, риса). Материал(подвергаемый гидролизу) также может быть отходами сельского хозяйства, такими как жом сахарной свеклы, стержни кукурузных початков, пшеничная солома, скорлупа (земляного) ореха или перерабатываемые материалы, например макулатура. Полипептиды изобретения, таким образом, можно применять при обработке растительного материала, включая растительную пульпу и растительные экстракты. Они также могут быть использованы для обработки жидких или твердых пищевых продуктов или съедобных ингредиентов пищевых продуктов, или могут быть использованы при экстракции кофе, растительных масел, крахмала или в качестве загустителя в продуктах питания. Как правило, полипептиды изобретения используют в качестве композиции/ферментного препарата, как описано выше. Композицию в целом будут добавлять к растительной пульпе, получаемой, например, механической обработкой, такой как дробление или перемалывание растительного материала. Инкубация композиции с растением, как правило, будут проводить в течение периода времени от 10 мин до 5 ч, например от 30 мин до 2 ч, предпочтительно в течение около 1 ч. Температура обработки предпочтительно составляет от около 10 до около 55 С, например от около 15 до около 25 С, оптимально около 20 С и можно использовать от около 10 до около 300 г, предпочтительно от около 30 до около 70 г, оптимально около 50 г фермента на 1 т обрабатываемого материала. Все используемые ферменты или их композиции могут быть добавлены последовательно или одновременно в растительную пульпу. В зависимости от композиции ферментный препарат растительного материала может быть вначале мацерирован (например, до однородности) или ожижен. С помощью полипептидов изобретения параметры обработки, такие как выход экстракции, вязкость экстракта и/или качество экстракта, могут быть улучшены. В ином случае или в дополнение к вышеуказанному, полипептид изобретения может быть добавлен к сырому соку, полученному прессованием или ожижением растительной пульпы. Обработка сырого сока в отношении дозировки, температуры и времени выдержки будет проводиться так же, как и растительной пульпы. С другой стороны, могут быть добавлены ферменты, такие как те, что обсуждались ранее. Типичными условиями инкубации являются те, которые описаны в предшествующих абзацах.- 24021636 После того как сырой сок инкубировали с полипептидами изобретения, сок затем центрифугируют или (ультра)фильтруют для получения конечного продукта. После обработки полипептидом изобретения(конечный) продукт может быть обработан термически, например, при температуре около 100 С в течение времени от около 1 мин до около 1 ч, в условиях частично или полностью инактивирующих полипептид(ы) изобретения. Композиция, содержащая полипептид изобретения, также может быть использована в ходе приготовления фруктовых или овощных пюре. Полипептид изобретения также может быть использован в пивоварении, при изготовлении вина,перегонке или выпечке. Полипептид, следовательно, может быть использован при получении алкогольных напитков, таких как вино и пиво. Например, полипептид может улучшить фильтруемость или прозрачность, например, пива, сусла (например, содержащего ячменный солод и/или солод из сорго) или вина. Более того, полипептид или композиция изобретения могут быть использованы при обработке использованного при пивоварении зерна, т.е. остатков изготовления пивного сусла, содержащих ячмень или осоложенный ячмень или другие зерновые, с тем, чтобы улучшить утилизацию остатков, например,в виде кормов для животных. Полипептид может содействовать удалению растворенных органических веществ из бульона или культуральной среды, например, когда отходы перегонки органического происхождения биоконвертируют в микробную биомассу. Полипептид изобретения может улучшить фильтруемость и/или снизить вязкость сиропов глюкозы, таких как те, что получают ожижением из зерновых (например, с помощью-амилазы). При выпечке полипептид может улучшить структуру теста, модифицировать его липкость или податливость, улучшить объем буханки и/или структуру мякиша или придать улучшенные текстурные характеристики, такие как качество разлома, разрезания или качество мякиша. Настоящее изобретение, таким образом, относится к способам получения теста или пищевых продуктов из дробленого зерна, которые включают внедрение в тесто полипептида или композиции настоящего изобретения. Внедрение может улучшить одно или несколько свойств теста или пищевого продукта из дробленого зерна, полученного из теста, по сравнению с тестом или пищевым продуктом из дробленого зерна, в которые не внедряли данный полипептид. Получение пищевого продукта из дробленого зерна согласно изобретению также может включать стадии, известные в данной области, такие как кипячение, сушка, жарка, обработка паром или выпечка полученного теста. Продуктами, которые делают из вареного теста, являются, например, вареная лапша, пельмени; продуктами, которые сделаны из жареного теста, являются, например, пончики, бенье, жареная лапша; продуктами, которые сделаны из теста на пару, являются, например, приготовленные на пару булочки и лапша; примерами продуктов, сделанных из высушенного теста, являются паста и сухая лапша; а примерами продуктов, сделанных из печеного теста, являются хлеб, печенье и пирожные. Термин "улучшенное свойство" определяется в данном документе как любое свойство теста и/или продукта, полученного из теста, в частности пищевого продукта из дробленого зерна, которое улучшается под действием полипептида по изобретению по сравнению с тестом или продуктом, в которые полипептид по изобретению не внедрялся. Улучшенное свойство может включать, без ограничения перечисленным, повышенную прочность теста, повышенную эластичность теста, повышенную стабильность теста, улучшенную способность теста к машинной обработке, повышенную устойчивость теста в расслойке, пониженную липкость теста, улучшенную растяжимость теста, увеличенный объем пищевого продукта из дробленого зерна, пониженное вздутие пищевого продукта из дробленого зерна, улучшенная структура мякиша пищевого продукта из дробленого зерна, улучшенная мягкость мякиша пищевого продукта из дробленого зерна, улучшенный вкус/аромат пищевого продукта из дробленого зерна, повышенную сопротивляемость очерствению пищевого продукта из дробленого зерна. Улучшенными свойствами, связанными с продуктами из дробленого зерна типа пасты или лапши, являются например, твердость, пониженная липкость, улучшенная сцепляемость и сниженные потери при приготовлении. Улучшенное свойство может быть определено сравнением теста и/или пищевого продукта из дробленого зерна, приготовленных с добавлением или без добавления полипептида настоящего изобретения. Органолептические качества могут быть оценены с помощью процедур, широко распространенных в хлебопекарной промышленности, и могут включать, например, использование группы дегустаторов. Термин "тесто" определяется в данном документе как смесь муки и других ингредиентов, достаточно скрепленных для того, чтобы их можно было месить или раскатывать. Примеры зерновых включают пшеницу, рожь, кукурузу, маис, ячмень, рис, крупы, гречиху и овес. Пшеница здесь и далее охватывает все известные виды рода Triticum, например aestivum, durum и/или spelta. Примерами подходящих ингредиентов являются полипептид по настоящему изобретению, дополнительные ферменты, химические добавки и/или технологические добавки. Тесто может быть свежим, замороженным, готовым или испеченным. Приготовление теста из ингредиентов, описанное выше, хорошо известно в данной области и включает смешивание указанных ингредиентов и технологических добавок в одной или в нескольких- 25021636 стадиях формования и, необязательно, ферментации. Приготовление замороженного теста описано Kulp и Lorenz в "Frozen and Refrigerated Doughs and Batters". Термин "пищевой продукт из дробленого зерна" определяется в данном документе как продукт,приготовленный из теста либо с мягким, либо с хрустящим характером. Примерами пищевых продуктов из дробленого зерна, будь то белого, светлого или темного типа, которые могут быть выгодно произведены с помощью настоящего изобретения, являются хлеб (в частности, белый, с отрубями или ржаной хлеб), как правило, в форме батонов или булок, хлеб, подобный французскому багету, сдобное печенье,круасаны, макароны, вермишель (отварная или обжаренная), пита, тортильи, тако, торты, блины, бисквиты, печенье, пончики, бублики, основа для пирогов, хлеб, приготовленный на пару, и т.п. Термин "хлебобулочное изделие" определено в данном документе как любой пищевой продукт из дробленого зерна, приготовленный выпеканием из теста. Некрахмальные полисахариды (англ. Non-starch polysaccharides, NSP) могут повысить вязкость дигесты, которая в свою очередь может снизить доступность питательных веществ и эффективность животного. Применение полипептида настоящего изобретения может улучшить использование фосфора, а также минеральных веществ в виде катионов и полипептидов в ходе переваривания животным. Добавление конкретных питательных веществ к корму улучшает пищеварение животного и тем самым снижает стоимость кормов. В настоящее время используется множество пищевых добавок и постоянно разрабатываются новые концепции. Применение конкретных ферментов, подобных ферментам,деградирующим некрахмальные углеводы, может снизить энергию высвобождения волокон, а также увеличить перевариваемость полипептидов из-за лучшей доступности полипептида при разрушении волокон. Таким образом, стоимость корма может упасть, а также могут снизиться уровни полипептидов в корме. Некрахмальные полисахариды (NSP) также присутствуют практически во всех ингредиентах корма растительного происхождения. NSP являются плохо употребляемыми и могут, при солюбилизации, продемонстрировать побочные эффекты при переваривании. Экзогенные ферменты могут внести вклад в улучшенную утилизацию этих NSP и, как следствие, снизить любые антипитательные воздействия. Ферменты настоящего изобретения, деградирующие некрахмальные углеводы, могут быть использованы для этой цели в диетах на основе дробленого зерна для домашней птицы и, в меньшей степени, для свиней и других видов. Полипептид/фермент изобретения, деградирующий некрахмальные углеводы (композиция, содержащая полипептид/фермент изобретения), может быть использован в промышленности при изготовлении детергентов, например, при удалении пятен на основе углеводов с белья при стирке. Детергентная композиция может содержать полипептид/фермент изобретения и, кроме того, одну или несколько целлюлаз, гемицеллюлаз, пектиназ, протеаз, липаз, кутиназ, амилаз или карбогидраз. Применение ферментов в детергентных композициях. Детергентная композиция, содержащая полипептид или композицию изобретения, может быть в любом обычном виде, например в виде пасты, геля, порошка или жидкости. Жидкий детергент может быть водным, как правило, содержать вплоть до около 70% воды и от около 0 до около 30% органического растворителя или неводного материала. Такая детергентная композиция может быть, например, составлена в виде детергентной композиции для ручной или машинной стирки, включая композицию добавок для стирки, подходящую для предварительной обработки окрашенной ткани и отмывки добавленной композиции мягчителя ткани, или может быть составлена в виде детергентной композиции для применения в обычных операциях бытовой очистки твердых поверхностей, или может быть составлена для операций ручной или машинной мойки посуды. В целом, свойства фермента должны быть сравнимыми со свойствами выбранного детергента (например, оптимум рН, совместимость с другими ферментными и/или неферментными ингредиентами и т.п.) и фермент(ы) должен присутствовать в эффективном количестве. Детергентная композиция может содержать поверхностно-активное вещество, например анионное или неионное поверхностно-активное вещество, детергентный наполнитель или комплексообразующий агент, один или несколько полимеров, отбеливающую систему (например, источник Н 2 О 2) или стабилизатор ферментов. Детергентная композиция также может содержать любой обычный детергентный ингредиент, такой как, например, кондиционер, включая глину, пенообразователь, супрессор стойкой пены,антикоррозийное средство, средство, суспендирующее почву, средство против повторного осаждения почвы, краска, бактерицид, оптический отбеливатель, гидротропы, ингибитор потускнения или отдушка. Применение ферментов при обработке пульпы и бумаги. Полипептид или композиция настоящего изобретения могут быть использованы в целлюлознобумажной промышленности, помимо прочего, в процессе отбеливания для усиления белизны отбеленной пульпы, в соответствии с чем количество хлора, используемого в стадиях отбеливания, может быть снижено, и для увеличения степени свободности пульпы в способе бумаги вторичной переработки (Eriksson,K.Е.L., Wood Science and Technology 24 (1990):79-101; Paice, et al., Biotechnol. and Bioeng. 32 (1988):235239 и Pommier et al., Tappi Journal (1989):187-191). Более того, полипептид или композиция изобретения могут быть использованы при обработке лигноцеллюлозной пульпы с тем, чтобы улучшить ее дели- 26021636 мость. Таким образом, количество хлора, необходимого для получения удовлетворительного отбеливания пульпы, может быть снижено. Полипептид или композиция изобретения могут быть использованы в способе уменьшения скорости, при которой целлюлозосодержащая ткань становится шершавой, или уменьшения шероховатости целлюлозосодержащей ткани, где способ включает обработку целлюлозосодержащей ткани с полипептидом или композицией, как описано выше. Настоящее изобретение дополнительно относится к способу обеспечения осветления окраски окрашенной целлюлозосодержащей ткани, где способ включает обработку окрашенной целлюлозосодержащей ткани полипептидом или композицией, как описано выше. Способы изобретения могут быть осуществлены путем обработки целлюлозосодержащей ткани в ходе отмывки. Однако, в случае необходимости, обработка ткани также может быть проведена в ходе замачивания или полоскания или просто путем добавления полипептида или композиции, описанных выше, к воде, в которую погружена или будет погружена ткань. Другие применения ферментов. Кроме того, полипептид или композиция настоящего изобретения также могут быть использованы в антибактериальном составе, а также в фармацевтических продуктах, таких как таблетки для рассасывания, зубные пасты и жидкости для полоскания рта. Следующие примеры иллюстрируют изобретение. Примеры Общие материалы и методы. Штаммы. Штаммы Talaromyces emersonii настоящего изобретения получают из АТСС 16479, который ранее являлся Penicillium geosmithia emersonii. Другими обозначениями Т. emersonii АТСС 16479 являютсяYork), если не указано иное. ДНК амплифицировали с помощью фермента с корректирующей активностью "Phusion polymerase" (Finnzymes). Рестрикционные ферменты были приобретены у "Invitrogen" или Агаровая среда для Talaromyces Композиция солевой фракции. Солевая фракция соответствовала раскрытию WO 98/37179, табл. 1. Отклонениями от композиции этой таблицы были CaCl2, 2 водный 1,0 г/л, KCl 1,8 г/л, лимонная кислота, 1 водная 0,45 г/л (хелатирующее средство).- 27021636 Среды для перемешиваемых колб. Среда 1 для Talaromyces Получение спор периодическим способом. Штаммы выращивали из стоков на агаровой среде для Talaromyces в 10 см чашках Петри в течение 5-7 дней при 40 С. Стоки штаммов хранили при -80 С в 10% глицерине. Протокол выращивания в перемешиваемых колбах. Споры напрямую инокулировали в 500 мл перемешиваемые колбы, содержащие 100 мл либо среды 1, либо среды 2 для Talaromyces, и инкубировали при 45 С на скорости 250 об./мин в инкубируемом шейкере в течение 3-4 дней. Приготовление образцов. Для культур в перемешиваемых колбах 10 мл культурального бульона переносили в 12 мл одноразовую пробирку и центрифугировали для удаления биомассы. Собирали по меньшей мере 1 мл надосадочной жидкости. Белковый анализ. Белковые образцы разделяли в восстанавливающих условиях на геле "NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel"(Invitrogen, Бреда, Нидерланды) и окрашивали, как указано. Гели окрашивали либо "InstantBlue" (Expedeon, Кембридж, Великобритания), "SimplyBlue safestain" (Invitrogen, Бреда, Нидерланды), либо "SyproRuby" (Invitrogen, Бреда, Нидерланды) согласно инструкциям производителей. Для осуществления Вестерн-блоттинга белки переносили на нитроцеллюлозу. Нитроцеллюлозный фильтр блокировали TBST (забуференный Tris солевой раствор, содержащий 0,1% Tween 40) с 3% обезжиренного молока и инкубировали в течение 16 ч с антителом, связывающим FLAG M2 (Sigma, Звейндрехт, Нидерланды). Блоты отмывали дважды TBST в течение 10 мин и окрашивали кроличьими антителами к мышиным антителам, конъюгированным пероксидазой хрена (DAKO, Глоструп, Дания) в течение 1 ч. После пятикратной отмывки блотов TBST по 10 мин белки визуализировали с помощью"SuperSignal" (Pierce, Рокфорд, США). Анализы целлюлаз. 1. Анализ на пшеничной соломе (англ. Wheat Straw assay) (WSU-анализ). Приготовление предварительно обработанного субстрата из промытой пшеничной соломы. Субстрат из отмытой пшеничной соломы гомогенизировали с помощью "ULTRA-TURRAX", лио- 28021636 филизировали и перемалывали перед анализом. Измерение целлюлазной активности в WSU/мл. Активность целлюлазы в данном документе измеряли в единицах пшеничной соломы (англ. WheatStraw Units, WSU) на 1 мл в анализе на пшеничной соломе (WSU-анализе). Субстрат из отмытой пшеничной соломы гомогенизировали с помощью "ULTRA-TURRAX", отмывали, лиофилизировали и перемалывали перед анализом. 400 л надосадочной жидкости, собранной в экспериментах в перемешиваемых колбах, разводили в 16 раз. В двух повторах 200 л образцов переносили в два соответствующих флакона: один флакон содержит 700 л 3% (мас./мас.) сухого вещества субстрата предварительно обработанной, отмытой пшеничной соломы и 100 л 250 мМ цитратного буфера, рН 4,5. Другой флакон содержит холостую пробу, в нем 700 л 3% (мас./мас.) сухого вещества субстрата предварительно обработанной, отмытой пшеничной соломы заменили на 700 л воды со 100 л 250 мМ цитратного буфера, рН 4,5. Анализируемые образцы инкубировали в течение 20 и/или 60 ч при 65 С. После инкубации анализируемых образцов добавляли фиксированный объем D2O, содержащей внутренний стандарт малеиновой кислоты. Количество высвобожденной глюкозы рассчитывается на основании сигнала при 5,25-5,20 ppm относительно диметилсила-пентан-сульфоната, определенного посредством 1D 1 Н ЯМР с рабочей частотой для протонов 500 МГц, с помощью пульсовой программы с супрессией воды, при температуре 27 С. Ферментный раствор целлюлазы может содержать остаточные сахара. Следовательно, результаты анализа корректируют по содержанию сахара в ферментном растворе. Активность эндоглюконаз (WBCU). Эндоглюканаза катализирует гидролиз карбоксиметилцеллюлозы. Количество восстанавливающих сахаров, образованных в ходе ферментной реакции, определяли с помощью реактива динитросалициловой кислоты. Образцы инкубировали в присутствии раствора карбоксиметилцеллюлозы (Novacel,ref.394), 18 г/л в ацетатном буфере, рН 4,60 при 37 С. Инкубацию останавливали через 60 мин добавлением раствора гидроксида натрия. Образцы кипятили в течение 5 мин в присутствии реактива динитросалициловой кислоты (Acros 15644500). После разведения водой интенсивность цвета измеряли при 540 нм. Методология была использована в качестве относительного метода. Результаты связали целлюлазную композицию с формально присвоенной активностью. Активность выражали в единицах WBCU. Единица WBCU определяется как количество целлюлазы, которая в условиях анализа гидролизует в течение 1 ч некоторое количество эквивалентных гликозидных связей для образования 0,5 мг глюкозы. Активность рассчитывали с помощью протоколов стандартного расчета известных в данной области путем нанесения значений deltaOD540 относительно активности образцов с известной активностью, с последующим расчетом активности неизвестных образцов с помощью уравнения, полученного из калибровочной линии. Пример 1. Трансформация Talaromyces emersonii плазмидами, содержащими маркеры устойчивости к флеомицину. В данном примере описан способ трансформации Т. emersonii плазмидой pAN8-1, несущей маркер устойчивости к флеомицину (Mattern, I.E., Punt, P.J., Van den Hondel, C.A.M.J.J., 1988. A vector of Aspergillus transformation conferring phleomycin resistance. Fungal Genet. Newsl. 35, 25). Трансформация Т. emersonii плазмидой pAN8-1. Споры выращивали в течение 16 ч при 45 С в ротационном шейкере при 250 об./мин в среде YGG"Miracloth" (Calbiochem, Ноттингем, Великобритания). Для образования протопластов на 2 г мицелия добавляли 10 мл буфера STC (на 1 л: 218 г сорбита (1,2 М), 7,35 г CaCl22 Н 2 О, 10 мМ Tris/HCl pH 7,5) и 2 мл раствора "Glucanex" (250 мг/мл Glucanex 200G (Novozymes) в H2O). Смесь инкубировали в ротационном шейкере при 100 об./мин и 34 С в течение 90-150 мин. Протопласты отделяли от мицелия с помощью фильтра "Miracloth" и добавляли STC до конечного объема 45 мл. Протопласты центрифугировали в течение 5 мин при 1560 g и при 4 С и ресуспендировали в буфере STC в концентрации 108 протопластов/мл. Для трансформации добавляли 200 л суспензии протопластов к 10 г ДНК pAN8-1 в буфере ТЕ(10 мМ Tris-HCl pH 7,5, 0,1 MM EDTA) и 18 л 0,4 М ауринтрикарбоновой кислоты. Затем добавляли 100 л раствора PEG (20% PEG 4000 (Merck, Ноттингем, Великобритания) в STC) и после инкубации суспензии ДНК-протопласты в течение 10 мин при комнатной температуре медленно добавляли 1,5 мл раствораPEG (60% PEG 4000 (Merck) в STC) при постоянном перемешивании пробирок. После инкубации в течение 15 мин при 25 С суспензии разводили 2 мл STC и смешивали переворачиванием. Примерно 200-600 л суспензии протопластов добавляли к 5 мл мягкого агара (среда для регенерации, содержащая 6 г/л агара, без селекции) и напрямую рассевали на 10 см чашки Петри с 20 мл среды для регенерации, содержащей 10 г/мл флеомицина. Среда для регенерации содержит на 1 л: 6 г NaNO3, 0,52 г KCl, 1,52 г