Короткая внутренне сегментированная интерферирующая рнк

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Дата публикации и выдачи патента КОРОТКАЯ ВНУТРЕННЕ СЕГМЕНТИРОВАННАЯ ИНТЕРФЕРИРУЮЩАЯ РНК Настоящее изобретение относится к фармацевтическим и терапевтическим композициям,содержащим РНК-комплексы, содержащие антисмысловую цепь и прерывистую цепь-пассажир,обладающие способностью регулировать экспрессию генов. Применение прерывистой цепипассажира позволяет минимизировать побочные эффекты РНК-комплексов, а также имеет другие преимущества. 015563 Область, к которой относится настоящее изобретение Настоящее изобретение относится к ингибированию экспрессии гена in vivo с использованием модифицированных киРНК-комплексов. Так, например, РНК-комплексы согласно изобретению могут быть использованы в фармацевтических композициях или в in vivo анализах на генные функции. Предшествующий уровень техники В последние годы интерференция РНК привлекает огромное внимание ученых, поскольку она может обеспечивать специфическое ингибирование экспрессии гена. Очевидно, что это является очень важным фактором в базовых исследованиях по изучению генетических и биохимических процессов или функций отдельных генов и генных продуктов. Поэтому интерференция РНК становится очень важным инструментом для подтверждения мишеней, используемых в фармацевтической промышленности. Более того, были инвестированы значительные средства в разработку РНК-комплексов, которые обладали бы способностью опосредовать интерференцию РНК и которые могли бы быть использованы в качестве лекарственных средств. Привлекательность интерференции РНК (РНКи) для ее применения в терапии заключается в чувствительности и в специфичности последовательности интерферирующей РНК. Однако в связи со специфичностью такой последовательности могут возникать определенные проблемы, которые связаны, например, с тем, что несоответствующая цепь РНК-комплекса может продуцировать ответ на нерелевантные нуклеиновые кислоты-мишени. Кроме того, РНК-комплексы определенного размера индуцируют неспецифический интерферон-зависимый ответ, который также является нежелательным. В патентной заявке US2003/0108923 описаны РНК-комплексы, способные опосредовать РНКи и содержащие антисмысловую цепь и цепь-пассажир, где указанные цепи имеют длину в 21-23 нуклеотида. Было высказано предположение, что РНК-комплексы могут быть использованы в терапевтических целях. Аналогичным образом, в патентной заявке US2005/0234007 описаны РНК-комплексы, обладающие способностью опосредовать РНКи и содержащие антисмысловую цепь и цепь-пассажир, где указанный комплекс имеет выступающие 3'-концы. Было высказано предположение, что РНК-комплексы могут быть использованы в терапевтических целях. В WO2005/073378 описаны РНК-комплексы, которые способны опосредовать РНКи и содержат антисмысловую цепь и цепь-пассажир. РНК-комплексы, описанные в этой заявке, включают остаткиLNA, при этом было установлено, что включение остатков LNA возле 5'-конца одной из цепей может регулировать включение цепи в комплекс RISC, так как в комплекс RISC включается цепь, которая образует самую слабую пару оснований у 5'-конца. В публикации Matranga et al. (2005, Cell Vol. 123, pp. 607-620) указывается, что для созревания активного комплекса RISC необходимо расщепление цепи-пассажира белком Ago-2. Расщепление цепипассажира происходит в процессе сборки RISC в положениях между нуклеотидами 9 и 10. В публикации Leuschner et al., (отчеты EMBO, опубликованные в оперативном режиме 20-го января 2006 г.) описаны комплексы РНКи-индуцированного сайленсинга, которые имеют прерывистую цепьпассажир. В публикации Leuschner et al. также указывается присутствие остатков 2'-O-метилрибозы в положении 9 цепи-пассажира (5'-3'). РНКи-комплексы были протестированы in vitro в эксперименте с использованием клеточных экстрактов. Было обнаружено, что использование прерывистых цепейпассажиров приводит к эффективному расщеплению РНК-мишени так, как это происходит под действием РНКи-комплексов, в которых остаток 2'-О-метилрибозы расположен в сайте расщепления цепипассажира (9). Однако если остаток 2'-О-метилрибозы расположен еще выше от сайта расщепления, то наблюдается снижение уровня расщепления РНК-мишени. Ни в работе Leuschner et al., ни в работе Matranga et al. ранее не указывалось или не высказывалось предположения, что комплексы РНКи-индуцированного сайленсинга, имеющие прерывистую цепьпассажир, представляют собой РНКи-комплексы, которые являются предпочтительными для применения в терапии. В настоящее время использование синтетических киРНК in vivo связано с определенными проблемами, возникающими из-за отсутствия эффективных средств для доставки киРНК, а также из-за ее низкой биологической стабильности в биологических жидкостях и низкой специфичности действия, обусловленной нежелательными эффектами, обычно продуцируемыми генами и ассоциированными с поведением всех исследуемых киРНК, которое подобно поведению микроРНК (Jackson, A.L. et al., (2003) Nat.Bioteqhnol, 21, 635-637; Birmingham, A. et al., J. et al. (2006) Nat. Methods, 3, 199-204; Jackson, A.L. et al.,(2006) RNA, 12, 1179-1187). Было предпринято несколько попыток снижения уровня нежелательных эффектов посредством химической модификации синтетической киРНК (Jackson, A.L. et al., (2003) Nat Biotechnol., 21, 635-637; Birmingham, A et al., J. et al. (2006) Nat Methods, 3, 199-204; Jackson, A.L. et al.,(2006) RNA, 12, 1179-1187; Elmen, J. et al. (2005) Nucleic Acids Res, 33, 439-447; Jackson, A.L. et al. (2006)RNA) . Поскольку в индуцировании нежелательных эффектов могут участвовать как смысловые, так и антисмысловые цепи (Jackson, A.L. et al., (2003) Nat. Biotechnol., 21, 635-637), то минимизация включения смысловой цепи в активированный RISC должна значительно повышать специфичность нацеливания и, тем самым, снижать уровень нежелательных эффектов от действия смысловой цепи. Хорошо известно,-1 015563 что цепь киРНК, имеющая наименее термодинамически стабильный 5'-конец, преимущественно используется в активированном RISC в качестве антисмысловой цепи (Schwarz, D.S. et al., (2003) Cell, 115, 199208). Двухцепочечные РНК-комплексы могут опосредовать различные модификации нуклеиновых кислот-мишеней в клетке. В этом процессе антисмысловая цепь комплекса действует как ведущая цепь,поскольку антисмысловая цепь может гибридизоваться с нуклеиновыми кислотами-мишенями, которые имеют фрагменты последовательности, комплементарной антисмысловой цепи. Перед нацеливанием на нуклеиновую кислоту-мишень антисмысловую цепь часто включают в РНК-управляемый белковый комплекс (RGPC), который может воздействовать на нуклеиновую кислотумишень. Одним из примеров РНК-управляемого белкового комплекса является комплекс РНКиндуцированного сайленсинга (RISC). Очевидно, что существуют и другие RGPC, и что РНК-комплексы согласно изобретению при их использовании вместе с этими другими RGPC также будут иметь определенные преимущества. Однако комплекс сайленсинга, такой как RISC, при его использовании in vivo в качестве терапевтического средства или инструмента для обнаружения генов, не способен распознавать, какая из двух цепей комплекса киРНК-сайленсинга является нужной антисмыловой цепью, а какая является цепьюпассажиром или ведущей цепью. Введение цепи-пассажира в комплекс сайленсинга может, очевидно,приводить к случайному сайленсингу последовательности, не являющейся мишенью, т.е. к сайленсингу нежелательных мишеней, которые имеют достаточно высокую степень комплементарности цепипассажиру. Поэтому риск возникновения таких нежелательных эффектов является основной проблемой,которую необходимо рассматривать при разработке терапевтических средств и средств для обнаружения генов с использованием киРНК-комплексов. В одном из аспектов изобретения выбор цепи для ее введения в комплекс RISC зависит от прочности водородных связей между 5'-концами каждой цепи. При конструировании киРНК, в которой 5'основание цепи-пассажира представляет собой G или С, а 5'-основание антисмысловой цепи представляет собой А или Т, желательно остановить свой выбор на включение в комплекс сайленсинга RISC антисмысловой цепи. Однако это не исключает введения в комплекс сайленсинга RISC и цепипассажира. Введение повышающих аффинность нуклеотидных аналогов у 5'-конца цепи-пассажира также позволяет дополнительно уменьшить число цепей-пассажиров, вводимых в комплекс сайленсинга RISC. В соответствии с этим было обнаружено, что селективная термодинамическая стабилизация 5'-концов смысловой цепи путем включения блокированных нуклеиновых кислот (LNA) позволяет снизить уровень нежелательного сайленсинга генов под действием смысловой цепи (Elmen, J. et al. (2005) NucleicAcids Res, 33, 439-447; Petersen, M. and Wengel, J. (2003) Trends Biotechnol, 21, 74-81). Включение нуклеотидных аналогов в положения 10 и 12 (от 5'-конца) цепи-пассажира может предотвращать RISC-расщепление, поскольку считается, что эти остатки находятся на одной линии с каталитическим центром комплекса RISC. Однако включение повышающих аффинность нуклеотидных аналогов приводит к снижению эффективности модифицированных комплексов киРНК, что возможно обусловлено повышением резистентности киРНК к действию геликазы комплекса RISC. Поэтому введение большого числа повышающих аффинность нуклеотидных аналогов должно быть ограничено из-за негативного влияния таких аналогов на эффективность сайленсинга. Введение дцРНК-комплексов в клетки млекопитающего может приводить к индуцированию интерферонового ответа и, тем самым, к гибели клеток. Хотя ранее считалось, что интерфероновый ответ ограничивается присутствием более длинных молекул дцРНК, например, молекул, ассоциированных с вирусной инфекцией и репликацией вируса, однако в настоящее время известно, что такой интерфероновый ответ может быть также индуцирован молекулами, подобными короткой интерферирующей РНК. Было высказано предположение, что введение нуклеотидных аналогов в киРНК может быть осуществлено для ограничения или даже предупреждения индуцирования эффекта интерференции. Следовательно, может оказаться желательным введение нуклеотидных аналогов в киРНК-подобные комплексы для их последующего применения in vivo. Считается, что введение резистентных к нуклеазе нуклеотидных аналогов может оказаться полезным для защиты выступающих 3'-концов киРНК. Поскольку выступающие 3'-концы не повышают жесткости условий гибридизации смысловой цепи и цепи-пассажира, то они не оказывают негативного влияния на действие геликазы комплекса RISC. Следовательно, успешное и эффективное in vivo применение киРНК, например, в терапевтических целях и в целях обнаружения генов, связано с серьезными проблемами, которые могут быть решены путем предупреждения нежелательных эффектов, ассоциированных с нерелевантным сайленсингом, вызываемым цепью-пассажиром, и предотвращения возникновения нежелательных ингибирующих эффектов, ассоциированных с использованием усиливающих аффинность нуклеотидных аналогов. Краткое описание графического материала На фиг. 1-6 проиллюстрированы примеры различных структур РНК-комплексов согласно изобрете-2 015563 нию. Для специалиста в данной области очевидно, что различные проиллюстрированные признаки могут быть объединены друг с другом, например, конкретный паттерн выступающих концов может быть объединен с одним или несколькими разрывами в конкретных положениях, которые могут быть, а могут и не быть, связаны между собой. Таким образом, представленный иллюстративный материал не должен интерпретироваться как ограничение объема изобретения, так, например, природа и положение разрыва могут быть изменены, и могут быть добавлены дополнительные признаки. На фиг. 1 проиллюстрированы основные структурные признаки РНК-комплексов согласно изобретению. А: Показана коровая двухцепочечная область РНК-комплексов согласно изобретению. В: Показана антисмысловая цепь (нижняя цепь) и прерывистая цепь-пассажир (верхняя цепь). Также показан разрыв цепи-пассажира. Следует отметить, что указанный разрыв представляет собой репрезентативный одноцепочечный разрыв, и в настоящей заявке описаны разрывы других видов. На фиг. 2 - различные комбинации выступающих и тупых концов. На фиг. 3 показано, что в цепи-пассажире могут присутствовать один или несколько разрывов. На фиг. 4 показано, что размер разрывов может варьироваться. На фиг. 5 показано, что для соединения антисмысловой цепи с цепью-пассажиром и/или для соединения первой и второй молекул РНК цепи-пассажира могут быть использованы один или несколько линкеров. На фиг. 6 показано, что положение разрыва может варьироваться. На фиг. 7-12 приводятся экспериментальные данные, полученные, как описано в разделе Примеры. Фиг. 7 - Стабильность киРНК, siLNA и квсиРНК в сыворотке. Дуплексы киРНК (eGFPкиPHK),siLNA (JW1103, JW1106) и квсиРНК (JW1103, W004, W005) инкубировали в 10% фетальной бычьей сыворотке в течение указанного времени при концентрации 20 мкМ и при 37 С, а затем подвергали электрофорезу в неденатурирующем полиакриламидном геле и визуализировали путем окрашивания SYBRзолотом. Прямая линия проведена непосредственно над предполагаемой миграцией нерасщепленных олигонуклеотидов. Фиг. 8 - Анализ на экспрессию eGFP, проводимый с помощью флуоресцентной микроскопии. Тестирование ингибирования квсиРНК и родственных конструкций. Клетки НТ 1089 обрабатывали 50 нМ указанных комбинаций PHK/LNA и анализировали через 48 ч после экспрессии eGFP. Экспрессию EGFP оценивали на уровне РНК и на уровне белка.(А) Анализ на экспрессию EGFP в клетках, проводимый с помощью флуоресцентной микроскопии. Клетки обрабатывали 50 нМ указанных комбинаций олигонуклеотидов PHK/LNA и анализировали через 48 ч после анализа на экспрессию EGFP.(С) Нозерн-блот-анализ, указывающий на экспрессию мРНК EGFP через 48 ч (дорожки 1-6) и через 120 ч (дорожки 7-12). Фиг. 9 - Анализ на экспрессию мРНК eGFP и белка EGFP в квсиРНК-обработанных клетках. А: Вестерн-блот-анализ, указывающий на экспрессию белка eGFP в клетках, обработанных 50 нМ указанных комбинаций олигонуклеотидов. Фильтр повторно зондировали антителом, специфичным к белку hnRNPCl, используемому в качестве контроля загрузки. В: Нозерн-блот-анализ, указывающий на экспрессию мРНК eGFP через 48 ч (дорожки 1-6) и 120 ч(дорожки 7-12). Фильтр снова зондировали на экспрессию белка hnRNP A1, используемого в качестве загрузочного контроля. Образцы РНК анализировали в дубликатах при тех же самых условиях. Фиг. 10 - Анализ на экспрессию eGFP в течение более длительного периода времени. 10 А: Вестерн-блот-анализ, указывающий на экспрессию eGFP через 48, 120 и 180 ч после трансфекции с использованием указанных комбинаций олигонуклеотидов. Белок hnRNP C1 был включен в качестве внутреннего контроля. Фильтр повторно зондировали на экспрессию hnRNP A1, используемого в качестве загрузочного контроля (дорожки 1-12). Образцы РНК анализировали в дубликатах при тех же самых условиях. 10 В: Проточный анализ на среднюю эффективность флуоресценции для 50000 клеток (данные получены из трех экспериментов). Фиг. 11 - Сравнение эффективности ингибирования под действием квсиРНК и других siLNA и киРНК, нацеленных на одну и ту же последовательность. А. Эффективность ингибирования квсиРНК, siLNA и киРНК. В. Анализ зависимости эффективности ингибирования от концентрации. Количественную оценку белка проводили, исходя из среднего уровня экспрессии eGFP приблизительно для 50000 клеток, определенного с помощью проточной цитометрии, а мРНК eGFP количественно оценивали с помощью Нозернблот-анализа так же, как это было проиллюстрировано на фиг. 3. киРНК с несоответствиями, представляет собой киРНК, которая содержит 4 несоответствия по отношению к eGFP-мишени (см. последовательность, представленную ниже). Фиг. 12 - Оптимизация конструкции квсиРНК. Эффективность ингибирования eGFP, оцениваемая с-3 015563 использованием различных вариантов конструкций квсиРНК, содержащих прерывистую цепьпассажир. Количественную оценку белка проводили, исходя из среднего уровня eGFP, измеренного с помощью проточной цитометрии. киРНК с несоответствиями представляет собой киРНК, содержащую 4 несоответствия по отношению к eGFP-мишени (см. последовательность, представленную ниже). Сравнение столбцов 3 и 4 показало, что положение ника может смещаться из положения 10 в положение 11 без каких-либо негативных эффектов; в столбце 7 показано, что цепью-пассажиром может быть и РНК,однако более предпочтительными являются цепи-пассажиры, включающие нуклеотидные аналоги, такие как LNA; сравнение столбцов 6 и 8 показало, что в квсиРНК может присутствовать LNAмодифицированная антисмысловая цепь (в дуплексной области), но это приводит к элиминации активности в соответствующей нормальной конструкции киРНК, содержащей аналогичную LNAмодифицированную антисмысловую цепь. Фиг. 13 - Индуцирование ISG56 после РНК-трансфекции в клетках T98G. Анализ интерферонового ответа, индуцированного квсиРНК и другими киРНК-конструкциями. Уровень IGH56, т.е. нижерасположенного маркера интерферонового ответа, то есть вырабатывания интерферона-альфа, измеряли с помощью количественной ОТ-ПЦР. Poly(I/C) был включен в качестве позитивного контроля (представлено без соблюдения масштаба). Ранее было обнаружено, что 27-мерная киРНК, состоящая из 27- и 25 нуклеотидной ведущей цепи и цепи-пассажира, соответственно, индуцирует интерфероновый ответ на умеренном уровне. LNA-модифицированная квсиРНК и LNA-модифицированная киРНК не активирует интерфероновую систему, как было оценено по индуцированию ISG56 в клетках T98G. Клеточную линию глиобластомы T98G трансфицировали 80 нМ вариантами киРНК или 0,8 мкг poly(I:C), как показано на данной фигуре, и уровни мРНК ISG56 оценивали с помощью кол.ПЦР-анализа, проводимого через 48 ч после трансфекции. Трансфекция лишь полинуклеотидами poly(I:C) (используемыми в качестве позитивного контроля) приводила к индуцированию высоких уровней ISG56, а уровни ISG56 для всех киРНК-вариантов не отличались от уровней, наблюдаемых в необработанных клетках или в клетках, обработанных только трансфицирующим реагентом (Mirus Trans-IT TKOR) . Фиг. 14 - Определение нежелательного эффекта квсиРНК. Фиг. 15 - квсиРНК и siLNA обнаруживают повышенную стабильность в сыворотке по сравнению с немодифицированной киРНК. Стабильность конструкции квсиРНК в сыворотке.(А) LNA-модифицированная квсиРНК и LNA-модифицированная киРНК обнаруживали более высокую стабильность в сыворотке по сравнению с немодифицированной киРНК. Варианты киРНК инкубировали в 80% FCS и через определенные промежутки времени брали аликвоты. Стабильность в сыворотке оценивали с помощью электрофореза в ПААГ, с последующим окрашиванием SYBR-золотом. киРНК разлагалась уже через 1-1,5 ч после начала инкубирования в сыворотке, тогда как LNAмодифицированная квсиРНК и LNA-модифицированная киРНК еще присутствовали в значительном количестве через 13 ч после инкубирования. Маркер размера указан слева.(В) Спаривание LNA-оснований играет важную роль в целостности молекул квсиРНК после инкубирования в 10% FCS. Указанные молекулы квсиРНК, имеющие различные LNA-модификации или не имеющие таких модификаций, инкубировали в течение 24 ч в присутствии (+) или в отсутствие (-) 10%FCS, и стабильность дуплекса оценивали с помощью электрофореза в ПААГ, с последующим окрашиванием SYBR-золотом. Конструкции квсиРНК, содержащие LNA в обеих цепях, обладали абсолютной стабильностью, тогда как квсиРНК, содержащая только РНК, полностью разлагалась после инкубирования в сыворотке. Схематически показано положение LNA-модификаций (вертикальные линии). Фиг. 16 - Оптимизация конструкции квсиРНК. Эффективности ингибирования различных конструкций квсиРНК и киРНК сравнивали по нацеливанию на мРНК EGFP.(А) Анализ эффекта гэпов в различных положениях смысловой цепи. Числа соответствуют размерам 5'- и 3'-фрагментов смысловой цепи, соответственно.(В) Анализ влияния модификаций в 3'-концевом нуклеотиде на смысловую цепь. Дуплексы схематически представлены ниже. Среднюю интенсивность флуоресценции приблизительно для 50000 клеток измеряли с помощью проточной цитометрии. киРНК с несоответствиями представляет собой киРНК,содержащую четыре несоответствия по отношению к EGFP-мишени. Фиг. 17 - Конструкция квсиРНК повышает специфичность сайленсинга генов. Ингибирующую активность двух цепей оценивали путем измерения уровня экспрессии люциферазы в репортерных конструкциях, содержащих любую последовательность-мишень в смысловой или в антисмысловой ориентации (белые и серые столбцы, соответственно). Репортерные конструкции представлены выше (без соблюдения масштаба), а конструкции киРНК схематически представлены ниже. Величины, полученные из трех полностью независимых экспериментов, усредняли. Величины для люциферазы, полученные в каждом эксперименте, нормализовали так, чтобы суммы люциферазных активностей в каждом из экспериментов были равны. Для каждой репортерной конструкции отношение люциферазная активность светляка (FL)/люциферазная активность коралла Renilla (RL) нормализовали по контролю с несоответствиями. Фиг. 18 - Конструкция квсиРНК усиливает эффекты сайленсинга химически модифицированных(В) Анализ влияния квсиРНК на эффективность сайленсинга в высокой степени модифицированных антисмысловых цепей. Средняя интенсивность флуоресценции приблизительно для 50000 клеток измеряли с помощью проточной цитометрии. киРНК с несоответствием представляет собой киРНК, содержащую четыре основания, не соответствующие EGFP-мишени.(С) Ингибирующую активность двух цепей оценивали путем измерения уровня экспрессии люциферазы в репортерных конструкциях, содержащих любую последовательность-мишень в смысловой или антисмысловой ориентации (светлые и темно-серые столбцы, соответственно). Эксперимент осуществляли с тремя повторностями, и для каждой репортерной конструкции отношение люциферазной активности светляка (FL)/люциферазной активности коралла renilla (RL) нормализовали по контролю с несоответствиями. На фиг. 19 проиллюстрировано сравнение киРНК-комплексов, содержащих цепь-пассажир, которая включает в себя только остатки ДНК и LNA, либо комбинацию этих остатков, где второй и третий остатки от 3'-конца цепи-пассажира представляют собой LNA-остатки в ДНК-цепи-пассажире, или чередование двух остатков ДНК и одного остатка LNA. Было показано, что не-РНК-цепи-пассажиры, присутствующие в комплексе сайленсинга киРНК, могут быть функциональными. На фиг. 20 проиллюстрировано сравнение LNA-модифицированных и немодифицированных квсиРНК-конструкций в клеточной культуре и показано, что введение LNA в прерывистую цепьпассажир приводит к усилению эффекта сайленсинга и что смещение одноцепочечного разрыва (ника) из положения 10 в положение 11 цепи-пассажира не оказывает значительного влияния на эффективность сайленсинга. Уровни экспрессии, указанные для мРНК GFP со средней интенсивностью флуоресценции и EGFP, представляют собой величины, оцененные в проводимых экспериментах. На фиг. 21 проиллюстрировано сравнение 2'-F-ДHK- и 2'-О-Ме-РНК-модифицированных квсиРНК и показано, что цепи-пассажиры, содержащие такие модификации, дают некоторый уровень сайленсинга, но этот сайленсинг не является таким эффективным, как сайленсинг, наблюдаемый в присутствииLNA (фиг. 20). Уровни экспрессии, указанные для мРНК GFP со средней интенсивностью флуоресценции и EGFP, представляют собой величины, оцененные в проводимых экспериментах. На фиг. 22 проиллюстрировано сравнение прерывистых и непрерывных LNA-модифицированных цепей-пассажиров квсиРНК, которое показало, что более функциональными являются цепипассажиры в LNA-модифицированной квсиРНК, чем в siLNA (LNA-модифицированной киРНК). Уровни экспрессии, указанные для мРНК GFP со средней интенсивностью флуоресценции и EGFP, представляют собой величины, оцененные в проводимых экспериментах. На фиг. 23 проиллюстрировано сравнение квсиРНК с LNA-модифицированными антисмысловыми цепями, которое со всей очевидностью указывает на то, что присутствие прерывистой цепи-пассажира подавляет ингибирующее действие большого числа модификаций антисмысловых цепей, в частности, в областях, которые образуют гибрид с цепью-пассажиром. Уровни экспрессии, указанные для мРНКGFP и EGFP со средней интенсивностью флуоресценции, представляют собой величины, оцененные в проводимых экспериментах. На фиг. 24 проиллюстрировано сравнение квсиРНК с 2'-F/2'-OMe-LNA-модифицированными антисмысловыми цепями, которое показало, что использование прерывистой цепи-пассажира позволяет использовать полностью модифицированную антисмысловую цепь. Уровни экспрессии, указанные для мРНК GFP и EGFP со средней интенсивностью флуоресценции, представляют собой величины, оцененные в проводимых экспериментах. На фиг. 25 показано, что использование прерывистой цепи-пассажира также позволяет включать 2' -адамантил-амино-LNA в антисмысловую цепь. Уровни экспрессии, указанные для мРНК GFP со средней интенсивностью флуоресценции и EGFP, представляют собой величины, оцененные исходя из проводимых экспериментов. На фиг. 26 проиллюстрирован анализ 2'-F и 2'OMe-квсиРНК-конструкций по сравнению с LNAквсиРНК-конструкциями и показано, что если цепь-пассажир модифицирована 2'-F и 2'OMe, то ингибирование происходит не так эффективно, как это наблюдается в случае конструкций, содержащих LNA. На фиг. 27 показано, что квсиРНК-конструкции с тремя молекулами РНК в цепи-пассажире, являются также эффективными в отношении ингибирования их мРНК-мишени, хотя их действие не является таким явным, как действие эквивалентной квсиРНК с тремя молекулами, в которой цепьпассажир состоит только из двух молекул РНК. Описание сущности изобретения Настоящее изобретение относится к абсолютно новой конструкции терапевтического комплекса сайленсинга, отличающейся тем, что она содержит интактную антисмысловую цепь, комплементарную прерывистой цепи (цепи-пассажира) и обычно состоящую из двух нуклеотидных смысловых цепей,каждая из которых имеет длину в 9-13 нуклеотидных оснований. Авторами настоящего изобретения бы-5 015563 ло обнаружено, что лишь антисмысловая цепь этой конструкции способна осуществлять сайленсинг генов и, тем самым, значительно повышать специфичность нацеливания. Кроме того, хотя, в некоторых случаях, использование прерывистой цепи-пассажира может приводить к снижению стабильности комплекса сайленсинга, что обусловлено, возможно, более высокой вероятностью диссоциации цепей-пассажиров и антисмысловых цепей перед взаимодействием с комплексом RISC, однако авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что усиливающие аффинность нуклеотидные аналоги в дуплексе, образованном между прерывистой цепьюпассажиром и антисмысловой цепью, могут быть использованы для эффективной стабилизации дуплекса in vivo, без какого-либо чрезмерного воздействия на функциональность указанного комплекса в отношении сайленсинга, направленного на нужную мишень антисмысловой цепи. Поэтому настоящее изобретение позволяет избежать возникновения побочных эффектов, опосредуемых цепьюпассажиром, и что особенно примечательно, оно позволяет также вводить большое число нуклеотидных аналогов в дуплекс комплекса сайленсинга, что дает значительное преимущество с точки зрения стабильности дуплекса in vivo, повышает его резистентность к действию нуклеазы и предотвращает продуцирование интерферонового ответа. Дуплекс, образованный между двумя молекулами РНК, обычно присутствует в А-конформации, а дуплекс, образованный между двумя молекулами ДНК, обычно присутствует в В-конформации. Дуплекс, образованный между молекулами ДНК и РНК, обычно присутствует в промежуточной конформации (А/В-форме). Нуклеотидные аналоги, такие как бета-D-окси-LNA, могут быть использованы для стимуляции образования конформации, больше напоминающей А-форму. Поскольку считается, что рекрутинг под действием комплекса RISC зависит от конкретной структурной конформации киРНК, то предпочтительно, чтобы нуклеотидные аналоги, используемые в дуплексе, либо стимулировали образование А-конформации двухцепочечного РНК-комплекса, либо не препятствовали такому образованию. Для того чтобы определить, образует ли такой дуплекс Аконформацию, могут быть применены стандартные ЯМР-или CD-методы (методы циркулярного дихроизма). Однако авторами настоящего изобретения было также установлено, что может также оказаться эффективным использование нуклеотидных аналогов, стимулирующих образование В-конформации, таких как альфа-L-изомер LNA, который с точки зрения настоящего изобретения является предпочтительным мономерным остатком нуклеотидного аналога, то есть предпочтительным для его включения в цепьпассажир. Поэтому авторы настоящего изобретения считают, что главное не то, что цепь-пассажир образует А-конформацию с антисмысловой цепью, а то, что она может образовывать промежуточную А/В-конформацию, а в одном из вариантов изобретения, даже В-конформацию. В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир состоит из олигонуклеотидов, которые включают нуклеотидные LNA-аналоги и 2'OMe- или 2'-фтор-аналоги, описанные ниже. В этом варианте изобретения предусматривается, что одна конструкция может включать цепи-пассажиры, состоящие из чередующихся остатков нуклеотидных аналогов LNA и 2'-OMe-аналогов, или из чередующихся LNA и 2'-фтор-аналогов, или из комбинаций нуклеотидных аналогов LNA и 2'-ОМе/2'-фтор-аналогов. Кроме того, включение нуклеотидных аналогов, таких как мономерные остатки LNA в дезинтегрированную смысловую цепь, приводит к значительному повышению стабильности в сыворотке и к пролонгированному ингибированию мишени. Интересно отметить, что конструкция квсиРНК может быть функционально адаптирована к высокомодифицированным антисмысловым цепям, которые являются нефункциональными в качестве стандартных киРНК. Это особенно важно для применения киРНК invivo, в частности, для их применения в качестве терапевтического средства или в качестве средства для исследований в области функциональной геномики. Настоящее изобретение относится к РНК-комплексам, содержащим прерывистую цепь-пассажир,используемую для РНК-управляемой регуляции гена, в частности, интерференции РНК. Таким образом,целью настоящего изобретения является получение РНК-комплексов, которые снижают уровень нежелательных эффектов по сравнению с обычно используемыми РНК-комплексами. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к РНК-комплексам, которые снижают уровень интерферонового ответа. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к РНК-комплексам, обладающим улучшенными свойствами с точки зрения синтеза и возможности введения химических модификаций. РНКкомплексы могут присутствовать в форме фармацевтической (терапевтической) композиции, содержащей РНК-комплекс и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или адъювант. Подробное описание изобретения Авторами настоящего изобретения была разработана новая конструкция терапевтической (или invivo) киРНК, состоящей из интактной антисмысловой цепи, комплементарной прерывистой цепипассажиру, обычно двум более коротким смысловым цепям, состоящим из 9-13 нуклеотидов. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что такая конструкция является полностью функциональной и, по сравнению со стандартными дуплексными киРНК-конструкциями из 21 нуклеотида, имеет не-6 015563 сколько следующих преимуществ: 1. Сегментированная природа цепи-пассажира полностью предотвращает ее участие в нежелательном ингибировании гена, поэтому значительно повышает специфичность нацеливания и, вероятно,снижает уровень нежелательных эффектов. 2. Конструкция квсиРНК способна сохранять функцию химически модифицированных антисмысловых цепей (таких как антисмысловые цепи, которые включают нуклеотидные аналоги, такие какLNA), которые являются нефункциональными в присутствии стандартного киРНК-дуплекса, что позволяет включать большее число химических модификаций (например, нуклеотидных аналогов) в антисмысловую цепь. 3. Конструкция квсиРНК имеет по меньшей мере шесть концов по сравнению с нормальной киРНК,имеющей 4 конца, и такая конструкция может быть с успехом использована в целях присоединения функциональных химических групп для облегчения, например, доставки в клетки. Так, например, можно присоединять объемные группы, такие как холестерин, к 5'-концу нижерасположенной смысловой цепи без какой-либо потери активности. 4. Поскольку при синтезе более коротких РНК-цепей выход обычно является более высоким, то, в случае использования конструкции квсиРНК, затраты на крупномасштабный синтез в сочетании с терапевтическим применением могут быть снижены. 5. Использование нуклеотидных аналогов, в частности, LNA в цепи-пассажире квсиРНК значительно повышает стабильность в сыворотке, что приводит к более эффективному и пролонгированному сайленсингу генов по сравнению со стандартными киРНК. Важным отличительным признаком конструкции квсиРНК является ее способность полностью предотвращать какое-либо участие сегментированной цепи в сайленсинге генов при сохранении РНКиактивности противоположной интактной цепи (как показано на фиг. 17). Предполагается, что увеличение специфичности сайленсинга генов может приводить к снижению нежелательного воздействия смысловой цепи на весь геном, которое наблюдалось в других исследуемых киРНК (Jackson, A. L. et al., (2003)Nat Biotechnol, 21, 635-637). Кроме того, поскольку выбор цепи определяется, главным образом, термодинамической асимметрией концов киРНК-дуплекса, то конструирование высокоэффективной киРНК может быть затруднено в том случае, если последовательность-мишень ограничена термодинамически неблагоприятной областью, например, в случае, если потребуется ввести нужную мутацию в один нуклеотид, либо если такое конструирование проводят в области стыка гибридных генов. В этих случаях использование конструкции квсиРНК будет гарантировать то, что только несегментированная цепь сможет участвовать в сайленсинге генов независимо от термодинамического профиля квсиРНК-дуплекса,что позволит устранять значительный нерелевантный сайленсинг, индуцируемый термодинамически благоприятной противоположной цепью.Leuchner et al. ранее продемонстрировали, что предварительно расщепленная киРНК, аналогичная немодифицированной квсиРНК согласно изобретению, способна включаться в RISC и обеспечивать расщепление мишени в клеточном экстракте. Однако авторами настоящего изобретения было обнаружено, что квсиРНК, содержащие цепи-пассажиры без остатков LNA, являются нефункциональными в клеточной среде (то есть in vivo), даже если в короткие смысловые цепи ввести 2'OMeмодифицированные остатки. Из проведенных авторами анализов на стабильность (фиг. 15 А) очевидно,что наиболее вероятным объяснением этому является то, что немодифицированные цепи в квсиРНК подвергаются диссоциации и разлагаются in vivo, а также то, что лишь значительное увеличение Tm, сообщаемое остатками нуклеотидных аналогов, такими как остатки LNA, делает этот дуплекс достаточно стабильным в данных условиях. Интересным наблюдением является то, что функция квсиРНК не имеет явной зависимости от конкретной структурной мимикрии промежуточного продукта Ago2-расщепления, поскольку одноцепочечный разрыв может быть смещен в пределах 1-2 нуклеотидов без значительной потери эффективности сайленсинга (фиг. 16 А). В частности, конструкция квсиРНК, имитирующая природный продукт Ago2 расщепления (квсиРНК 9+13), очевидно, является менее эффективной, чем конструкция, в которой одноцепочечный разрыв в 1 и 2 нуклеотида смещается в направлении 3'-конца смысловой цепи (квсиРНК 10+12 и квсиРНК 11+11). Исходя из данных in vitro, полученных Leuchner et al., можно отметить, что эти конструкции, по всей вероятности, расщепляются Ago2 с высвобождением одного или двух нуклеотидов, соответственно. Поэтому возможно, что событие природного Ago2-расщепления в конструкциях квсиРНК 10+12 и квсиРНК 11+11 может также усиливать активацию RISC посредством облегчения последующих стадий активации RISC, таких как, например, элиминация смысловой цепи. Поэтому авторы настоящего изобретения считают, что конструкция квсиРНК 10+12 вводит новые коррективы в функции киРНК, помимо тех, которые сообщаются структурной мимикрией природных промежуточных соединений в каскаде реакций РНКи. Наблюдения, проведенные авторами настоящего изобретения и другими исследователями, показали, что большое число химических модификаций в антисмысловой цепи киРНК обычно несовместимо с их функцией сайленсинга генов. Интересно отметить, что конструкция квсиРНК может обеспечивать-7 015563 введение в высокой степени модифицированных антисмысловых цепей в активированный RISC, который затем будет эффективно регулировать Ago2-опосредуемое расщепление мРНК-мишени. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что неспособность антисмысловых цепей, экстенсивно модифицированных LNA, LNA/адамантилом и LNA/пиренилом, поддерживать активность RISC может частично устраняться с помощью квсиРНК-конструкции, тогда как аналогичным образом модифицированные стандартные киРНК являются нефункциональными (фиг. 18). Это указывает на то, что модификации в центральной части антисмысловой цепи не оказывают негативного влияния на реакцию расщепления мишени самим активированным RISC, а вместо этого приводят к рекрутингу киРНК в RLC, расщеплению смысловой цепи и/или расплетанию дуплекса. Кроме того, наблюдение того, что множество модификаций в антисмысловой цепи очевидно также не индуцирует включение смысловой цепи в активированный RISC, позволяет сделать вывод, что это обусловлено не просто ошибкой в выборе цепи (фиг. 18). В соответствии с этим спасение сайленсинга квсиРНК-конструкцией, очевидно, не зависит от изменения термодинамического профиля киРНК, поскольку адамантильные и пиренильные модификации, если они существуют, слегка дестабилизируют киРНК-дуплексы, в отличие от стабилизирующего действияLNA-остатков. Поэтому наиболее вероятным объяснением эффекта квсиРНК является то, что в высокой степени модифицированные киРНК могут быть слишком ригидными или объемными, а поэтому не могут распознаваться Ago2 в процессе активации RISC, что приводит к невозможности расщепления смысловой цепи и ее последующего удаления. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, авторы настоящего изобретения лишь отмечают, что возможным объяснением этому может служить тот факт,что центральный одноцепочечный разрыв цепи в конструкции квсиРНК может сообщать квсиРНКдуплексу большую структурную гибкость, что позволяет ему занимать лучшее положение для Ago2 расщепления в процессе активации RISC. Введение большого числа химических модификаций в киРНК может давать определенные преимущества на более ранних и более поздних стадиях активации RISC в каскаде реакций РНКи. Введение липофильных групп, таких как адамантил и пиренил, может приводить к увеличению уровня поглощения киРНК-дуплексов клетками, а введение неприродных модификаций обычно приводит к повышению биологической стабильности киРНК во внутриклеточных и во внеклеточных компартментах. Кроме того,модификации в уникальной (seed) области (нуклеотиды 2-8 антисмысловой цепи) могут играть важную роль в минимизации нежелательных эффектов природных генов под действием киРНК, как это было ранее продемонстрировано для положения 2 в антисмысловой цепи (Jackson, A.L. et al. (2006) RNA). Авторы настоящего изобретения также считают, что увеличение числа остатков LNA в антисмысловой цепи может улучшать специфичность мишени и аффинность по отношению к этой мишени. Одной из целей настоящего изобретения является возможность установить, которая из цепей двухцепочечного РНК-комплекса фактически функционирует как ведущая РНК в RGPC. По определению,считается, что ведущей цепью является антисмысловая цепь. Однако при этом следует отметить, что проблема, связанная с использованием двухцепочечных РНК-комплексов в целях опосредования модификации нуклеиновых кислот-мишеней, заключается в том, что неправильная цепь этого комплекса может действовать как ведущая цепь. То есть, при этом не имеется в виду, что цепь-пассажир должна опосредовать любую модификацию нуклеиновых кислот-мишеней. Другими словами, целью настоящего изобретения является обеспечение гарантии того, что только антисмысловая цепь, но не цепь-пассажир, будет опосредовать модификации нуклеиновых кислотмишеней. Эта цель может быть достигнута путем получения РНК-комплексов, оказывающих меньшее побочное действие. Основной идеей настоящего изобретения является использование прерывистой цепи-пассажира,поскольку такая прерывистая цепь-пассажир, по всей вероятности, не будет включаться в RGPC в клетке, поэтому она будет неспособна регулировать включение каких-либо модификаций нуклеиновых кислот-мишеней. Другими словами, прерывистость определяет цепь-пассажир по внесению асимметрии в дуплекс. Прерывистая цепь-пассажир, на что указывает ее название, имеет разрывы. Таким разрывом может быть, например, ник или гэп, либо им может быть линкер, как будет очевидно из нижеследующего описания изобретения. РНК-комплексы согласно изобретению, содержащие прерывистую цепь-пассажир, также называются здесь короткой внутренне сегментированной интерферирующей РНК (квсиРНК). Цепь-пассажир может включать несколько отдельных молекул РНК, например, 1, 2, 3 или 4 молекулы РНК. Эти молекулы РНК могут быть связаны друг с другом, а также с антисмысловой цепью. В соответствии с этим термин цепь-пассажир также обычно означает молекулу РНК или молекулы РНК,которые гибридизуются с антисмысловой цепью, независимо от того, разделены ли они разрывом или нет. Такая цепь-пассажир также называется здесь смысловой цепью. Функция цепи-пассажира может стимулировать действие антисмысловой цепи и включение антисмысловой цепи в RGPC, что, в частности, означает, что цепь-пассажир улучшает биологическую доступность и биологическую стабильность антисмысловой цепи. Таким образом, в одном из вариантов-8 015563 изобретения прерывистыми цепями-пассажирами согласно изобретению являются любые цепи, которые обладают вышеупомянутыми функциями и, в то же самое время, удовлетворяют структурным требованиям, заявленным для РНК-комплексов согласно изобретению. В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к РНК-комплексу, способному опосредовать нуклеотидные модификации в нуклеиновой кислоте-мишени. РНК-комплекс включает в себя коровую двухцепочечную область, содержащую антисмысловую цепь и прерывистую цепь-пассажир,которая гибридизуется с антисмысловой цепью. Некоторые структурные признаки такого комплекса представлены на фиг. 1 А и 1 В. Нуклеиновая кислота-мишень согласно изобретению представляет собой нуклеиновую кислоту, которая в высокой степени комплементарна антисмысловой цепи указанного комплекса. Предпочтительно,чтобы указанная комплементарность была абсолютной по всему фрагменту из нескольких нуклеотидов. Таким образом, в одном из вариантов изобретения комплементарность является абсолютной по всему фрагменту из 25 нуклеотидов. В других вариантах изобретения комплементарность является абсолютной по всему фрагменту из 24 нуклеотидов, 23 нуклеотидов, 22 нуклеотидов, 21 нуклеотида, 20 нуклеотидов, 19 нуклеотидов, 18 нуклеотидов, 17 нуклеотидов, 16 нуклеотидов, 15 нуклеотидов, 14 нуклеотидов, 13 нуклеотидов, 12 нуклеотидов, 11 нуклеотидов, 10 нуклеотидов, 9 нуклеотидов или 8 нуклеотидов, соответственно. В одном из вариантов изобретения фрагмент комплементарности (например, фрагменты, перечисленные выше как полностью комплементарные) содержит 1 несоответствие. В других вариантах изобретения фрагмент комплементарности содержит 2 несоответствия, 3 несоответствия или 4 несоответствия, соответственно. Область с несоответствием в 1 основание означает область во фрагменте комплементарности, где не может образовываться одна пара оснований, например, если G находится напротив А. Если присутствует большее число несоответствий, то они могут находиться рядом друг с другом, либо на определенном расстоянии друг от друга в различных областях фрагмента комплементартности. РНК-комплекс включает в себя коровую двухцепочечную область, которая, в основном, представляет собой двухцепочечную область. Одноцепочечные области в РНК-комплексе ассоциируются, главным образом, с разрывом цепи-пассажира и с выступающими концами этого комплекса. Выступающие концы по своей природе являются одноцепочечными, и разрывы могут приводить к образованию одноцепочечных областей в антисмысловой цепи, либо такие разрывы, сами по себе, могут представлять собой одноцепочечную область (узел, bulge). По существу, помимо одноцепочечных областей, ассоциированных с разрывом цепи-пассажира, двухцепочечная область может включать несоответствия. Так, например, в одном из вариантов изобретения двухцепочечная область имеет 1 несоответствие. В других вариантах изобретения двухцепочечная область имеет 2 несоответствия, 3 несоответствия и 4 несоответствия, соответственно. Используемый здесь термин нуклеиновая кислота-мишень может охватывать любую РНК/ДНК,которая должна быть подвергнута модуляции под управлением антисмысловой цепи, такой как расщепление мишени или стерическое блокирование. РНК/ДНК-мишенями могут быть, например, геномная ДНК, геномная вирусная РНК, мРНК, пре-мРНК или некодирующая РНК. Предпочтительной мишенью является мРНК, такая как мРНК, кодирующая белок, ассоциированный с данным заболеванием, такой как АроВ, Вс 12, Hif-1-альфа, сурвивин или р 21 ras, такой как Ha-ras, K-ras или N-ras. Используемый здесь термин "модификация нуклеиновой кислоты-мишени" означает любую модификацию нуклеиновой кислоты-мишени, включая модификации, которые влияют на активность нуклеиновой кислоты-мишени, но не влияют на структуру указанной нуклеиновой кислоты-мишени. Используемый здесь термин "фармацевтическая композиция" эквивалентен терминам терапевтическое средство или терапевтическая композиция и является синонимом этих терминов. В соответствии с этим композиция согласно изобретению может быть использована для профилактики заболевания или для лечения данного заболевания после проявления его фенотипических признаков или его диагностики. Термины соответствующий и соответствует используются здесь для сравнения нуклеотидных последовательностей соединений согласно изобретению и их обратных комплементов или в одном из вариантов изобретения для сравнения нуклеотидных последовательностей и эквивалентных (идентичных) нуклеотидных последовательностей, которые могут, например, содержать другие нуклеотидные основания, но при этом сохранять ту же самую последовательность оснований или их комплементов. Нуклеотидные аналоги непосредственно сравнивают с их эквивалентными или соответствующими природными нуклеотидами. Последовательности, образующие обратный комплемент данной последовательности, называются здесь последовательностями, комплементарными данной последовательности. Предпочтительной нуклеиновой кислотой-мишенью согласно изобретению является мРНК. В соответствии с этим в одном из вариантов изобретения модификацией нуклеиновой кислоты, опосредуемой РНК-комплексом, является интерференция РНК (РНКи). В предпочтительном варианте изобретения РНКи опосредует разложение мРНК. В другом предпочтительном варианте изобретения РНКи опосредует ингибирование трансляции мРНК. В другом варианте изобретения РНКи опосредует ингибирование-9 015563 трансляции и разложение мРНК. В одном из вариантов изобретения модификацией нуклеиновой кислоты, опосредуемой РНКкомплексом, является сайленсинг гена, например суппрессия гена. Сайленсинг гена может быть частичным или полным, и, например, может опосредоваться расщеплением РНК, разложением РНК и/или ингибированием трансляции. В других вариантах изобретения нуклеиновой кислотой-мишенью является некодирующая РНК,например, тРНК, миРНК и их предшественники, малая ядерная РНК (мяРНК), малая ядрышковая РНК(snoPHK) или рекомбинантная РНК (рРНК). В другом варианте изобретения нуклеиновой кислотой-мишенью является геномная ДНК. В таких вариантах изобретения предпочтительными модификациями нуклеиновых кислот являются метилирование ДНК и делеция ДНК. Используемый здесь термин нуклеотидное основание означает нуклеотид, такой как ДНК или РНК, или нуклеотидный аналог. Что касается длины описанной здесь нуклеотидной молекулы, то ее длина соответствует числу мономерных остатков, т.е. нуклеотидных оснований, независимо от того, являются ли эти мономерные остатки нуклеотидами или нуклеотидными аналогами. Что касается нуклеотидных оснований, то термины мономер и остаток являются здесь синонимами. Размер РНК-комплекса согласно изобретению может варьироваться, однако он должен быть подходящим для осуществления одной или нескольких целей изобретения. Это, например, относится к тем случаям, когда конкретной целью изобретения является снижение нежелательного эффекта. Так, например, коровая двухцепочечная область может содержать определенное число пар оснований, выбранное из группы, состоящей из 10 пар оснований, 11 пар оснований, 12 пар оснований, 13 пар оснований, 14 пар оснований, 15 пар оснований, 16 пар оснований, 17 пар оснований, 18 пар оснований,19 пар оснований, 20 пар оснований, 21 пары оснований, 22 пар оснований, 23 пар оснований, 24 пар оснований, 25 пар оснований, 26 пар оснований, 27 пар оснований, 28 пар оснований, 29 пар оснований и 30 пар оснований. Так, например, в этом или в другом варианте изобретения коровая двухцепочечная область может содержать определенное число пар оснований, выбранное из группы, состоящей из 35 пар оснований, 40 пар оснований, 42 пар оснований, 45 пар оснований, 50 пар оснований, 55 пар оснований, 60 пар оснований или 62 пар оснований. В одном из вариантов изобретения коровая двухцепочечная область содержит от 15 до 40 пар оснований. В другом предпочтительном варианте изобретения коровая двухцепочечная область содержит 18-22 пары оснований. В одном из вариантов изобретения коровая двухцепочечная область имеет длину, даже превышающую 40 пар оснований, хотя известно, что в некоторых клетках, введение более длинного двухцепочечного РНК-комплекса повышает вероятность индуцирования интерферонзависимого неспецифического ответа. В одном из таких вариантов изобретения предусматривается, что указанный комплекс перед его связыванием с RGPC процессируется в более короткие двухцепочечные РНК-комплексы. Такой процессинг может осуществляться под действием фермента, подобного РНКазе III, такого как DICER. В предпочтительном варианте изобретения РНК-комплекс имеет выступающие концы. Термин выступающий конец, используемый в настоящем изобретении, означает короткую одноцепочечную область, расположенную за двухцепочечной областью. Различные примеры РНК-комплексов, содержащих выступающие концы, представлены на фиг. 2. В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь РНК-комплекса содержит выступающий 3'конец. В другом варианте изобретения цепь-пассажир содержит выступающий 3'-конец. В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь содержит выступающий 5'-конец. В еще одном варианте изобретения цепь-пассажир содержит выступающий 5'-конец. В предпочтительном варианте изобретения антисмысловая цепь и цепь-пассажир содержат выступающий 3'-конец. Другие комбинации выступающих концов представлены на фиг. 2. Выступающие концы РНК-комплекса могут иметь различную длину, при условии, что она не будет влиять на основную функцию данного комплекса. Так, например, в одном из вариантов изобретения выступающие концы выбраны из группы выступающих концов длиной в 1 нуклеотид, 2 нуклеотида, 3 нуклеотида, 4 нуклеотида, 5 нуклеотидов, 6 нуклеотидов, 7 нуклеотидов и 8 нуклеотидов. Наиболее предпочтительными являются выступающие концы длиной в 1, 2 и 3 нуклеотида, соответственно. В одном из вариантов изобретения выступающий конец антисмысловой цепи имеет такую же длину, как и длина выступающего конца цепи-пассажира. В другом варианте изобретения выступающий конец антисмысловой цепи имеет длину, отличаю- 10015563 щуюся от длины выступающего конца цепи-пассажира. В еще одном варианте изобретения РНК-комплекс содержит по меньшей мере один тупой конец. Термин тупой конец означает конец двухцепочечной нуклеиновой кислоты, не имеющий каких-либо выступающих нуклеотидов, то есть обе цепи двухцепочечной нуклеиновой кислоты заканчиваются в одном и том же положении. В другом варианте изобретения РНК-комплекс затуплен с обоих концов. ПредпочтительныеРНК-комплексы согласно изобретению, по своей структуре, аналогичны продуктам DICER-процессинга более длинных двухцепочечных РНК-комплексов, за исключением разрыва в цепи-пассажире. Другие предпочтительные РНК-комплексы, по своей структуре, аналогичны продуктам процессинга цепи-пассажира под действием эндонуклеазы Ago2. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, можно лишь отметить, что недавно были получены данные, которые позволяют предположить, что каталитический коровый белок RISC, эндонуклеаза Ago2, инициирует элиминацию цепи-пассажира путем отщепления от нее 9 нуклеотидов у 5'-конца в процессе активации RISC. Другими предпочтительными РНК-комплексами согласно изобретению являются комплексы, в которых коровая двухцепочечная область содержит 18-22 пар оснований, и где антисмысловая цепь и цепьпассажир содержат выступающий 3'-конец из 1-3 нуклеотидов (то есть 1, 2 или 3). Антисмысловая цепь РНК-комплекса согласно изобретению может иметь различные длины, при условии, что такое различие не будет оказывать негативного влияния на функцию данного комплекса. Так, например, в некоторых вариантах изобретения, антисмысловой цепью является 15-мер, 16-мер, 17 мер, 18-мер, 19-мер, 20-мер, 21-мер, 22-мер, 23-мер, 24-мер, 25-мер, 26-мер, 27-мер, 28-мер, 29-мер, 30 мер, 31-мер, 32-мер, 33-мер, 34-мер, 35-мер, Зб-мер, 37-мер, 38-мер, 39-мер, 40-мер, 41-мер, 42-мер, 43 мер, 44-мер, 45-мер, 46-мер, 47-мер, 48-мер, 49-мер, 50-мер, 51-мер, 52-мер, 53-мер, 54-мер, 55-мер, 5 бмер, 57-мер, 58-мер, 59-мер, 60-мер, 61-мер или 62-мер, соответственно. Следует отметить, что, например, 19-мер представляет собой антисмысловую цепь из 19 мономеров, то есть цепь из нуклеотидов/нуклеотидных аналогов (нуклеотидных оснований). В другом предпочтительном варианте изобретения антисмысловая цепь РНК-комплекса выбрана из нижеследующей группы антисмысловых цепей: 18-мера, 19-мера, 20-мера, 21-мера, 22-мера и 23-мера. В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь имеет разрывы. Предпочтительно, чтобы разрывы в антисмысловых цепях были аналогичными предпочтительным разрывам в цепи-пассажире. Как указывалось выше, цепь-пассажир согласно изобретению имеет разрывы. В предпочтительном варианте изобретения указанная цепь-пассажир включает в себя несколько отдельных молекул РНК. Число молекул РНК может составлять, например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6. РНК-комплексы с несколькими отдельными молекулами РНК представлены на фиг. 3. В предпочтительном варианте изобретения длина отдельных молекул РНК цепи-пассажира составляет свыше 4 мономеров. В других предпочтительных вариантах изобретения длина отдельных РНКмолекул цепи-пассажира составляет свыше 5 мономеров, 6 мономеров, 7 мономеров, 8 мономеров, 9 мономеров, 10 мономеров, 11 мономеров и 12 мономеров, соответственно. В другом варианте изобретения длина отдельных РНК-молекул цепи-пассажира составляет менее 4 мономеров. В других предпочтительных вариантах изобретения длина отдельных молекул РНК цепипассажира составляет менее 5 мономеров, 6 мономеров, 7 мономеров, 8 мономеров, 9 мономеров, 10 мономеров, 11 мономеров и 12 мономеров, соответственно. В предпочтительном варианте изобретения прерывистая цепь-пассажир содержит первую и вторую молекулы РНК, которые вместе образуют прерывистую цепь-пассажир, где первая молекула РНК гибридизуется с нижерасположенной частью антисмысловой цепи, а вторая молекула РНК гибридизуется с вышерасположенной частью антисмысловой цепи. В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир содержит по меньшей мере первую и вторую молекулы РНК, которые вместе образуют прерывистую цепь-пассажир. В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир содержит только две молекулы РНК, то есть первую и вторую молекулы РНК, описанные выше. В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир содержит первую и вторую молекулы РНК,описанные выше, и по меньшей мере одну другую молекулу РНК. Особый интерес представляет вариант, в котором первая молекула РНК содержит по меньшей мере 3, например, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 остатков нуклеотидного аналога, таких как остатки LNA. В этом варианте изобретения вторая молекула РНК может содержать лишь небольшое число остатков нуклеотидного аналога, например 3, 2, 1 или даже вообще не содержать остатков нуклеотидного аналога. Альтернативно, может присутствовать вторая молекула РНК, которая содержит по меньшей мере 3, например, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 остатков нуклеотидного аналога, таких как остатки LNA, и первая молекула РНК, которая может содержать лишь небольшое число остатков нуклеотидного аналога,например, 3, 2, 1 или даже вообще не содержать остатков нуклеотидного аналога. Альтернативно, первая и вторая цепи могут содержать по меньшей мере 3, например, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 остатков- 11015563 нуклеотидного аналога, таких как остатки LNA. Указанная по меньшей мере другая молекула РНК, предпочтительно, имеет длину по меньшей мере в 3 нуклеотидных остатка, например, 3-9 нуклеотидных остатков, а именно, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 нуклеотидных остатков, или, например, 4-6 нуклеотидных остатков. Вообще говоря, для обеспечения прочности дуплекса, достаточной для его стабильности in vivo,следует учесть, что чем короче длина молекулы(молекул) РНК, составляющей(их) цепь-пассажир, тем больше должно быть число нуклеотидных аналогов. В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир содержит первую и вторую молекулы РНК,описанные выше, и 1-4 дополнительные молекулы РНК, описанные выше, например, 1, 2, 3 или 4 дополнительных молекулы РНК. В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир включает в себя первую молекулу РНК длиной в 8-13 нуклеотидных остатков, например, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 нуклеотидных остатков, например, 9-12 нуклеотидных остатков, а именно 9-11 нуклеотидных остатков. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что особенно эффективными являются цепи-пассажиры, содержащие первую молекулу РНК длиной 9, 10 или 11 нуклеотидов. Во время процессинга в комплексе RISC цепь-пассажир обычно разрывается в положении 9. Авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что в случае РНК-комплексов согласно изобретению, которые вводят одноцепочечный разрыв (ник) в синтезированную киРНК в положении 10 или 11 посредством первой молекулы РНК длиной в 10 или 11 нуклеотидных остатков, обеспечивается очень высокая эффективность молекул киРНК, которая, очевидно,превышает эффективность аналогичных киРНК-комплексов, содержащих вторую молекулу РНК длиной в 9 нуклеотидных остатков. В таких вариантах изобретения прерывистая цепь-пассажир может не содержать других молекул РНК. В одном из вариантов изобретения, который может быть аналогичным вышеуказанному варианту или отличаться от него, цепь-пассажир включает в себя вторую молекулу РНК длиной в 8-14 нуклеотидных остатков, например, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 нуклеотидных остатков, например 9-13 нуклеотидных остатков, а именно 10-13 нуклеотидных остатков. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что особенно эффективными являются цепи-пассажиры, содержащие первую молекулу РНК длиной в 11, 12 или 13 нуклеотидов. В таких вариантах изобретения прерывистая цепь-пассажир может не содержать других молекул РНК. В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир включает в себя первую молекулу РНК длиной в 9 нуклеотидных остатков и вторую молекулу РНК длиной в 12 или 13 нуклеотидных остатков. При этом предпочтительно, чтобы общая длина прерывистой цепи-пассажира составляла 21 (9/12) или 22(9/13) нуклеотидов. В таких вариантах изобретения прерывистая цепь-пассажир может не содержать других молекул РНК. В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир включает в себя первую молекулу РНК длиной в 10 нуклеотидных остатков и вторую молекулу РНК длиной в 11 или 12 нуклеотидных остатков. В таких вариантах изобретения прерывистая цепь-пассажир может не содержать других молекул РНК. В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир включает в себя первую молекулу РНК длиной в 11 нуклеотидных остатков и вторую молекулу РНК длиной в 10 или 11 нуклеотидных остатков. В таких вариантах изобретения прерывистая цепь-пассажир может не содержать других молекул РНК. В одном из вариантов изобретения общая длина первой и второй и, необязательно, других молекул РНК (то есть прерывистой цепи-пассажира, за исключением любых необязательных линкерных нуклеотидов) составляет 18-25 нуклеотидов, например, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидов, а предпочтительно 21-23 нуклеотида (21, 22 или 23). В соответствии с этим в одном из вариантов изобретения длина антисмысловой цепи, за исключением любых необязательных линкерных нуклеотидов, равна длине прерывистой цепи-пассажира. В одном из вариантов изобретения первая, вторая и/или другие молекулы РНК могут содержать нуклеотидный аналог. Такие нуклеотидные аналоги могут быть использованы для получения молекулы,которая образует РНК-подобную структуру и/или обладает функциями, подобными функциям молекулы РНК согласно изобретению, но при этом содержит меньшее число молекул РНК, чем цепь-пассажир эквивалентной немодифицированной киРНК, то есть совсем незначительное число РНК-мономеров, или,фактически, вообще не содержит таких мономеров. Так, например, путем включения достаточного количества остатков LNA в молекулу ДНК можно создать молекулу, функционирующую как цепьпассажир. В таком варианте изобретения в первую, вторую и/или другую молекулу РНК (то есть в молекулы РНК, образующие прерывистую цепь-пассажир) могут быть введены молекулы, содержащие нуклеотиды, не являющиеся РНК-нуклеотидами, или состоящие из таких нуклеотидов, при условии, что в комплексе сайленсинга киРНК такая молекула будет функционировать как молекула РНК. В соответствии с этим в одном из вариантов изобретения цепь-пассажир, например первая, вторая и/или другие молекулы РНК содержат по меньшей мере один LNA-мономер и, необязательно, ДНК-мономеры, а именно, цепь-пассажир, например, первая, вторая и/или другие молекулы РНК состоят из LNA- и ДНК- 12015563 мономеров. Способы включения LNA в молекулы ДНК, подходящие для продуцирования РНК-подобной молекулы, предусматривают введение LNA в каждое второе или в каждое третье положение нуклеотидных оснований (как показано на фиг. 19). В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир содержит нуклеотидные остатки, которыми являются только LNA и ДНК, например, чередующиеся остатки LNA и ДНК. В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир содержит нуклеотидные остатки, которыми являются только LNA и РНК, например чередующиеся остатки LNA и РНК. Также предусматривается, что в цепях-пассажирах или даже в одном из вариантов изобретения в антисмысловой цепи могут присутствовать немодифицированные остатки ДНК. Однако в одном из вариантов изобретения цепи-пассажиры и/или антисмысловые цепи не содержат немодифицированных ДНК-нуклеотидов. Комбинация LNA и других нуклеотидных аналогов, таких как 2'О-метил (2'ОМе) и 2'-фтор (2'F),также может быть использована для конструирования прерывистых цепей-пассажиров или отдельных молекул РНК, образующих прерывистую цепь-пассажир, и/или, в одном из вариантов изобретения,антисмысловую цепь. Так, например, могут присутствовать чередующиеся LNA и 2'O-метил (2'ОМе),чередующиеся LNA и 2'-фтор и чередующиеся 2'O-метил (2'ОМе) и 2'-фтор. Считается, что такие богатые аналогами цепи являются особенно эффективными, если используются РНК-комплексы, которые по каким-либо причинам имеют низкую Tm. Другим преимуществом таких богатых аналогами молекул и цепей РНК является то, что они могут быть использованы для получения в высокой степени in vivo стабильной и резистентной к нуклеазе молекулы, даже если межнуклеозидные связи представляют собой или включают связи, которые, по каким-либо соображениям, должны быть чувствительны к нуклеазе,например, фосфодиэфирные или фосфатные связи. РНК-комплексы, содержащие в основном или только фосфодиэфирные связи, могут оказаться предпочтительными, поскольку, по сравнению с эквивалентными молекулами, содержащими фосфортиоатные связи, они обычно обладают меньшей токсичностью при высоких дозах. Однако в некоторых вариантах изобретения, например, при использовании молекул или цепей РНК,которые имеют высокое содержание ДНК или РНК, может оказаться предпочтительным использование резистентных к нуклеазе связей, таких как фосфортиоатные связи. Однако в некоторых случаях РНКкомплексы, содержащие фосфортиоатные связи, могут оказывать токсическое действие, например, в случае введения таких олигонуклеотидов в головной мозг или в спинной мозг/спинномозговую жидкость. Фосфортиоатные связи могут быть использованы в молекулах антисмысловой цепи и/или цепипассажира. В одном из вариантов изобретения такие цепи/молекулы могут содержать другие связи или смешанные связи, например фосфатные и фосфортиоатные связи, или только фосфатные связи или другие описанные здесь связи. Межнуклеозидная связь может быть выбрана из группы, состоящей из -O-Р(O)2-O-, -O-Р(О,S)-O-, -O-Р(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, OPO(OCH3)-O-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-,-NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-, и/или межнуклеозидная связь может быть выбрана из группы,состоящей из -O-CO-O-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CO-NRH-CH2-,-CH2-NRH-CO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2NRH-CO-, -CH2-NCH3-O-CH2-, где RH выбран из водорода и C1-4-алкила. В некоторых вариантах изобретения могут оказаться предпочтительными межнуклеозидные связи, содержащие серу (S), как описано выше. Введение ников (или, в одном из вариантов изобретения, "гэпов) в цепь-пассажир может приводить к эффективному снижению температуры плавления РНК-комплекса, в результате чего этот комплекс становится более чувствительным к диссоциации. В одном из вариантов изобретения температура плавления каждой молекулы с прерывистой цепью (то есть первой, второй или других молекул РНК,образующих прерывистую цепь-пассажир) превышает 37 С, например, она составляет по меньшей мере 40 С, а именно, по меньшей мере 45 С, а предпочтительно по меньшей мере 50 С. Если длина или содержание GC в части молекулы с прерывистой цепью слишком малы для осуществления диссоциации дуплекса in vivo, то в целях повышения Tm могут быть использованы нуклеотидные аналоги, усиливающие аффинность. Однако в соответствии с настоящим изобретением, считается, что каждая молекула с прерывистой цепью должна иметь длину по меньшей мере в 3 нуклеотида, например, по меньшей мере 4,по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7 или по меньшей мере 8 нуклеотидов. Между первой и второй молекулами РНК и, необязательно, другими молекулами РНК, которые вместе образуют цепь-пассажир, имеется разрыв. Особенно предпочтительным разрывом согласно изобретению является ник (одноцепочечный разрыв). Ник представляет собой разрыв в одной цепи двухцепочечной нуклеиновой кислоты, вызываемый отсутствием фосфодиэфирной связи (подходящей межнуклеотидной связи), но не отсутствием нуклеотида в данной двухцепочечной нуклеиновой кислоте. Таким образом, основания, находящиеся напротив такого разрыва, все же гибридизуются с основаниями на разорванной цепи.- 13015563 Другим разрывом согласно изобретению является альтернативный ник, который известен как разрыв в одной цепи двухцепочечной нуклеиновой кислоты, вызываемый отсутствием одной связи или более чем одной связи в сахарофосфатном остове (в одном из вариантов изобретения, не фосфодиэфирной связи), но не отсутствием нуклеотидного основания в данной двухцепочечной нуклеиновой кислоте. Таким образом, основания, находящиеся напротив такого разрыва, все же гибридизуются с основаниями на разорванной цепи. Следует отметить, что в некоторых вариантах изобретения используемый здесь термин ник может включать понятие альтернативный ник. Термин гэп, используемый в настоящем изобретении, означает разрыв, при котором в двухцепочечной нуклеиновой кислоте отсутствует по меньшей мере один нуклеотид или нуклеозид, или одно нуклеотидное основание. В предпочтительном варианте изобретения ник разделяет первую и вторую молекулу РНК и, необязательно, одну или несколько других молекул РНК, образующих прерывистую цепь-пассажир. В одном из предпочтительных вариантов изобретения прерывистая цепь-пассажир не содержит каких-либо гэпов между первой и второй и, необязательно, другими молекулами РНК. Однако следует отметить, что рассматривается один из вариантов изобретения, в котором прерывистая цепь-пассажир содержит один гэп (или, необязательно, несколько гэпов) между первой и второй и,необязательно, другими молекулами РНК. В одном из вариантов изобретения гэп разделяет первую и вторую молекулу РНК. В одном из вариантов изобретения указанным гэпом является гэп в 1 нуклеотид. В других вариантах изобретения указанным гэпом является гэп в 2 нуклеотида, 3 нуклеотида, 4 нуклеотида, 5 нуклеотидов, 6 нуклеотидов, 7 нуклеотидов, 8 нуклеотидов, 9 нуклеотидов, 10 нуклеотидов, 11 нуклеотидов и 12 нуклеотидов, соответственно. В одном из вариантов изобретения прерывистая цепь-пассажир РНК-комплекса может быть присоединена к антисмысловой цепи. Различные РНК-комплексы, в которых прерывистая цепь-пассажир присоединена к антисмысловой цепи, представлены на фиг. 5. Так, например, в одном из вариантов изобретения первая молекула РНК присоединена к антисмысловой цепи посредством линкера. В другом варианте изобретения вторая молекула РНК присоединена к антисмысловой цепи посредством линкера. В еще одном варианте изобретения первая и вторая молекула РНК присоединены к антисмысловой цепи посредством линкера. В еще одном варианте изобретения линкер соединяет первую и вторую молекулу РНК прерывистой цепи-пассажира, где указанный линкер не является простой межнуклеозидной связью, описанной в настоящем изобретении, такой как фосфодиэфирная связь (если линкер представляет собой простую фосфодиэфирную связь, то указанной цепью-пассажиром обычно является непрерывная цепьпассажир). Предпочтительными линкерами согласно изобретению являются одноцепочечная ДНК, одноцепочечная РНК и ПЭГ-линкер. Если первая и вторая молекулы РНК соединены одноцепочечной РНК (или другой нуклеотидной последовательностью), то образовавшийся разрыв является фактически таким разрывом, который часто называют узлом, то есть в месте этого разрыва данная цепь-пассажир содержит дополнительную нуклеотидную последовательность, которая не является комплементарной антисмысловым цепям, и которая обычно состоит по меньшей мере из одного, например, по меньшей мере из двух, или по меньшей мере из трех некомплементарных нуклеотидных оснований. Следует отметить, что включение узла может препятствовать образованию комплекса RISC, поэтому размер узла должен быть минимальным, в частности, такой узел обычно должен иметь длину менее чем 10 некомплементарных нуклеотидных оснований. В одном из вариантов изобретения в качестве линкера может быть использовано любое соединение,способное функционально связывать молекулы РНК данного РНК-комплекса. Однако обычно используемый линкер представляет собой органическую молекулу, ковалентно связанную с каждой из линкерных молекул, и не является межнуклеозидной связью, образующей остов (то есть нуклеотидными основаниями, которые образуют комплементарные гибриды с противоположной цепью и могут содержать несоответствия и выступающий 3'-конец) антисмысловой, либо первой, второй или, необязательно, других молекул РНК, образующих прерывистую цепь-пассажир. Однако в предпочтительном варианте изобретения указанный линкер не является одноцепочечной РНК. В одном из вариантов изобретения указанным линкер не является одноцепочечной молекулой ДНК. В одном из вариантов изобретения указанный линкер не содержит нуклеотидных оснований. В одном из вариантов изобретения линкеры согласно изобретению выбирают так, чтобы они не оказывали какого-либо влияния на спаривание оснований антисмысловой цепи и/или цепи-пассажира . Однако если температура плавления первой молекулы РНК слишком мала для спаривания основа- 14015563 ний, которые спариваются при определенной температуре, то для эффективного повышения температуры плавления, указанная первая молекула РНК может быть присоединена к антисмысловой цепи. Таким образом, в другом варианте изобретения линкеры выбирают так, чтобы это приводило к повышению температуры плавления по меньшей мере первой молекулы РНК. Линкеры согласно изобретению могут быть выбраны так, чтобы можно было получить сайты конъюгирования, позволяющие присоединять другие молекулы к РНК-комплексу. Такими другими молекулами могут быть, например, носители, облегчающие поглощение РНК-комплекса клеткой или организмом. Либо такими носителями могут быть молекулы, которые непосредственно влияют на включение ведущей цепи в RGPC и которые могут быть использованы, например, для гарантии того, что будет включена только антисмысловая цепь. В предпочтительном варианте изобретения цепь-пассажир РНК-комплекса содержит первую и вторую молекулу РНК, которые не являются ковалентно связанными друг с другом, а также не являются ковалентно связанными с антисмысловой цепью. Таким образом, РНК-комплекс может содержать три отдельных молекулы РНК, а именно, антисмысловую цепь, и первую и вторую молекулу РНК, которые вместе образуют прерывистую цепь-пассажир. Совершенно очевидно, что в том случае, если цепьпассажир содержит другие молекулы РНК, то РНК-комплекс может включать более чем три отдельных молекулы РНК. В одном из вариантов изобретения термин РНК, используемый в контексте настоящего описания,означает полинуклеотидную последовательность, которая при ее гибридизации с антисмысловой цепью образует комплекс, способный функционировать как киРНК и/или способный образовывать Аконформацию. В одном из вариантов изобретения молекулы РНК/цепь-пассажир/антисмысловая цепь содержат по меньшей мере 10%, например, по меньшей мере 20%, например, по меньшей мере 30%, например, по меньшей мере 40%, например, по меньшей мере 50%, например, по меньшей мере 60%, например, по меньшей мере 70%, например, по меньшей мере 80%, например, по меньшей мере 90%, или даже 100% РНК-нуклеотидов по отношению к общему числу нуклеотидных оснований в молекулах РНК/цепипассажире/антисмысловой цепи, соответственно. В другом предпочтительном варианте изобретения цепь-пассажир РНК-комплекса содержит 3 молекулы РНК, не связанные ковалентной связью. В других вариантах изобретения цепь-пассажир содержит 4, 5 и 6 молекул РНК, не связанных друг с другом ковалентной связью, а также не связанных с антисмысловой цепью. При использовании цепи-пассажира РНК-комплекса, содержащего две или более молекулы РНК,не связанных ковалентной связью, химический синтез может быть значительно облегчен по сравнению с химическими синтезом непрерывной цепи-пассажира, то есть синтез и очистку двух или более коротких молекул РНК осуществлять значительно легче, чем синтез одной более длинной молекулы РНК. Кроме того, использование двух или более молекул РНК значительно облегчает синтез, если его осуществляют путем конъюгирования с молекулами РНК. Одним из преимуществ является то, что отдельные молекулы РНК могут быть конъюгированы по отдельности, то есть для получения каждой молекулы РНК может быть использован один и тот же способ синтеза. Другим преимуществом является большее число сайтов конъюгирования. Так, например, каждый из двух 5'-концов может быть конъюгирован с конкретной группой, такой как лиганд или эффекторная молекула. Цепь-пассажир РНК-комплекса согласно изобретению может включать более чем один разрыв. В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир включает в себя 2 разрыва. В других вариантах изобретения цепь-пассажир включает в себя 3 разрыва, 4 разрыва и 5 разрывов, соответственно. Разрыв прерывистой цепи-пассажира может находиться в различных положениях. Так, например,в одном из вариантов изобретения прерывистая цепь-пассажир имеет разрыв в 3-положении, считая в направлении 5'3' от основания первого нуклеотида цепи-пассажира, спаренного с основанием антисмысловой цепи. В других вариантах изобретения разрыв находится в положении 4, положении 5, положении 6, положении 7, положении 8, положении 9, положении 10, положении 11, положении 12, положении 13, положении 14, положении 15, положении 16, положении 17, положении 18, положении 19, положении 20,положении 21, положении 22, положении 23, положении 24, положении 25 и в положении 26, соответственно. Предпочтительные разрывы могут быть выбраны из группы, состоящей из разрывов в положении 8,9, 10, 11, 12 или 13, считая от 5'-конца цепи-пассажира, а наиболее предпочтительным вариантом является один разрыв в цепи-пассажире, присутствующий в одном из указанных положений, например в положениях 9-12. Предпочтительно, чтобы 5'-концы РНК-комплекса были фосфорилированы или были доступны для фосфорилирования. Термин доступный для фосфорилирования означает, что 5'-гидроксигруппа не является блокированной, например, посредством прямого конъюгирования или другого конъюгирования с другими группами, расположенными рядом с 5'-гидроксигруппой, которые предотвращают фосфорили- 15015563 рование 5'-гидроксигруппы. Следовательно, в предпочтительном варианте изобретения первая молекула РНК включает в себя 5'-фосфатную группу и 3'-гидроксигруппу. В другом варианте изобретения вторая молекула РНК включает в себя 5'-концевую фосфатную группу и 3'-гидроксигруппу. В еще одном варианте изобретения антисмысловая цепь включает в себя 5'-концевую фосфатную группу и 3'-гидроксигруппу. В предпочтительном варианте изобретения молекулы РНК, образующие прерывистую цепьпассажир, например, первая молекула РНК, вторая молекула РНК и/или другие молекулы РНК, обладают способностью гибридизоваться с антисмысловой цепью с образованием дуплекса, имеющего Tm,составляющую по меньшей мере 37 С, например, по меньшей мере 40 С, по меньшей мере 50 С, по меньшей мере 55 С или по меньшей мере 60 С. В одном из аспектов изобретения Tm составляет 3780 С, например, 50-70 С. Измерение Tm 3 мкМ раствор данного соединения в 10 мМ фосфата натрия/100 мМ NaCl/0,1 нМ EDTA, рН 7,0,смешивают с его комплементарным ДНК- или РНК-олигонуклеотидом (предпочтительно, РНК) при концентрации 3 мкМ в 10 мМ фосфата натрия/100 мМ NaCl/0,1 нМ EDTA, рН 7,0, при 90 С в течение одной минуты и оставляют для охлаждения до комнатной температуры. Затем строят кривую плавления дуплекса путем измерения оптической плотности при 260 нм при скорости нагревания 1 С/мин в пределах от 25 до 95 С. Tm определяют как максимум первой производной функции, соответствующей данной кривой плавления. В контексте настоящего изобретения термин комплементарный относится к способности двух нуклеотидных последовательностей точно спариваться друг с другом. Так, например, если нуклеотид в определенном положении олигонуклеотида способен образовывать водородную связь с нуклеотидом в соответствующем положении молекулы ДНК или РНК, то считается, что такой олигонуклеотид и ДНК или РНК являются комплементарными друг другу в этом положении. Считается, что ДНК или РНК и олигонуклеотид комплементарны друг другу, если достаточное число нуклеотидов в данном олигонуклеотиде могут образовывать водородные связи с соответствующими нуклеотидами в ДНК- или РНКмишени, и тем самым образовывать стабильный комплекс. При этом для сообщения стабильности последовательности in vitro или in vivo эти последовательности необязательно должны быть на 100% комплементарны их нуклеиновой кислоте-мишени, то есть они могут содержать один или несколько нуклеотидов или нуклеотидных аналогов, которые не спариваются с соответствующим нуклеотидом в ДНК- или РНК-мишени, и такие последовательности называются здесь последовательностями с несоответствиями. Так, например, термины комплементарный и гибридизующийся означают, что соединение согласно изобретению достаточно сильно и специфически связывается с молекулой-мишенью, что обеспечивает необходимое подавление нормальной функции данной(ых) мишени(ей). В соответствии с этим указанная последовательность может содержать одно несоответствие или два несоответствия. Однако в одном из вариантов изобретения помимо того, что прерывистая цепь-пассажир и антисмысловая цепь РНК-комплекса согласно изобретению могут иметь выступающие 3'-концы, они могут быть комплементарными без каких-либо несоответствий. В одном из вариантов изобретения термин комплементарный означает 100% комплементарность по всей области дуплекса (то есть за исключением выступающих 3'концов). В некоторых вариантах изобретения РНК-комплекс предпочтительно содержит один или несколько нуклеотидных аналогов. Использование нуклеотидных аналогов может оказаться предпочтительным по нескольким причинам. Они могут быть, например, использованы для повышения температуры плавления коровой двухцепочечной области. Если первая и/или вторая молекулы РНК являются короткими, то они могут иметь температуру плавления, при которой не обеспечивается стабильное спаривание оснований. В этом случае для повышения температуры плавления могут быть использованы нуклеотидные аналоги, такие какLNA. Нуклеотидные аналоги могут быть также использованы для снижения температуры плавления коровой двухцепочечной области. Для этих целей могут быть использованы неосновные нуклеотиды. Кроме того, нуклеотидные аналоги могут быть использованы с учетом стоимости проведения такого синтеза или его трудоемкости. В соответствии с этим в предпочтительном варианте изобретения антисмысловая цепь содержит нуклеотидные аналоги. В другом предпочтительном варианте изобретения прерывистая цепь-пассажир содержит нуклеотидные аналоги. В еще одном предпочтительном варианте изобретения первая и вторая молекулы РНК цепипассажира содержат нуклеотидные аналоги. В одном из вариантов изобретения число нуклеотидных аналогов в антисмысловой цепи составляет 10. В других вариантах изобретения число нуклеотидных аналогов в антисмысловой цепи составляет 9,- 16015563 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1, соответственно. В другом варианте изобретения все нуклеотиды антисмысловой цепи представляют собой нуклеотидные аналоги. В одном из вариантов изобретения число нуклеотидных аналогов в антисмысловой цепи составляет 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 или 11. В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь содержит от 0 до 10, например от 1 до 8, а именно, от 2 или 3 до 8 нуклеотидных аналогов. Аналогичным образом, в другом варианте изобретения число нуклеотидных аналогов в цепипассажире составляет 10. В других вариантах изобретения число нуклеотидных аналогов в цепипассажире составляет 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1, соответственно. В другом варианте изобретения все нуклеотиды цепи-пассажира представляют собой нуклеотидные аналоги. В одном из вариантов изобретения число нуклеотидных аналогов в цепи-пассажире составляет 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 или 11. В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир содержит от 0 до 10, например, от 1 до 8, а именно, от 2 или 3 до 8 нуклеотидных аналогов. В предпочтительном варианте изобретения антисмысловая цепь и цепь-пассажир содержат нуклеотидные аналоги. В одном из вариантов изобретения нуклеотидные аналоги РНК-комплекса являются идентичными,то есть все они, например, представляют собой LNA. В другом варианте изобретения в одном и том же РНК-комплексе присутствуют различные нуклеотидные аналоги. В одном из вариантов изобретения нуклеотидные аналоги цепи-пассажира являются идентичными, то есть все они, например, представляют собой LNA. В другом варианте изобретения в одной и той же цепи-пассажире присутствуют различные нуклеотидные аналоги. В одном из вариантов изобретения нуклеотидные аналоги антисмысловой цепи являются идентичными, то есть все они, например, представляют собой LNA. В другом варианте изобретения в одной и той же антисмысловой цепи присутствуют различные нуклеотидные аналоги. В одном из вариантов изобретения первая молекула РНК цепи-пассажира содержит один или несколько нуклеотидных аналогов. В одном из вариантов изобретения первая молекула РНК цепи-пассажира содержит по меньшей мере 2 нуклеотидных аналога. В одном из вариантов изобретения вторая молекула РНК цепи-пассажира содержит один или несколько нуклеотидных аналогов. В одном из вариантов изобретения вторая молекула РНК цепи-пассажира содержит по меньшей мере 2 нуклеотидных аналога. В одном из вариантов изобретения нуклеотидный аналог присутствует в области из трех концевых(5' или 3', соответственно) нуклеотидных остатков первой и/или второй молекулы РНК, например, в положении 1, 2 или 3 соответствующих концевых нуклеотидных остатков. В одном из вариантов изобретения по меньшей мере одна из других РНК-молекул цепипассажира содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог. В одном из вариантов изобретения каждая другая молекула РНК, образующая часть прерывистой цепи-пассажира, содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог. В одном из вариантов изобретения прерывистая цепь-пассажир содержит нуклеотидный аналог в положениях 10 и 12 от 5'-конца цепи-пассажира. В одном из вариантов изобретения каждая молекула РНК, образующая часть прерывистой цепипассажира, содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог. В одном из вариантов изобретения температура плавления (Tm) для первой, второй и, необязательно, других молекул РНК, образующих прерывистую цепь-пассажир, составляет по меньшей мере 40 С. В одном из вариантов изобретения длина первой, второй и, необязательно, других молекул РНК,образующих прерывистую цепь-пассажир, составляет по меньшей мере три нуклеотидных остатка. В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь содержит по меньшей мере 1 нуклеотидный аналог. В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь содержит по меньшей мере 1 нуклеотидный аналог в области дуплекса, образованной прерывистой цепью-пассажиром. В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь содержит по меньшей мере один нуклеотидный аналог в положении, которое находится в пределах области 4 нуклеотидных оснований, считая от 3'-конца антисмысловой цепи, например, в положении 1, 2, 3 и/или 4 от 3'-конца антисмысловой цепи. В одном из вариантов изобретения по меньшей мере один из нуклеотидов, присутствующих в 5'концевой области из 9 нуклеотидных остатков антисмысловой цепи, представляет собой нуклеотидный аналог.- 17015563 В одном из вариантов изобретения по меньшей мере один из нуклеотидов, присутствующих в области, соответствующей положениям 4-10 нуклеотидов, считая от 3'-конца антисмысловой цепи, состоящей из 10 нуклеотидов, представляет собой нуклеотидный аналог. В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь содержит нуклеотидный аналог в положении 11 от 5'-конца антисмысловой цепи. В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь содержит РНК-нуклеотиды в положениях 10 и 12 от 5'-конца антисмысловой цепи. В одном из вариантов изобретения 5'-концевые нуклеотидные остатки антисмысловой цепи представляют собой остатки РНК-нуклеотидов. В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь содержит по меньшей мере 2 нуклеотидных аналога. В одном из вариантов изобретения нуклеотидные аналоги позволяют образовывать Аконформацию (или, в одном из вариантов изобретения, А/В-конформацию, то есть промежуточную форму между А- и В-конформациями), если они присутствуют в дуплексе, содержащем комплементарную молекулу РНК, состоящую только из РНК-остатков, связанных фосфатными связями. В одном из вариантов изобретения нуклеотидные аналоги, присутствующие в антисмысловой цепи и/или в цепи-пассажире, независимо выбраны из группы, состоящей из 2'-О-алкил-РНК-мономеров (таких как 2'-ОМЕ), 2'-амино-ДНК-мономеров, 2'-фтор-ДНК-мономеров, мономеров арабино-нуклеиновой кислоты (ANA), 2'-фтор-ANA-мономеров, LNA-мономеров, INA-мономеров. В одном из вариантов изобретения нуклеотидные аналоги, присутствующие в прерывистой цепипассажире (или в антисмысловой цепи или в обеих цепях, либо в виде отдельных молекул, либо в виде комбинаций всех нуклеотидных аналогов в РНК-комплексе), представляют собой по меньшей мере один из вышеуказанных нуклеотидных аналогов (взятые отдельно, например, только 2'ОМЕ, или в комбинации друг с другом, например, выбранные, как описано выше), например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидных мономеров. Предпочтительными нуклеотидными мономерами, помимо LNA, являются 2'-О-алкил-РНКмономеры (такие как 2'-ОМЕ) и 2'-фтор-ДНК-мономеры . В одном из вариантов изобретения число нуклеотидных аналогов, присутствующих в антисмысловой цепи или в цепи-пассажире (или в обеих цепях, либо в виде отдельных молекул, либо в виде комбинации всех нуклеотидных аналогов в РНК-комплексе), выбрано из группы, состоящей по меньшей мере из одного по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24 и по меньшей мере 25 нуклеотидных аналогов. В соответствии с этим, число нуклеотидных аналогов может составлять менее чем 20, например, менее чем 18, менее чем 16, менее чем 14, менее чем 12, менее чем 10. В одном из вариантов изобретения нуклеотидные аналоги, присутствующие в прерывистой цепипассажире (или в антисмысловой цепи или в обеих цепях, либо в виде отдельных молекул, либо в виде комбинаций всех нуклеотидных аналогов в РНК-комплексе), представляют собой по меньшей мере один 2'-O-алкил-РНК-мономер (такой как 2'ОМе), например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 2'-О-алкил-РНК-мономеров (таких как 2'ОМе). В одном из вариантов изобретения, которые могут быть одинаковыми или различными, нуклеотидные аналоги, присутствующие в прерывистой цепи-пассажире (или в антисмысловой цепи или в обеих цепях, либо в виде отдельных молекул, либо в виде комбинаций всех нуклеотидных аналогов в РНКкомплексе), представляют собой по меньшей мере один 2'-фтор-ДНК-мономер, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 2'-фтор-ДНК-мономеров. В одном из вариантов изобретения нуклеотидные аналоги, присутствующие в прерывистой цепипассажире, представляют собой по меньшей мере один остаток блокированной нуклеиновой кислоты(LNA). В одном из вариантов изобретения, которые могут быть одинаковыми или различными, нуклеотидные аналоги, присутствующие в прерывистой цепи-пассажире (или в антисмысловой цепи или в обеих цепях, либо в виде отдельных молекул, либо в виде комбинаций всех нуклеотидных аналогов в РНКкомплексе), представляют собой по меньшей мере один LNA-мономер, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 LNA-мономеров. В одном из вариантов изобретения остаток или остатки LNA независимо выбраны из группы, состоящей из окси-LNA, тио-LNA и амино-LNA, в D и Lконфигурациях или их комбинациях. В одном из вариантов изобретения нуклеотидные аналоги, присутствующие в антисмысловой цепи,представляют собой по меньшей мере один остаток блокированной нуклеиновой кислоты (LNA), например, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6,по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по- 18015563 меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16,по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 остатков LNA. В соответствии с этим, число остатков LNA может составлять менее чем 20, например, менее чем 18, менее чем 16, менее чем 14, менее чем 12, менее чем 10. В одном из вариантов изобретения все нуклеотидные аналоги, присутствующие в антисмысловой цепи, представляют собой остатки блокированной нуклеиновой кислоты (LNA). В предпочтительном варианте изобретения антисмысловая цепь содержит лишь небольшое число остатков нуклеотидных аналогов, таких как остатки LNA. Обычно, предпочтительно, чтобы нуклеотидные остатки, присутствующие в антисмысловой цепи, находились в 3'-половине антисмысловой цепи,например, в положениях 1-9 антисмысловой цепи, а именно, в положениях 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 антисмысловой цепи, например, в области из трех выступающих концов, или в первых 3, например, в первом,втором или третьем положениях нуклеотидов дуплекса, считая от 3'-конца антисмысловой цепи. В одном из вариантов изобретения нуклеотидные аналоги, присутствующие в цепи-пассажире(или в антисмысловой цепи или в обеих цепях, либо в виде отдельных молекул, либо в виде комбинации всех нуклеотидных аналогов в РНК-комплексе), представляют собой по меньшей мере один остаток блокированной нуклеиновой кислоты (LNA), например, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 остатков LNA. В соответствии с этим, число остатков LNA может составлять менее чем 20, например, менее чем 18, менее чем 16, менее чем 14, менее чем 12, менее чем 10. В одном из вариантов изобретения все нуклеотидные аналоги, присутствующие в цепипассажире, представляют собой остатки блокированной нуклеиновой кислоты (LNA). В одном из вариантов изобретения по меньшей мере один из нуклеотидных аналогов, присутствующих в прерывистой цепи-пассажире, образует пару оснований с комплементарным нуклеотидным аналогом, присутствующим в антисмысловой цепи. В одном из вариантов изобретения все нуклеотидные аналоги, присутствующие в прерывистой цепи-пассажире, образуют пары оснований с комплементарными нуклеотидными аналогами, присутствующими в антисмысловой цепи и не являющимися нуклеотидными аналогами выступающего 3'-конца(если он имеется). В одном из вариантов изобретения все нуклеотидные аналоги, присутствующие в антисмысловой цепи, образуют пары оснований с комплементарными нуклеотидными аналогами, присутствующими в прерывистой цепи-пассажире и не являющимися нуклеотидными аналогами выступающего 3'-конца(если он имеется). В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир состоит из молекул РНК длиной 9-11 нуклеотидов (нуклеотидных оснований) или содержит такие молекулы РНК, например, молекулу РНК из 10 нуклеотидов, включающую 1-5 нуклеотидных аналогов, таких как остатки LNA, например, два остаткаLNA, и молекулу РНК из 11-13 нуклеотидов, например, молекулу РНК из 12 нуклеотидов, содержащую 1-5 остатков нуклеотидных аналогов, таких как остатки LNA, а именно, три остатка LNA. В одном из вариантов изобретения по меньшей мере один из трех 3'-концевых нуклеотидов второй молекулы РНК цепей-пассажиров представляет собой нуклеотидный аналог, такой как LNA. В таком варианте изобретения 3'-концевые нуклеотиды второй молекулы РНК цепи-пассажира могут включать один из нижеследующих мотивов нуклеотидных оснований, а именно: Ххх-3', ХХх-3', хХх-3', ххХ-3',ХХХ-3', где х означает РНК-мономер, а X означает остаток нуклеотидного аналога, такой как остатокLNA. В этом варианте изобретения вторая молекула РНК цепей-пассажиров может содержать один или несколько других мономеров нуклеотидных аналогов, например, один или несколько других LNAмономеров в определенных положениях, таких как положения 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13, считая от 3'-конца второй молекулы РНК. В одном из вариантов изобретения вторая молекула РНК цепипассажира содержит 3, 4 или 5 остатков нуклеотидных аналогов, таких как остатки LNA-мономеров. В одном из вариантов изобретения по меньшей мере один из трех 3'-концевых нуклеотидов второй молекулы РНК цепей-пассажиров представляет собой нуклеотидный аналог, такой как LNA. В таком варианте изобретения 3'-концевые нуклеотиды второй молекулы РНК цепи-пассажира могут включать один из нижеследующих мотивов нуклеотидных оснований, а именно: Ххх-3', ХХх-3', хХх-3', ххХ-3',ХХХ-3', где х означает РНК-мономер, а X означает остаток нуклеотидного аналога, такой как остатокLNA. В этом варианте изобретения вторая молекула РНК цепей-пассажиров может содержать один или несколько других мономеров нуклеотидных аналогов, например, один или несколько других LNAмономеров в определенных положениях, таких как положения 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13, считая от 3'-конца второй молекулы РНК. В одном из вариантов изобретения вторая молекула РНК цепипассажира содержит 3, 4 или 5 остатков нуклеотидных аналогов, таких как остатки LNA-мономеров. В одном из вариантов изобретения по меньшей мере один из трех 5'-концевых нуклеотидов первой молекулы РНК цепей-пассажиров является нуклеотидным аналогом, таким как LNA. В таком варианте- 19015563 изобретения 5'-концевые нуклеотиды первой молекулы РНК цепи-пассажира могут включать один из нижеследующих мотивов нуклеотидных оснований, а именно: Ххх-5', ХХх-5', хХх-5', ххХ-5', ХХХ-5', где х означает РНК-мономер, а X означает остаток нуклеотидного аналога, такой как остаток LNA. В этом варианте изобретения первая молекула РНК цепей-пассажиров может содержать один или несколько других мономеров нуклеотидных аналогов, например, один или несколько других LNA-мономеров в определенных положениях, таких как положения 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13, считая от 5'-конца первой молекулы РНК. В одном из вариантов изобретения первая молекула РНК цепи-пассажира содержит 3,4 или 5 остатков нуклеотидных аналогов, таких как остатки LNA-мономеров. В соответствии с этим цепь-пассажир может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидных аналогов, таких как LNA-мономер в положении от 5'конца, выбранном из группы, состоящей из положения 1, положения 2, положения 3, положения 4, положения 5, положения 6, положения 7, положения 8, положения 9, положения 10, положения 11, положения 12, положения 13, положения 14, положения 15, положения 16, положения 17, положения 18, положения 19, положения 20, положения 21, положения 22, положения 23 или положения 24. В одном из вариантов изобретения вторая молекула РНК прерывистой цепи-пассажира содержит один или несколько 2'-адамантил-амино- и/или 2'-пирен-LNA-остатков. На фиг. 20 показано, что введение LNA в первую и вторую молекулы РНК прерывистой цепипассажира РНК-комплекса согласно изобретению обеспечивает высокоэффективный сайленсинг РНКмишени по сравнению с эквивалентной РНК-молекулой, в которой цепь-пассажир содержит только РНК-остатки. Действительно, наличие комбинации нуклеотидных аналогов, таких как LNA, вводимых в цепь-пассажир, и разрывов в цепи-пассажире позволяет получить высокоэффективный и стабильный комплекс сайленсинга РНК, который может быть использован в терапии (см. фиг. 20). В соответствии с этим нуклеотидные аналоги, присутствующие в цепи-пассажире, могут представлять собой 2'-модифицированные нуклеотиды (РНК или ДНК), такие как 2'-галогензамещенные остатки РНК или ДНК (такие как 2'-F-ДНК) или 2'-О-Ме-РНК (см. фиг. 21). На фиг. 22 показано, что после введения прерывистой цепи-пассажира, такой как прерывистые цепи-пассажиры согласно изобретению, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что цепьпассажир может быть толерантной к большему числу модифицированных или функционализированных нуклеотидных аналогов, таких как LNA или функционализированная LNA. В других вариантах изобретения вторая молекула РНК прерывистой цепи-пассажира имеет последовательность (5'-3'), выбранную из группы, состоящей из последовательностей: ххХхХххххХХх,хххХххххХХх, где х означает РНК-мономер, а X означает остаток нуклеотидного аналога, такой как остаток LNA. В других вариантах изобретения, которые могут быть такими же, как вышеуказанные варианты или отличаться от вышеуказанных вариантов, первая молекула РНК прерывистой цепи-пассажира имеет последовательность (5'-3'), выбранную из группы, состоящей из последовательности ххХхххххХх, где х означает РНК-мономер, а X означает остаток нуклеотидного аналога, такой как остаток LNA. Использование антисмысловой цепи, содержащей нуклеотидные аналоги, такие как LNA, может значительно снижать или даже подавлять способность комплекса РНК-сайленсинга осуществлять сайленсинг. Такая чувствительность антисмысловой цепи к нуклеотидной модификации (к введению аналогов) затрудняет разработку терапевтических средств на основе киРНК, поскольку введение нуклеотидных аналогов, очевидно, необходимое для in vivo стабильности, может в значительной степени блокировать терапевтическую активность молекулы, в частности, в дозе, способствующей стабилизации нуклеотидных аналогов, необходимых для достаточной стабильности in vivo. После введения прерывистой цепи-пассажира, таких как прерывистые цепи-пассажиры согласно изобретению, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что антисмысловая цепь может быть толерантной к значительно более высоким дозам нуклеотидных аналогов, таких как LNA (см. фиг. 23, 24 и 25), и других нуклеотидных аналогов, таких как 2'-F-ДHK или 2'-О-Me-РНК. Такое преимущество очевидно даже в том случае, если антисмысловая цепь имеет нуклеотидные аналоги в области, расположенной выше трех 3'-концевых нуклеотидных остатков антисмысловой цепи (обычно в области, по меньшей мере, чувствительной к нуклеотидным модификациям). Действительно, как показано на фиг. 24, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что антисмысловая цепь, содержащая только нуклеотидные аналоги, такие как 2'F-ДНК или 2'-О-Ме-РНК, могут при спаривании с прерывистой цепью-пассажиром еще сохранять достаточный уровень сайленсинга мишени. В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь содержит по меньшей мере 1 нуклеотидный аналог, расположенный за пределами трех 3'-концевых нуклеотидных остатков антисмысловой цепи. В одном из вариантов изобретения все нуклеотидные основания антисмысловой цепи представляют собой нуклеотидные аналоги, такие как нуклеотидные аналоги, в которых 2'-замещениями являются 2'-FДHK или 2'-О-Ме-РНК. В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь может содержать один из нижеследующих нуклеотидных мотивов: 5'-Ххх, 5'-ХХх, 5'-хХх, 5'-ххХ, 5'-XXX, где х означает РНК-мономер, а X означа- 20015563 ет остаток нуклеотидного аналога, такой как остаток LNA. В соответствии с этим, антисмысловая цепь может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидных аналогов, таких как LNA-мономер в положениях от 5'-конца, выбранных из группы, состоящей из положения 1, положения 2, положения 3, положения 4,положения 5, положения 6, положения 7, положения 8, положения 9, положения 11, положения 13, положения 14, положения 15, положения 16, положения 17, положения 18, положения 19, положения 20,положения 21, положения 22, положения 23 или положения 24. Антисмысловая цепь может содержать нуклеотидные аналоги с выступающим 3'-концом, присутствующие, например, в положениях 1, 2, 3 от 3'конца, и/или в дуплексе с цепью-пассажиром. В одном из вариантов изобретения 5'-концевой мономер антисмысловой цепи представляет собой РНК-нуклеотид. Цепь-пассажир может содержать нуклеотидные аналоги с выступающим 3'-концом, присутствующие, например, в положениях 1, 2, 3 от 3'-конца,и/или в дуплексе с антисмысловой цепью. В одном из вариантов изобретения, которые могут быть одинаковыми или различными, антисмысловая цепь содержит по меньшей мере три нуклеотидных аналога, таких как LNA-остатки. При этом предпочтительно по меньшей мере один из остатков нуклеотидного аналога находится за пределами трех 3'-концевых нуклеотидных мономеров антисмысловой цепи, например, по меньшей мере два остатка нуклеотидного аналога находятся за пределами трех 3'-концевых нуклеотидных мономеров антисмысловой цепи, например, по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 остатка нуклеотидного аналога находятся за пределами трех 3'-концевых нуклеотидных мономеров антисмысловой цепи, например, 1-10 остатков нуклеотидного аналога находятся за пределами трех 3'концевых нуклеотидных мономеров антисмысловой цепи. В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь содержит 3-10 остатков нуклеотидного аналога, таких как LNA-мономеры, например, 4-6 мономеров нуклеотидного аналога. В предпочтительном варианте изобретения антисмысловая цепь содержит один или несколько остатков нуклеотидного аналога, таких как LNA, в той области антисмысловой цепи, которая образует комплементарный дуплекс с цепью-пассажиром. В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь может содержать нуклеотидный мотив 5'ххХххХ. В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь может содержать один из следующих нуклеотидных мотивов: 5'-Ххх, 5'-ХХх, 5'-хХх, 5'-ххХ, 5'-XXX, где х представляет собой РНК-мономер, а X представляет собой остаток нуклеотидного аналога, такой как LNA-остаток. В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь может содержать один из следующих нуклеотидных мотивов: 5'-ххххХ, 5'-хххХх, 5'-ххХхх, 5'-хХххх, 5'-Ххххх, 5'-хххХХ, 5'-ххХХх, 5'-хХХхх, 5'ХХххх, 5'-ххХХХ, 5'-хХХХх, 5'-ХХХхх, 5'-хХХХХ, 5'-ХХХХх, 5'-ХхххХ, 5'-ХххХх, 5'-ХхХхх, 5'-ХХххх,5'-ХХххХ, 5'-ХххХХ, 5'-ХхХхХ, 5'-ХХхХХ, 5'-ХХХХХ, где х представляет собой РНК-мономер, а X представляет собой остаток нуклеотидного аналога, такой как LNA-остаток. В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь может содержать последовательность: 5'ххХххХххххХххХхххххХХх 3', где х представляет собой РНК-мономер, а X представляет собой остаток нуклеотидного аналога, такой как LNA-остаток. В одном из вариантов изобретения по меньшей мере один из трех 3'-концевых нуклеотидных оснований второй молекулы РНК цепей-пассажиров представляет собой нуклеотидный аналог, такой какLNA. В этом варианте изобретения 3'-концевые нуклеотидные основания второй молекулы РНК цепипассажира могут содержать один из следующих нуклеотидных мотивов: Ххх-3', ХХх-3', хХх-3', ххХ-3',ХХХ-3', где х представляет собой РНК-мономер, а X представляет собой остаток нуклеотидного аналога,такой как LNA-остаток. В этом варианте изобретения вторая молекула РНК цепей-пассажиров может содержать дополнительные остатки нуклеотидного аналога, такие как LNA-остатки. Блокированная нуклеиновая кислота (LNA), используемая в РНК-комплексе согласно изобретению имеет структуру общей формулы где X и Y независимо выбраны из группы, состоящей из -O-, -S-, -N(H)-, N(R)-, -СН 2- или -СН- (если он является часть двойной связи), -СН 2-О-, -CH2-S-, -CH2-N(H)-, -CH2-N(R)-, -CH2-CH2- или -СН 2-СН(если он является часть двойной связи), -СН=СН-, где R выбран из водорода и С 1-4 алкила; Z и Z независимо выбраны из группы, состоящей из межнуклеотидной связи, концевой группы или защитной группы; В представляет собой природное или неприродное нуклеотидное основание; а асимметрические группы могут находиться в любой ориентации. Фосфортиоатные связи могут оказаться предпочтительными. Однако молекулы, образующие РНК- 21015563 комплекс могут содержать и другие связи или различные смешанные связи, например фосфатные и фосфортиоатные связи, либо только фосфатные или другие описанные здесь связи. Термин тио-LNA включает в себя блокированное нуклеотидное основание, где по меньшей мере один из X или Y на схеме 1 выбран из S или -CH2-S-. Остаток тио-LNA может присутствовать в бета-D- и альфа-L-конфигурации. Термин амино-LNA включает в себя блокированное нуклеотидное основание, где по меньшей мере один из X или Y на схеме 1 представляет собой -N(H)-, N(R)-, CH2-N(H)-, -CH2-N(R)-, где R выбран из водорода и C1-4-алкила. Остаток амино-LNA может присутствовать в бета-D- и альфа-L-конфигурации. Термин окси-LNA включает в себя блокированное нуклеотидное основание, где по меньшей мере один из X или Y на схеме 1 представляет собой О- или -СН 2-О-. Остаток окси-LNA может присутствовать в бета-D- и альфа-L-конфигурации. Термин ена-LNA включает в себя блокированное нуклеотидное основание, где Y на схеме 1 представляет собой -СН 2-О- (где атом кислорода в -СН 2-О- присоединен во 2-положении по отношению к нуклеотидному основанию В). Термин альфа-L-LNA включает в себя блокированный нуклеотид, представленный на схеме 2(структура справа). Термин LNA-производные" включает в себя все блокированные нуклеотиды на схеме 1, а также бета-D-метилен-LNA, например, тио-LNA, амино-LNA, альфа-L-окси-LNA и ена-LNA, за исключением бета-D-окси-LNA. Термин блокированный нуклеотид означает блокированное нуклеотидное основание и не употребляется в таком же смысле, как термин нуклеотид, определенный в настоящей заявке. На схеме 1 4 хиральных центра показаны в определенной конфигурации. Однако конфигурации на схеме 1 необязательно должны быть фиксированными. В настоящем изобретении также рассматриваются соединения общей схемы 1, в которых хиральные центры имеют различные конфигурации, такие как конфигурации, представленные на схеме 2. А поэтому представленная для иллюстрации схема 1 не должна рассматриваться как ограничение конфигурации хиральных центров. Каждый хиральный центр на схеме 1 может присутствовать либо в R-, либо в S-конфигурации. Определение конфигурации R (правовращающая) и S (левовращающая) описаны в ИЮПАК (IUPAC 1974 Recommendations, Section E, Fundamental Stereochemistry: The rules can be found in Pure Appl. Chem. 45, 13-30, (1976) и в "Nomenclature ofZ и Z независимо выбраны из межнуклеозидной связи, концевой группы или защитной группы. Межнуклеозидная связь может быть выбрана из группы, состоящей из -O-Р(O)2-O-, -O-Р(О,S)-O-,-O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, ОРО(ОСН 3)-O-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-,-NRH-P(О)2-O-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-, и/или межнуклеозидная связь может быть выбрана из группы,состоящей из -O-CO-O-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CO-NRH-CH2-,-CH2-NRH-CO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRH-, -O-CH2CH2-NRH-CO-, -CH2-NCH3-O-CH2-, где RH выбран из водорода и С 1-4-алкила. Концевые группы независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, азидо, галогена, циано, нитро, гидрокси, Prot-O-, Act-O-, -меркапто, Prot-S-, Act-S-, C1-6-алкилтио, амино, Prot-N(RH)-, Act-N(RH)-, моноили ди(C1-6-алкил)амино, необязательно замещенного C1-6-алкокси, необязательно замещенного C1-6-алкила,необязательно замещенного С 2-6-алкенила, необязательно замещенного С 2-6-алкенилокси, необязательно замещенного С 2-6-алкинила, необязательно замещенного С 2-6-алкинилокси, монофосфата, монотиофосфата, дифосфата, дитиофосфата, трифосфата, тритиофосфата, ДНК-интеркалирующих агентов, фотохимически активных групп, термохимически активных групп, хелатообразующих групп, репортерных групп, лигандов,карбокси, сульфоно, гидроксиметила, Prot-O-CH2-, Act-O-CH2-, аминометила, Prot-N(RH)-CH2-, Act-N (RH)CH2-, карбоксиметила, сульфонометила, где Prot представляет собой защитную группу для -ОН, -SH и-NH(RH), соответственно, Act представляет собой активирующую группу для -ОН, -SH и -NH(RH), соответственно, a RH выбран из водорода и C1-6-алкила. Защитными группами гидроксизаместителей являются замещенный тритил, такой как 4,4'диметокситритилокси (DMT), 4-монометокситритилокси (ММТ); тритилокси, необязательно замещенный 9-(9-фенил)ксантенилокси (пиксил), необязательно замещенный метокситетрагидропиранилокси(mthp); силилокси, такой как триметилсилилокси (TMS), триизопропилсилилокси (TIPS), третбутилдиметилсилилокси (TBDMS), триэтилсилилокси и фенилдиметилсилилокси; трет-бутиловые эфиры; ацетали (включающие две гидроксигруппы); ацилокси, такие как ацетил или замещенные галогеном ацетилы, например хлорацетилокси или фторацетилокси, изобутирилокси, пивалоилокси, бензоилокси и замещенные бензоилы, метоксиметилокси (MOM), бензиловые эфиры или замещенные бензиловые эфиры, такие как 2,6-дихлорбензилокси (2, 6-Cl2Bzl). Альтернативно, если Z или Z представляют собой гидроксил, то они могут быть защищены путем присоединения к твердому носителю необязательно посредством линкера. В вышеуказанном примере Act означает активирующую группу для -ОН, -SH и -NH(RH), соответст- 22015563 венно. Такими активирующими группами являются, например, группы, выбранные из необязательно замещенного О-фосфорамидита, необязательно замещенного O-фосфортриэфира, необязательно замещенного О-фосфордиэфира, необязательно замещенного Н-фосфоната и необязательно замещенного Офосфоната. В контексте настоящего изобретения термин фосфорамидит означает группу формулы -Р(ORx)yN(R )2, где Rx означает необязательно замещенную алкильную группу, например метил, 2-цианоэтил или бензил, а каждый из Ry означает необязательно замещенные алкильные группы, например этил или изопропил, либо группа -N(Ry)2 образует морфолиногруппу (-N(СН 2 СН 2)2O-). Rx предпочтительно означает 2-цианоэтил, а два Ry являются, предпочтительно идентичными и представляют изопропил. Так, например, особенно подходящим фосфорамидитом является N,N-диизопропил-O-(2-цианоэтил)фосфорамидит. В представляет собой природное или неприродное нуклеотидное основание, выбранное из аденина,цитозина, 5-метилцитозина, изоцитозина, псевдоизоцитозина, гуанина, тимина, урацила, 5-бромурацила,5-пропинилурацила, 5-пропинил-6-фторурацила, 5-метилтиазолурацила, 6-аминопурина, 2-аминопурина,инозина, диаминопурина, 7-пропин-7-деазааденина, 7-пропин-7-деазагуанина и 2-хлор-6-аминопурина. В некоторых вариантах изобретения блокированная нуклеиновая кислота (LNA), используемая в олигомерном соединении согласно изобретению, содержит нуклеотидные основания, которые представляют собой модифицированные нуклеотидные основания, выбранные из группы, состоящей из 5 метилцитозина, изоцитозина, псевдоизоцитозина, 5-бромурацила, 5-пропинилурацила, 6-аминопурина, 2 аминопурина, инозина, диаминопурина и 2-хлор-6-аминопурина. При этом предпочтительно, чтобы блокированная нуклеиновая кислота (LNA), используемая в олигомерном соединении, таком как антисмысловой олигонуклеотид согласно изобретению, содержала по меньшей мере один нуклеотид, включающий остаток блокированной нуклеиновой кислоты (LNA), соответствующий любой из следующих формул: Схема 2 где Y представляет собой -O-, -S-, -NH- или -N(RH); Z и Z независимо выбраны из группы, состоящей из межнуклеозидной связи, концевой группы или защитной группы; а В представляет собой природное или неприродное нуклеотидное основание.LNA-мономеры и их получение описаны в заявке WO 99/14226 и в более поздних заявках, WO 00/56746, W0 00/56748, WO 00/66604, WO 00/125248, WO 02/28875, WO 2002/094250 и в WO 2003/006475. Конкретным примером тимидинового LNA-мономера является (1S,3R,4R,7S)-7-гидрокси-1 гидроксиметил-5-метил-3-(тимин-1-ил)-2,5-диоксабицикло[2:2:1]гептан. Особенно предпочтительные LNA-остатки показаны на схеме 3, где В и Z и Z являются такими,как они были определены ранее, a RH выбран из водорода и С 1-4 алкила. В одном из вариантов изобретения нуклеотидным аналогом является пирен-2'-амино-LNA-мономеp или адамантил-2'-амино-LNA-мономер. Могут быть также использованы LNA-мономеры (например, альфа-L-LNA, тио-LNA, амино-LNA,ENA и другие нуклеотидные аналоги), которые не нарушают А-конфигурацию квсиРНК-комплекса или которые фактически обеспечивают сохранение А-конфигурации. В одном из вариантов изобретения может быть использована нуклеиновая кислота HNA-гексит, например, либо в виде отдельного нуклеотидного аналога, либо в комбинации с LNA нуклеотидами. В предпочтительном варианте изобретения РНК-комплекс включает в себя фосфоротиоатные связи. Предпочтительными нуклеотидными аналогами согласно изобретению являются нуклеотидные аналоги, выбранные из группы, состоящей из 2'-О-алкил-РНК-мономеров, 2'-амино-ДНК-мономеров, 2'фтор-ДНК мономеров, LNA-мономеров и INA-мономеров. В одном из вариантов изобретения цепь-пассажир, такая как первая и/или вторая молекулы РНК,содержит один или несколько LNA-мономеров (нуклеотидных аналогов). В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь содержит один или несколько LNAмономеров (нуклеотидных аналогов). В одном из вариантов изобретения РНК-комплекс согласно изобретению оказывает значительно меньшее побочное действие по сравнению с нативными РНК-комплексами, содержащими непрерывную цепь-пассажир, как уже указывалось ранее в данном описании. В другом варианте изобретения РНК-комплекс согласно изобретению продуцирует более низкий уровень иммунного ответа по сравнению с нативными РНК-комплексами, содержащими непрерывную цепь-пассажир. В еще одном варианте изобретения РНК-комплексы согласно изобретению обладают более продолжительным действием по сравнению с нативными РНК-комплексами, содержащими непрерывную цепь-пассажир. В соответствии с этим в предпочтительном варианте изобретения действие РНК- 23015563 комплексов согласно изобретению является эффективным в течение более длительного периода времени по сравнению с действием нативных РНК-комплексов, содержащих непрерывную цепь-пассажир. В другом варианте изобретения РНК-комплексы согласно изобретению обладают более эффективным действием, чем нативные РНК-комплексы, содержащие непрерывную цепь-пассажир. В соответствии с этим в предпочтительном варианте изобретения РНК-комплекс опосредует РНКи с большей эффективностью, чем нативный РНК-комплекс, например, он оказывает более сильное действие, направленное на разложение мРНК-мишени, или более сильное действие, направленное на ингибирование трансляции мРНК-мишени. Другим аспектом настоящего изобретения является способ получения РНК-комплекса согласно изобретению, включающий инкубирование антисмысловой цепи вместе с цепью-пассажиром в условиях, которые способствуют образованию РНК-комплекса, содержащего коровую двухцепочечную область, где указанный РНК-комплекс способен опосредовать РНК-интерференцию соответствующей клеточной РНК. Другим аспектом изобретения является способ опосредования модификации нуклеиновой кислотымишени в клетке или в организме, включающий следующие стадии:a) контактирование клетки или организма с РНК-комплексом согласно изобретению в условиях,при которых может происходить модификация нуклеиновой кислоты-мишени;b) опосредование, тем самым, модификации нуклеиновой кислоты-мишени. В одном из вариантов изобретения способ опосредования модификации нуклеиновой кислотымишени осуществляют in vitro (но в клетке). В одном из вариантов изобретения способ опосредования модификации нуклеиновой кислотымишени осуществляют in vivo (в организме). В еще одном варианте изобретения указанный способ осуществляют в выделенной клетке. В предпочтительном варианте изобретения указанной модификацией нуклеиновой кислоты, осуществляемой указанным способом, является интерференция РНК, предпочтительно деградация мРНКмишени или ингибирование трансляции мРНК-мишени или ингибирование РНК других типов, например, некодирующей РНК. В другом варианте изобретения указанной модификацией нуклеиновой кислоты является метилирование ДНК. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки функции гена в клетке или в организме, включающему:a) введение в клетку или организм РНК-комплекса согласно изобретению, направленного на РНК,кодируемую указанным геном, такую как мРНК или другую функциональную РНК, в целях осуществления деградации или сайленсинга, и, тем самым, продуцирование исследуемой клетки или исследуемого организма;b) поддержание указанной тестируемой клетки или тестируемого организма в условиях, при которых происходит деградация или сайленсинг РНК, кодируемой данным геном, и, тем самым, продуцирование исследуемой клетки или исследуемого организма, имеющих пониженные уровни РНК данного гена;c) наблюдение фенотипа исследуемой клетки или исследуемого организма, продуцированных на стадии b, и, необязательно, сравнение наблюдаемого фенотипа с фенотипом соответствующей контрольной клетки или контрольного организма, и, тем самым, получение информации о функции данного гена. РНК-комплекс согласно изобретению может быть введен в клетки, например, путем трансфекции,описанной в прилагаемых примерах. Наблюдение за фенотипом организма или клетки может быть осуществлено, например, с помощью протеомики, применяемой для оценки уровней белка, или с помощью микромассивов, применяемых для оценки уровней мРНК. Кроме того, для более точного определения фенотипа могут быть использованы,например, данные об экспрессии одного конкретного гена. Полученная информация о функции гена может быть использована для того чтобы определить, является ли данный генный продукт подходящей мишенью для терапевтического лечения конкретного заболевания. Так, например, если было продемонстрировано, что определенный генный продукт действует в определенном пути биохимических реакций, которые, как известно, играют негативную роль в данном организме, например, в развитии рака определенного подтипа, то такой генный продукт может быть подходящей мишенью для терапевтического лечения рака вышеупомянутого подтипа. В предпочтительном варианте способа оценки функции гена в клетке или в организме модификациями нуклеиновой кислоты, осуществляемыми способом согласно изобретению, являются интерференция РНК, предпочтительно деградация мРНК-мишени или ингибирование трансляции мРНК-мишени. В другом варианте изобретения модификацией нуклеиновой кислоты является метилирование ДНК. В предпочтительных вариантах способа оценки функции гена в клетке или в организме указанный способ осуществляют in vitro. В другом варианте изобретения указанный способ осуществляют в выделенной клетке.- 24015563 Другим аспектом согласно изобретению является способ оценки действия данного средства на генный продукт, где указанный способ включает в себя стадии:a) введения РНК-комплекса согласно изобретению, соответствующего указанному гену, в клетку или организм и, тем самым, продуцирования исследуемой клетки или исследуемого организма;b) поддержание указанной тестируемой клетки или тестируемого организма в условиях, способствующих модификации нуклеиновой кислоты-мишени;c) введения указанного средства в исследуемую клетку или исследуемый организм;d) наблюдения фенотипа исследуемой клетки или исследуемого организма, продуцированных на стадии с, и, необязательно, сравнения наблюдаемого фенотипа с фенотипом соответствующей контрольной клетки или контрольного организма, и, тем самым, получения информации о действии данного средства на генный продукт. Предпочтительным контролем на стадии d является исследуемая клетка или исследуемый организм,не содержащие РНК-комплекса, вводимый на стадии а. В предпочтительном варианте способа установления того, действует ли данное средство на ген или генный продукт, модификациями нуклеиновой кислоты в способе согласно изобретению являются интерференция РНК, предпочтительно деградация мРНК-мишени или ингибирование трансляции мРНКмишени. В другом варианте изобретения модификацией нуклеиновой кислоты является метилирование ДНК. В еще одном варианте изобретения указанный способ осуществляют в выделенной клетке. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения РНК-комплекса,включающему инкубирование антисмысловой цепи, описанной в настоящей заявке, по меньшей мере с двумя молекулами РНК, образующими непрерывную цепь-пассажир, описанную в настоящей заявке,и, необязательно, дополнительные молекулы РНК цепи-пассажира, описанные в настоящей заявке, в условиях, которые способствуют образованию РНК-комплекса, содержащего коровую двухцепочечную область. В соответствии с этим указанный РНК-комплекс способен опосредовать интерференцию соответствующей клеточной РНК. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, содержащей РНК-комплекс, где указанный способ включает инкубирование антисмысловой цепи, описанной в настоящей заявке, по меньшей мере с двумя молекулами РНК, образующими непрерывную цепь-пассажир, описанную в настоящей заявке, и, необязательно, дополнительные молекулы РНК цепи-пассажира, описанные в настоящей заявке, в условиях, которые способствуют образованию РНК-комплекса, содержащего коровую двухцепочечную область и способного опосредовать интерференцию соответствующей клеточной РНК, где либо указанное инкубирование осуществляют в фармацевтически приемлемом разбавителе, носителе или адъюванте, либо указанный РНК-комплекс затем смешивают с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем или адъювантом. Настоящее изобретение относится к применению РНК-комплекса, определенного в настоящей заявке как лекарственный препарат. Настоящее изобретение относится к применению РНК-комплекса, определенного в настоящей заявке как лекарственный препарат для лечения рака. Настоящее изобретение относится к применению РНК-комплекса, определенного в настоящей заявке, в целях получения лекарственного препарата для лечения рака. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, где указанный способ включает введение фармацевтической композиции согласно изобретению пациенту, нуждающемуся в таком лечении. Указанный способ может быть применен для лечения рака (например, путем выбора в качестве мишени р 21 ras, такого как H-ras). Еще одним аспектом изобретения является РНК-комплекс и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или адъювант (то есть настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции или терапевтической композиции, включающей РНК-комплекс согласно изобретению). Совершенно очевидно, что РНК-комплексы согласно изобретению могут быть сконструированы для их нацеливания на специфические гены и генные продукты. При этом следует отметить, что РНК-комплексы будут нацелены на последовательность ДНК или последовательность РНК, но не на белок. Однако опосредованное действие может быть направлено на уровень генного продукта, такого как белок, если его мРНК является модифицированной, например, посредством ингибирования деградации или трансляции мРНК. Кроме того, на экспрессию гена, кодирующего белок, может влиять, например, метилирование ДНК. Таким образом, другим аспектом изобретения является РНК-комплекс согласно изобретению, используемый в качестве лекарственного препарата. После подтверждения терапевтической мишени специалист может сконструировать РНК-комплексы, которые влияют на уровень и активность мишени, поскольку специфическая область РНК-комплексов находится исключительно в пределах последовательности антисмысловой цепи. Что касается нативных РНК-комплексов с непрерывной цепью-пассажиром,то проблема, связанная с побочными эффектами, вызываемыми цепью-пассажиром, действующей как ведущая последовательность, остается актуальной.- 25015563 Фармацевтическая композиция Инструкции по приготовлению фармацевтических композиций можно найти в руководстве Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro, и в нижеследующем описании. При этом предпочтительно, чтобы соединение согласно изобретению было включено в унифицированную композицию, например, в фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, в количестве, достаточном для доставки пациенту терапевтически эффективного количества соединения, так, чтобы оно не вызывало каких-либо серьезных побочных эффектов в организме пациента, подвергаемого лечению. Однако при некоторых формах терапии серьезные побочные эффекты могут быть допустимы, если при таком терапевтическом лечении гарантируется положительный результат. Доза фармацевтической композиции зависит от тяжести патологического состояния, подвергаемого лечению, и его отвечаемости на такое лечение, а также от конкретного курса лечения, которое проводят от нескольких дней до нескольких месяцев, или до тех пор, пока такое лечение не даст нужный эффект или не будет достигнуто ослабление симптомов указанного патологического состояния. Оптимальная схема введения доз может быть определена, исходя из измерения уровня аккумуляции лекарственного средства в организме пациента. Оптимальные дозы могут варьироваться в зависимости от относительной эффективности отдельных олигонуклеотидов. В основном, такая доза может быть определена исходя изECsor которая, по оценкам, проведенным на животных-моделях in vitro и in vivo, является эффективной. В общих чертах доза составляет от 0,01 мкг до 1 г на кг массы тела и может быть введена один или несколько раз в день, в неделю, в месяц или год, или даже один раз в каждые 2-10 лет, либо путем непрерывного вливания в течение периода времени от нескольких часов до нескольких месяцев. Частота введения дозы может быть оценена, исходя из установленного времени присутствия лекарственного средства и от концентраций лекарственного средства в физиологических жидкостях или в тканях. После успешного лечения пациенту может быть назначена поддерживающая терапия в целях предупреждения рецидивов указанного патологического состояния. Приготовленное лекарственное средство может содержать фармацевтически приемлемые связывающие агенты и адъюванты. Капсулы, таблетки и драже и т.п. могут содержать, например, следующие соединения: микрокристаллическую целлюлозу, камедь или желатин в качестве связывающих агентов; крахмал или лактозу в качестве наполнителей; стеараты в качестве замасливателей; и различные подсластители или ароматизаторы. Унифицированная лекарственная форма в виде капсул может содержать жидкий носитель, такой как жирные масла. Аналогичным образом, частью унифицированной лекарственной формы могут быть сахарные или энтеросолюбильные покрытия. Олигонуклеотидные препараты могут быть также приготовлены в виде эмульсий, содержащих активные фармацевтические ингредиенты и липид, образующий мицеллярную эмульсию. Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть введены различными способами в зависимости от выбранного курса лечения, то есть местного или системного лечения, и от площади пораженного участка, подвергаемого лечению. Таким введением может быть: а) пероральное введение,b) внутрилегочное введение, например, путем ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, включая введение с помощью аэрозольного ингалятора; интратрахеальное и интраназальное введение; с) местное введение, включая эпидермальное, чрескожное, внутриглазное введение и введение через слизистую, включая вагинальное и ректальное введение; илиd) парентеральное введение, включая внутривенные, внутриартериальные, подкожные, внутрибрюшинные или внутримышечные инъекции или вливания; или внутричерепное введение, например интратекальное или интравентрикулярное введение. В одном из вариантов изобретения активный олигонуклеотид вводят в орган-мишень внутривенно(i.v.), внутрибрюшинно (i.p.), перорально, местно или в виде инъекции ударной дозы или непосредственно в данный орган. Фармацевтическими композициями и препаратами для местного введения могут быть пластыри для чрескожной доставки, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, спреи, суппозитории, жидкости и порошки. При этом могут оказаться необходимыми или желательными стандартные фармацевтические носители,водные, порошкообразные или масляные основы, загустители и т.п. Предпочтительными препаратами для местного введения являются препараты, в которых олигонуклеотиды согласно изобретению представляют собой смесь с веществами, используемыми для местной доставки, такими как липиды, липосомы, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, стероиды, хелатообразующие вещества и поверхностно-активные вещества. Композициями и препаратами для перорального введения являются, но не ограничивается ими, порошки или гранулы, микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в воде или в безводной среде, капсулы, гелевые капсулы, саше, таблетки или минитаблетки. Композициями и препаратами для парентерального, интратекального или интравентрикулярного введения могут быть стерильные водные растворы, которые могут также содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки, такие как, но не ограничивающиеся ими, усилители пенетрации, соединения-носители и другие- 26015563 фармацевтически приемлемые носители или наполнители. Фармацевтическими композициями согласно изобретению являются, но не ограничиваются ими,растворы, эмульсии и препараты, содержащие липосомы. Такие композиции могут быть приготовлены из различных компонентов, которые представляют собой, но не ограничивается ими, предварительно полученные жидкости, самоэмульгирующиеся твердые вещества и самоэмульгирующиеся полутвердые вещества. Доставка лекарственного средства в опухолевую ткань может быть улучшена путем применения опосредующих такую доставку носителей, включая, но не ограничиваясь ими, катионные липосомы,циклодекстрины, производные порфирина, дендримеры с разветвленной цепью, полиэтилениминовые полимеры, наночастицы и микросферы (Dass CR. J. Pharm. Pharmacol. 2002; 54(1):3-27). Фармацевтические композиции согласно изобретению, которые могут присутствовать, в основном, в виде унифицированной лекарственной формы, могут быть приготовлены стандартными методами, широко применяемыми в фармацевтической промышленности. Такие методы включают стадию взаимодействия активных ингредиентов с фармацевтическим(ими) носителем(ями) или наполнителем(ями). В общих чертах, такие композиции приготавливают путем равномерного и тщательного смешивания активных ингредиентов с жидкими носителями или тонкоизмельченными твердыми носителями или с теми и другими, с последующим формованием, если это необходимо, нужного продукта. Композиции согласно изобретению могут быть приготовлены в виде любой из многих возможных лекарственных форм, таких как, но не ограничивающихся ими, таблетки, капсулы, гелевые капсулы,жидкие сиропы, мягкие гели и суппозитории. Композиции согласно изобретению могут быть также приготовлены в виде суспензий в водных, безводных или в смешанных средах. Водные суспензии могут также содержать вещества, повышающие вязкость такой суспензии, и такими веществами являются, например, натрий-содержащая карбоксиметилцеллюлоза, сорбит и/или декстран. Такая суспензия может также содержать стабилизаторы. Препарат для парентерального, подкожного, чрескожного или местного введения может включать стерильный разбавитель, буферы, регуляторы тоничности и антибактериальные средства. Активное соединение может быть получено с использованием носителей, которые служат в качестве защиты данного соединения от разложения или от его непосредственного выведения из организма, включая носители,применяемые в имплантатах, или микрокапсулы с регулируемым высвобождением. Предпочтительными носителями для внутривенного введения являются физиологический раствор или забуференный фосфатом физиологический раствор. РНК-комплекс согласно изобретению может быть смешан с любым веществом, которое не оказывает негативного влияния на желаемый эффект или стимулирует желаемый эффект. Такими веществами могут быть другие лекарственные средства, включая другие нуклеозидные соединения. Фармацевтический препарат согласно изобретению включает в себя, необязательно, терапевтические средства, такие как дополнительные антисмысловые соединения, химиотерапевтические соединения, противовоспалительные соединения, противовирусные соединения и/или иммуномодулирующие соединения. В композициях согласно изобретению могут также присутствовать комбинации противовоспалительных средств, включая, но не ограничиваясь ими, нестероидные противовоспалительные средства и кортикостероиды, противовирусные лекарственные средства и иммуномодулирующие лекарственные средства. Два или несколько объединенных соединений могут быть использованы вместе или отдельно, то есть соединение (РНК-комплекс) согласно изобретению может быть использовано до, во время или после введения одного или нескольких других описанных здесь терапевтических средств. Олигонуклеотиды, используемые в РНК-комплексах согласно изобретению, могут быть также конъюгированы с активными лекарственными веществами, например, с аспирином, ибупрофеном, серусодержащими лекарственными средствами, антидиабетическими лекарственными средствами, антибактериальными лекарственными средствами или антибиотиками. В одном из вариантов изобретения фармацевтическая композиция согласно изобретению также содержит по меньшей мере одно химиотерапевтическое средство. Указанное химиотерапевтическое средство предпочтительно выбрано из группы, состоящей из адренокортикостероидов, таких как преднизон,дексаметазон или декадрон; альтретамина (гексалена, гексаметилмеламина (НММ; амифостина (этиола); аминоглютетимида (цитадрена); амсакрина (M-AMSA); анастрозола (аримидекса); андрогенов, таких как тестостерон; аспарагиназы (элспара); бациллы Кальметта-Герена; бикалутамида (казодекса); блеомицина (бленоксана); бусульфана (милерана); карбоплатина (параплатина); кармустина (BCNU, BiCNU); хлорамбуцила (лейкерана); хлордезоксиаденозина (2-CDA, кладрибина, лейстатина); цисплатина (платинола); арабинозида цитозина (цитарабина); дакарбазина (DTIC); дактиномицина (актиномицина-D, космегена); даунорубицина (церубидина); доцетаксела (таксотера); доксорубицина (адриомицина); эпирубицина; эстрамустина (эмцита); эстрогенов, таких как диэтилстильбестрол (DES); этопсида (VP-16, вепезида, этопофоса); флударабина (флудары); флутамида (эйлексина); 5-FUDR (флоксуридина); 5 фторурацила (5-FU); гемцитабина (гемзара); гозерелина (зодалекса); герцептина (трастузумаба); гидроксимочевины (гидреи); идарубицина (идамицина); ифосфамида; IL-2 (пролейкина, альдеслейкина); интерферона-альфа (интрона А, роферона А); иринотекана (камптозара); лейпролида (лупрона); левамизола(эргамизола); ломустина (CCNU); мехлоретамина (мустаргена, азотного аналога горчичного газа); мелфалана (алкерана); меркаптопурина (пуринетола, 6-МР); метотрексата (мексата); митомицина-С (мутамицина); митоксантрона(валбана); винкристина (онковина) и винорелбина (навелбина). В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим (а) один или несколько описанных здесь РНК-комплексов и (b) один или несколько других химиотерапевтических средств, которые функционируют по неантисмысловому механизму. Такие как химиотерапевтические средства при их использовании вместе с соединениями (РНК-комплексами) согласно изобретению, могут быть введены отдельно (например, митромицин и олигонуклеотид), последовательно (например, сначала вводят митромицин и олигонуклеотид в течение определенного периода времени, а затем вводят другое средство и олигонуклеотид) или в комбинации с одним или несколькими другими такими химиотерапевтическими средствами или в комбинации с лучевой терапией. Все химиотерапевтические средства, известные специалистам, вводят в виде комбинированной терапии с соединением согласно изобретению. В другом варианте изобретения композиции согласно изобретению могут содержать один или несколько РНК-комплексов, направленных на первую нуклеиновую кислоту, и одно или несколько дополнительных соединений, таких как антисмысловые олигонуклеотиды, направленные на вторую нуклеиновую кислоту-мишень. Два или более объединенных соединений могут быть использованы вместе или отдельно, то есть соединение согласно изобретению может быть использовано до, во время или после введения одного или нескольких других описанных здесь терапевтических средств. Фармацевтическая композиция согласно изобретению может иметь форму пролекарства. Поэтому в одном из вариантов изобретения РНК-комплекс согласно изобретению может иметь форму пролекарства. Олигонуклеотиды образуются отрицательно заряженными ионами. Вследствие липофильной природы клеточных мембран, поглощение олигонуклеотидов клетками, по сравнению с нейтральными или липофильными эквивалентами, снижается. Такую проблему полярности можно решить путем использования пролекарств. (См., например, Crooke, R. М. (1998) in Crooke, S. Т. Antisense research and Application.Springer-Verlag, Berlin, Germany, vol. 131, pp. 103-140). В этом методе олигонуклеотиды получают в защищенном виде, так, чтобы при введении эти олигонуклеотиды были нейтральными. Защитные группы конструируют так, чтобы они могли удаляться при поглощении данного олигонуклеотида клетками. Примерами таких защитных групп являются S-ацетилтиоэтил (SATE) или S-пивалоилтиоэтил (третбутил-SATE). Указанные защитные группы являются резистентными к нуклеазе и подвергаются селективному удалению в клетках. Фармацевтическая композиция согласно изобретению также, предпочтительно, содержит противовоспалительные соединения и/или противовирусные соединения. Описанное здесь изобретение относится к способу предупреждения или лечения рака, включающему введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции или РНКкомплекса согласно изобретению. Конъюгаты В одном из вариантов изобретения один или несколько олигонуклеотидов, образующих РНКкомплекс, могут быть связаны с лигандами/конъюгатами, которые могут быть использованы, например,для усиления поглощения клетками РНК-комплекса. Такое конъюгирование может быть осуществлено в концевых 5'/3'-ОН-положениях, однако лиганды могут также присутствовать у сахаров и/или оснований. Поскольку РНК-комплекс согласно изобретению обычно содержит несколько концов (что обусловлено прерывистостью цепи-пассажира) , то имеется большее число сайтов, с которыми могут быть конъюгированы данные молекулы, что способствует усилению химического поглощения. В предпочтительном варианте изобретения по меньшей мере одна из молекул, образующих РНКкомплекс, предпочтительно первая, вторая и/или другие молекулы РНК, образующие цепь-пассажир,конъюгированы с молекулой, повышающей уровень in vivo поглощения РНК-комплекса, такой как холестерин (см. Soutschek et al., Nature 432 (11) pp. 173-178). В одном из вариантов изобретения фактор роста, с которым может быть конъюгирован олигонуклеотид, может включать трансферрин или фолат. Комплексы трансферрин-полилизин-олигонуклеотид или комплексы фолат-полилизин-олигонуклеотид могут быть получены так, чтобы они поглощались клетками, экспрессирующими высокие уровни рецептора трансферрина или фолата. Другими примерами конъюгатов/лигандов являются молекулы холестерина, дуплексные интеркалирующие агенты, такие как акридин, поли-L-лизин, конец-кэпирующие молекулы с одной или несколькими резистентными к нуклеазе связывающими группами, такими как фосформонотиоат и т.п. Настоящее изобретение также относится к конъюгату, содержащему описанный здесь РНК-комплекс согласно изобретению, и по меньшей мере одну ненуклеотидную или неполинуклеотидную молекулу, ковалентно связанную с указанным- 28015563 комплексом. В предпочтительном варианте изобретения фармацевтическая композиция согласно изобретению содержит агент для доставки нуклеиновой кислоты, то есть агент, регулирующий уровень и распределение данного терапевтического средства в организме. Предпочтительным агентом для доставки является хитозан, известный как очень хорошее средство, которое связывается с нуклеиновыми кислотами, обладает низкой токсичностью и обычно хорошо переносится организмом. Считается, что оно минимизирует нуклеотидную нагрузку и тем самым облегчает поглощение нуклеотидов. Альтернативным агентом для доставки, который может быть использован необязательно с другими агентами, такими как хитозан, является полиэтиленимин. Указанные препараты, содержащие РНК-комплексы и агенты для доставки, являются предпочтительным вариантом настоящего изобретения. Такие варианты могут быть объединены с вышеуказанными вариантами конъюгирования, например, с введением концевой группы, такой как 3'концевой холестерин, конъюгированный с нуклеотидным основанием в процессе олигонуклеотидного синтеза. Подходящие терапевтические мишени Нижеследующее описание приводится лишь в целях иллюстрации. АроВ: Как описано в WO 2007/031081, мРНК Аро В представляет собой подходящую мишень для терапевтического вмешательства, например, для лечения атеросклероза, гиперхолестеринемии или гиперлипидемии. Сурвивин: Как описано в WO 2006/050732, мРНК сурвивина является подходящей мишенью для терапевтического вмешательства, например, для лечения рака.Hif-1-альфа: Как описано в WO 2006/050734, мРНК Hif-1-альфа представляет собой подходящую мишень для терапевтического вмешательства, например для лечения раковых заболеваний, воспалительных заболеваний и глазных болезней, где указанными раковыми заболеваниями являются множественная миелома, рак почек, рак шейки матки, рак толстой кишки, рак головного мозга и рак молочной железы, и других заболеваний, таких как атеросклероз, псориаз, диабетическая ретинопатия, дегенерация желтого пятна, ревматоидный артрит, астма, воспалительное заболевание кишечника, папилломы, аллергический дерматит, воспалительные заболевания и воспаление кожи. Вс 12: Как описано в WO 2005/061710, мРНК Вс 12 представляет собой подходящую мишень для терапевтического вмешательства, например, для лечения рака, такого как раковое заболевание, выбранное из группы, состоящей из острого миелоцитарного лейкоза, диффузной В-клеточной лимфомы, острого лимфоцитарного лейкоза, рака печени, рака почек, рака мочевых путей и рака прямой и ободочной кишки.P21-Ras: Как описано в PCT/DK2006/000512, мРНК р 21 ras, например K-ras, Ha-ras и N-ras, являются подходящими мишенями для терапевтического вмешательства, например, для лечения раковых заболеваний, таких как солидные опухоли, карцинома, саркома или глиома. Так, например, вышеуказанные цели и условия могут быть достигнуты и обеспечены с использованием фармацевтических композиций согласно изобретению. Ниже представлены дополнительные варианты, которые могут быть объединены с другими вариантами согласно изобретению: 1. РНК-комплекс, обладающий способностью опосредовать модификации нуклеиновой кислотымишени, которой они соответствуют, и включающий коровую двухцепочечную область, где указанная коровая двухцепочечная область содержит антисмысловую цепь и прерывистую цепь-пассажир, которая гибридизуется с антисмысловой цепью. 2. РНК-комплекс по п.1, где указанная модификация нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из интерференции РНК и метилирования ДНК. 3. РНК-комплекс согласно варианту 2, где указанная интерференция РНК опосредует деградацию РНК-мишени или ингибирование трансляции РНК-мишени или их комбинации. 4. РНК-комплекс согласно варианту 1, где указанная кбровая двухцепочечная область содержит 1540 пар оснований. 5. РНК-комплекс согласно варианту 4, где указанная кбровая двухцепочечная область содержит определенное число пар оснований, выбранное из группы, состоящей из 18 пар оснований, 19 пар оснований, 20 пар оснований, 21 пары оснований, 22 пар оснований и 23 пар оснований. 6. РНК-комплекс согласно любому из вариантов 1-5, содержащий выступающий конец. 7. РНК-комплекс согласно варианту 6, содержащий два выступающих конца. 8. РНК-комплекс согласно любому из вариантов 6 и 7, где указанная антисмысловая цепь содержит выступающий 3'-конец. 9. РНК-комплекс согласно любому из вариантов 6 и 7, где указанная цепь-пассажир содержит выступающий 3'-конец. 10. РНК-комплекс согласно любому из вариантов 6-9, где выступающий конец имеет длину в 1-8 нуклеотидов. 11. РНК-комплекс согласно варианту 10, где выступающий конец имеет длину, выбранную из 1 нуклеотида, 2 нуклеотидов и 3 нуклеотидов.