Мультиматричное мультиспецифическое электрохемилюминесцентное испытание

1 Область техники Настоящее изобретение относится к конфигурированной мультиматричной мультиспецифической поверхности (PMAMS) для испытаний, основанных на электрохемилюминесценции, а также к способам изготовления и использования PMAMS. Уровень техники, к которой относится изобретение Диагностический анализ Имеется острая экономическая необходимость в разработке быстрых чувствительных диагностических технологий. Диагностические технологии пользуются широким спросом на экономических рынках, включая здравоохранение, исследования, ветеринарию, и рынки сельскохозяйственной и промышленной продукции. Усовершенствование чувствительности, временные затраты, легкость использования, надежность или стоимость может открыть совершенно новые рынки диагностических услуг, где раньше никакая технология не могла бы удовлетворить потребность рынка. Некоторые диагностические технологии могут обладать высокой чувствительностью, но являются слишком дорогостоящими для удовлетворения потребностей рынка. Другие технологии могут быть рентабельными, но не достаточно надежными в эксплуатации для различных рынков. Новая диагностическая техника, которая способна объединить эти качества, является значительным прогрессом и имеет перспективу в области диагностики. Имеется ряд различных аналитических методов, используемых в диагностических применениях. Эти методы включают радиоактивное мечение, иммуноферментный анализ, химический колориметрический анализ, флуоресцентное мечение, хемилюминесцентное мечение и электрохемилюминесцентное мечение. Каждый из этих методов имеет исключительную комбинацию уровней чувствительности, легкости использования, надежности, скорости и стоимости, которые определяют и ограничивают их применимость на различных рынках диагностических услуг. Эти различия частично обусловлены физическими ограничениями, свойственными каждому методу. Радиоактивное мечение,например, является по сути неустойчивым, поскольку метка самопроизвольно распадается, а удаление отработанных радиоактивных отходов приводит к проблемам экономических затрат,безопасности и охраны окружающей среды для многих применений. Разработка многих из современных чувствительных диагностических методов ограничена существующим рынком прежде всего из-за потребности в квалифицированных лаборантах для осуществления испытаний. Современные технологические методы электрохемилюминесценции требуют не только квалифицированных лаборантов, но и неоднократных промываний и 2 подготовительных процедур. Это увеличивает как стоимость, так и потребность в удалении отходов. Новейшие методы диагностики, которые упрощают испытательные процедуры, а также уменьшают стоимость каждого испытания, будут иметь большое значение и применение в открывающихся новых рынках, а также в усовершенствовании методов, представленных на существующих рынках. Электрохемилюминесцентный анализ Электрохемилюминесценция("ECL") представляет собой явление, при котором электрически возбужденная молекула испускает фотон (см., например, Leland and Powell, 1990,J.Electrochem. Soc., 137(10), стр.3127-3131). Такие молекулы получили название электрохемилюминесцентных (ECL) меток, также обозначаемых далее TAG. Обычно используемымиECL метками являются: металлорганические соединения, в которых металлом являются, например, благородные металлы VIII группы,включая металлорганические соединения, содержащие рутений Ru и осмий Os, такие как составляющая Ru (2,2'-бипиридин)3+ (также упоминаемая как "Rubpy"), раскрытая, например, Bard и соавт., (патент США 5.238.808). Свет, генерируемый ECL-метками может использоваться в качестве сигнала-"репортера" в диагностических процедурах (Bard и соавт., патент США 5.221,605). Например, ECL-метка может быть ко-валентно связана со связывающим агентом, таким, как антитело или нуклеотидный зонд. Комплекс ECL-метка/связывающий агент может использоваться для анализа ряда веществ (Bard и соавт., патент США 5.238.808). Для систем, основанных на детектировании с помощью электрохемилюминесценции (ECL), совершенно необходимо, чтобы электрический потенциал возбуждал ECL-метку для излучения фотона. Электрический потенциал с сигналами определенной формы прикладывается к раствору для ECL-анализа через поверхность электрода, обычно с металлической поверхностью, и противоположный электрод(см., например, патенты США 5,068,088; 5,093,268; 5,061,445; 5,238,808; 5,147,806; 5,247,243; 5,296,191; 5,310,687; 5,221,605). В технике хорошо известны различные устройства, доступные для проведения и детектирования ECL-реакций. Например, Zhang и соавт., (патент США 5,324,457) раскрывают образцы электродов для использования в электрохимических ячейках для проведения ECL.Levantis и соавт., (патент США 5.093.268) раскрывают электрохимические ячейки для использования в проведении ECL-реакций. Kamin и соавт. (патент США 5,147,806) раскрывают устройство для проведения и детектированияECL-реакций, включая устройства регулирования напряжения. Zoski и соавт. (патент США 5,061,445) раскрывают устройство для проведения и детектирования ECL реакций, включая 3 диаграммы формы кривой электрического потенциала для проведения ECL реакций, цифроаналоговые преобразователи, регулирующее устройство, детектирующее устройство и методы для обнаружения тока, генерируемого посредством ECL реакции в рабочем электроде для подачи информации в электронное устройство посредством обратной связи. Метод ECL рассматривается подробно, например, в патенте США 5,093,268. Коротко говоря, метод ECL является способом обнаружения аналита, представляющего интерес, в объеме образца и присутствующего в образце в относительно небольших концентрациях.ECL-молекула, названная меткой (TAG) в вышеупомянутых опубликованных патентах,может быть или может не быть связана с аналитом, но в любом случае она приводится в возбужденное состояние в результате последовательности химических реакций, индуцируемых электрической энергией, полученной от рабочего электрода. Предпочтительной молекулой,которая стимулирует электрохемилюминесценцию (ECL) метки, является такая молекула, как оксалат или, более предпочтительно, трипропиламин (см. патент США 5,310,687). Промышленный ECL-анализ На сегодняшний день, все ECL-реакции в промышленных условиях проводятся на поверхностях электрода сантиметрового масштаба. Электроды сантиметрового масштаба не дают оптимального решения проблемы увеличения величины ECL-сигнала, получаемого из больших электродов, и уменьшения полного объема образца, необходимого для каждого анализа. Однако, даже электроды сантиметрового масштаба не позволяют достигать чувствительности, требуемой для многих анализов. Пытаясь преодолеть эту проблему, все стандартные ECLсистемы далее увеличивают чувствительность,используя покрытые магнитные шарики для захвата ECL аналитов или реактивов. Шарики двигаются вплотную с рабочим электродом, и тем самым, способствуют увеличению чувствительности. Однако использование магнитных шариков имеет много ограничений. Шарики сами по себе покрыты белками, которые отстают и разрушаются со временем, вызывая изменения сигнала. Из-за сложности обработки и представления данных результатов анализа, основанного на использовании шариков, стандартная ECL диагностика требует комплексного последовательно выполняемого набора процедур для каждого анализа, проводимого с данным образцом,что увеличивает время и стоимость для каждого выполняемого испытания. Размер шариков 5 микрон препятствует для большинства ECL меток, связанных с шариками, доступу к тонкой пленке, находящейся возле рабочих электродов,что приводит к неэффективности возбужденияLeventis и соавт. (патент США 5,093,268) предложили способ количественного анализа не одного, а нескольких различных аналитов одновременно при помощи различныхECL-меток для каждого аналита, причем каждый из фотонов испускается на различных длинах волн для каждого из различных аналитов в одном испытании. Однако этот метод ограничен, например, недоступностью достаточного количества эффективных ECL-меток, излучающих на различных длинах волн и необходимостью оптимизировать химические условия для каждой метки ECL. Эти практические ограничения препятствовали коммерциализации таких многоволновых, многоаналитных ECL детектирующих систем. Другой метод увеличения чувствительности ЕСL состоит в том, чтобы улучшить технологию электрода. Zhang и соавт. (патент США 5,324,457) осаждали пленку из ECL-меток непосредственно на поверхности различных металлов и полупроводников. Метод авторовZhang и Bard,использующий объемное насыщение поверхности электрода (как описано авторами), приводит к неровному неоднородному осаждению, непригодному для высокочувствительного анализа. Существующие способы для проведенияECL -анализа также требуют, чтобы аналитическая ячейка, включая электроды, была очищена любым из множества способов, включая использование разбавленных кислот, разбавленных щелочей, растворов моющего средства, и т.д., как раскрыто, например, патентом CШАN5,147,806. Следовательно, целью настоящего изобретения является обеспечить новейший и рентабельный анализ для проведения множестваECL-реакций как последовательно, так и одновременно, а в предпочтительном варианте обеспечить встроенные контрольные стандарты для повышения точности. Другой целью настоящего изобретения является получение кассеты, содержащей одну или более подложек, подходящих для проведения множества одновременных или последовательных ECL-реакций, которые также доступны. Следующей связанной с предыдущими целью настоящего изобретения является уменьшение времени и стоимости проведения отдельного анализа для аналитов, представляющих интерес в биологических образцах. Еще одной и связанной с предыдущими целью настоящего изобретения, является разработка способов и устройства для проведения множества одновременных анализов для множества исследуемых аналитов в одном биологическом образце. Сущность изобретения Изобретение относится к кассете для проведения ECL -реакций и анализа, содержащей 5 множество дискретных связывающих доменов,иммобилизованных на подложке, причем эти дискретные связывающие домены пространственно расположены на одной линии с одним или более электродом и с одним или более противоположным электродом. Кассета предпочтительно включает в себя первую подложку,имеющую множество дискретных связывающих доменов, иммобилизованных на поверхности. Она может иметь один или более электродов и один или более противоположных электродов. Пары электрод и противоположный электрод являются доступными по отдельности для направления сигнала от источника электрической энергии в виде напряжения с определенной формой сигнала, эффективной для стимуляции электрохемилюминесценции. Кассета может также содержать вторую подложку, которая может быть помещена возле первой подложки так, чтобы между ними можно было поместить устройство, содержащее образец, и/или служащее в качестве электрода. Связывающие домены располагают определенным образом на поверхности подложки и подготавливают так,чтобы они связывались с аналитами или реагентами, представляющими интерес. Кроме того, изобретение относится к устройству для измерения электрохемилюминесценции образца, которое обеспечивает средство обработки подложки или кассеты, регулятор напряжения адаптированный для приложения регулируемого напряжения с определенной формой сигнала, эффективной для стимуляции электрохемилюминесценции, детектор фотонов для детектирования электрохемилюминесценции от образца и средство для подачи образца. Изобретение далее относится к способам использования кассет для измерения электрохемилюминесценции в образце путем введения множества связывающих доменов кассеты в контакт с образцом, который содержит множество исследуемых аналитов, при условиях ECLанализа, и затем путем прикладывания напряжения с формой, эффективной для стимуляции электрохемилюминесценции в каждой из множества пар электрод/противоположный электрод, и детектирования или измерения стимулированной электрохемилюминесценции. В широком аспекте настоящее изобретение относится к способам ECL-анализа, в которых образец не входит в контакт с электродом. Кроме того, в качестве альтернативы к использованию пар электрод/противоположный электрод, изобретение предусматривает сканирование электрода и противоположного электрода на связывающие домены. Изобретение также относится к наборам,содержащим компоненты, включая кассеты,подходящие для одновременного измерения множества электрохемилюминесцентных реакций; поверхности подложек, на которых иммобилизируется множество доменов; среду для 6 осуществления ECL-анализа с проведением химических реакций. Изобретение также относится к электродам, изготовленным из графитовых трубочек нанометрового диаметра. Описание чертежей Фиг. 1 иллюстрирует две подложки, образующие кассету в соответствии с изобретением,где на подложке 10 находится множество связывающих доменов 14, а на подложке 12 находится множество соответствующих электродов 16, так что при сближении подложек пара электродов помещается рядом с каждым связывающим доменом. Фиг. 1 А иллюстрирует две подложки, образующие кассету в соответствии с изобретением, где на подложке 10 находится определенное число связывающих доменов 14, а на подложке 12 находится определенное число соответствующих электродов 16, так что при сближении подложек пара электродов помещается рядом с каждым связывающим доменом. Фиг. 2 иллюстрирует две подложки, образующие кассету в соответствии с изобретением,в которой определенное число связывающих доменов 30 на подложке 26 находится рядом с каждым из отдельных электродов 32 так, что при сближении подложек 26 и 28 каждый из противоположных электродов 38 помещается рядом с каждым из связывающих доменов 30. Фиг. 3 иллюстрирует две подложки, образующие кассету в соответствии с изобретением,в которой на подложке 44 определенное число связывающих доменов 48 имеют соответствующие им смежные пары электрод/противоположный электрод 50. Подложка 46 может быть, но не обязательно, помещена возле подложки 44 так, чтобы подложка 46 могла содержать образец, который мог бы находиться возле связывающих доменов 48 и электродов 50. Фиг. 4 иллюстрирует две подложки, образующие кассету в соответствии с изобретением,в которой определенное число связывающих доменов 64 на подложке 60 входят в контакт с образцом, в котором предполагается содержание аналита. Подложка 62 имеет области 66,содержащие реакционную среду для обнаружения или измерения исследуемого аналита или для проведения желаемой реакции так, чтобы сближение подложки 60 и подложки 62 приводило связывающие домены 64 и области 66 в контакт друг с другом. Фиг. 5 А иллюстрирует вид сверху конфигурированных связывающих доменов для мультиматричной, мультиспецифической связывающей поверхности. Геометрические формы: треугольники, квадраты и круги, представляют собой связывающие домены, характерные для различных аналитов. Связывающие домены могут быть гидрофобными или гидрофильными. Окружающая поверхность может иметь свойство, противоположное свойству связывающих 7 доменов (гидрофильная или гидрофобная), для минимизации растекание связывающих реактивов или аналитов из связывающих доменов. Фиг. 5 В иллюстрирует вид сверху жидкостных микротрубочек для подачи связывающих реагентов и/или аналитов к дискретным связывающим доменам. Каждое пятнышко иллюстрирует поперечное сечение микрофлюидальной трубочки (например, капилляра). Фиг. 5 С иллюстрирует вид сбоку жидкостных микротрубочек, изображая приближение совмещаемых или наведенных [центрированных] жидкостных микротрубочек для подачи связывающих реагентов и/или аналитов к многокомпонентной матрице нанесенных связывающих доменов. Каждая жидкостная трубочка может подавать отличающийся связывающий реагент к дискретному связывающему домену. Фиг. 6 А иллюстрирует приблизительно модель многокомпонентной матрицы электродов при совмещении с поверхностью, имеющей конфигурированные многоструктурные, мультиспецифические связывающие домены. Между электродной матрицей и матрицей связывающей поверхности изображен съемный барьер для защиты электродов. Полная сборка содержит кассету для проведения множества ЕСL реакций. Фиг. 6 В иллюстрирует приблизительную модель матрицы совмещенных или наведенных адресуемых рабочих электродов и противоположных электродов. Электроды могут иметь форму, комплементарную [взаимодополняющую] по отношению к связывающему домену или другие формы (например, переплетающуюся). Фиг. 7 иллюстрирует вид сбоку аппроксимированной матрицы совмещенных или центрированных адресуемых рабочих электродов и противоположных электродов, и комплементарной связывающей поверхности, где проводящие полимеры наращивают от поверхностей электродов поперек зазора между электродным массивом и связывающими доменами, чтобы расширить потенциальное поле вокруг ECL-метки образца для увеличения эффективности ECLреакции. Фиг. 8 иллюстрирует вид сбоку аппроксимированной матрицы совмещенных или центрированных адресуемых рабочих электродов и противоположных электродов и комплементарной связывающей поверхности с проводящими частицами, введенными между обоими компонентами, для расширения потенциального поля. Благодаря расширению потенциального поля вокруг ECL-метки образца увеличивается эффективность ECL-реакции. Проводящие частицы могут быть магнитными, что позволяет легко проводить соответствующую манипуляцию. Фиг. 9 иллюстрирует вид сбоку сближенной матрицы совмещенных или центрированных адресуемых рабочих электродов и противо 001198 8 положных электродов, и комплементарной связующей поверхности, где электроды имеют тонкие проекции, простирающиеся в зазор между электродной поверхностью и связующими доменами, что позволяет расширить потенциальное поле вокруг ECL-метки образца в целях увеличения эффективности ECL-реакции. Фиг. 10 иллюстрирует вид сбоку сближенной матрицы совмещенных или центрированных адресуемых рабочих электродов и противоположных электродов, и комплементарной связывающей поверхности, где поверхности являются не параллельными, а соответствующими друг другу по геометрической форме. Фиг. 11 иллюстрирует вид сбоку подложки, имеющей металлический слой на ней для обеспечения сборки отдельного электрода и связывающей поверхности в виде кассеты. Матрица самоформирующихся монослоев ("SAM") наносится на металлический слой в заданной форме. Фиг. 12 иллюстрирует вид сбоку подложки, имеющей нанесенный на нее металлический слой для обеспечения сборки отдельного электрода и связующей поверхности в виде кассеты. Матрица монослоев ("SAM") наносится в заданной форме на металлический слой, а проводящие микрочастицы изображаются вкрапленными среди конфигурированных монослоев("SАМ"), что позволяет расширить поле потенциала вокруг ECL-метки образца в целях увеличения эффективности ECL-реакции. Фиг. 13 иллюстрирует вид сбоку подложки, имеющей нанесенный на нее металлический слой для обеспечения сборки отдельного электрода и связующей поверхности в виде кассеты. Матрица самоформирующихся монослоев("SAM") наносится в заданной форме на металлический слой, и наращивается проводящий полимер и/или волокно от ECL-метки для расширения поля потенциала вокруг ECL-метки в целях увеличения эффективности ECL-реакции. Фиг. 14 изображает схему подложки,имеющей матрицу электродных пар, управляемых компьютером. Фиг. 15 изображает схему подложки,имеющей матрицу электродных пар. Фиг. 16 изображает схему подложки,имеющей матрицу электродных пар, и компьютерную систему для регулирования подачи энергии к каждой электродной паре. Фиг. 17 изображает схему подложки,имеющей матрицу электродных пар, и компьютерную систему с множеством источников напряжения и мультиплексоров для регулирования подачи энергии к каждой электродной паре. Фиг. 18 изображает схему подложки,имеющей матрицу электродных пар, и компьютерную систему с множеством переключаемых источников напряжения для регулирования подачи энергии к каждой электродной паре. 9 Фиг. 19(а)-(д) изображает общий вид нескольких альтернативных комбинаций пар электрод/противоположный электрод. Фиг. 20 иллюстрирует подложку с завершенным "сэндвич"-анализом. Фиг. 21 иллюстрирует две противоположные PMAMS на подложках. Фиг. 22 А иллюстрирует матрицу микрофлюидальных трубочек (2201) и тонковолокнистую прослойку (2200). Фиг. 22 Б иллюстрирует связующие домены (2202). Фиг. 23 А иллюстрирует устройство для формирования тонковолокнистой прослойки путем вакуумной фильтрации. Фиг. 23 Б иллюстрирует тонковолокнистую прослойку (2304) на фильтровальной мембране(2303). Фиг. 24 иллюстрирует использование роликов для производства тонковолокнистой прослойки. Фиг. 25 изображает структурную схему многослойной тонковолокнистой прослойки, в которой верхний слой имеет связывающие домены, используемые для испытания. Фиг. 26 изображает структурную схему волокна, дериватизированного структурами,увеличивающими неспецифическое связывание и несколько молекул, как биологических, так и не биологических, которые связаны с поверхностью. Фиг. 27 изображает структурную схему фибриллы, дериватизированной структурами,увеличивающими неспецифическое связывание и несколько молекул, связанных с дериватизованной фибриллой, причем некоторые молекулы дополнительно связаны с лигандами. Фиг. 28 иллюстрирует несколько молекул,ковалентно связанных с фибриллой, и некоторые молекулы, которые, в свою очередь, связаны с дополнительными структурными элементами. Фиг. 29 иллюстрирует использование многослойной тонковолокнистой прослойки в качестве оптического фильтра, который, в зависимости от положения источника света, находящегося на или внутри прослойки, может пропускать свет и/или поглощать свет, и/или его рассеивать. Фиг. 30 А иллюстрирует циклические вольтамперограммы, полученные из электрохимических измерений на углеродных электродах волокнистых прослоек. Фиг. 30 Б иллюстрирует циклические вольтамперограммы, полученные из электрохимических измерений на электродах из золотой фольги. Фиг. 31 иллюстрирует сравнение электрохимических свойств тонковолокнистой прослойки как функцию толщины прослойки и от скорости сканирования. Фиг. 32 изображает график, который иллюстрирует, что неспецифическое связывание 10 на фибриллах обычно увеличивается по мере увеличения концентрации волокон в растворах белков. Фиг. 33 демонстрирует, что использование поверхностно-активных веществ может уменьшать неспецифическое связывание между ЕС LTAG 1 - меченым белком и углеродными фибриллами. Фиг. 34 схематично изображает вид сверху экспериментальной камеры, используемой для измерения электрохимических свойств и ECL на электроде тонковолокнистой прослойки. Фиг. 35 изображает ECL сигнал, полученный при использовании тонковолокнистой прослойки в качестве электрода 1000 пикомоль метки TAG1 (сплошная линия) в растворе; и сигнал от буфера для анализа (без метки TAG1)(пунктирная линия). Фиг. 36 изображает структурную схему устройства из двух поверхностей PMAMS, в котором две матрицы электродов на подложке отделяются конфигурированным диэлектрическим слоем. Фиг. 37 иллюстрирует устройство с множеством связывающих доменов (3702) на одной подложке, и с электродом и с противоположным электродом на другой подложке. Фиг.38 изображает кассету, в которой связывающие домены находятся на поверхностях отдельных объектов, поддерживаемых на противоположном электроде. Фиг. 39 изображает гель в контакте с рабочим электродом и противоположным электродом. Фиг. 40 изображает график ЕСL интенсивности и циклическую вольтамперограмму от ЕСL-меченого геля в контакте с рабочим электродом и противоположным электродом. Фиг. 41 изображает график ECLинтенсивности и циклическую вольтамперограмму от ECL-немеченого геля в контакте с рабочим электродом и противоположным электродом. Фиг. 42 изображает структурную схему для двухповерхностной кассеты, используемой для ECL. Фиг. 43 демонстрирует, что тонковолокнистые прослойки могут использоваться в качестве электродов для ECL антитела-TAG1 адсорбированного на прослойки. Фиг. 44 А изображает ECL-интенсивностьTAG1-меченого белка, иммобилизованного на электроде. Фиг. 44 Б изображает циклическую вольтамперограмму покрытого электрода. Фиг. 45 А изображает квазиобратимую многократную генерацию ECL-сигнала от иммобилизованного ECL меченого меткой TAG1 белка. Фиг. 45 Б изображает циклическую вольтамперограмму покрытого электрода, указывающую на частичное сохранение покрытия. 11 Фиг. 46 А изображает необратимую генерацию ECL-сигнала от зафиксированного ECLTAG1-меченого белка. Фиг. 46 Б изображает циклическую вольтамперограмму покрытого электрода, указывающего на существенную потерю покрытия. Фиг. 47 изображает мультиматричноеECL-устройство и микропроцессор, содержащий контроллер для генерации и анализа ECL сигналов. Подробное описание изобретения В соответствии с вышеуказанным, изобретение, в широком аспекте, относится к кассетам для проведения множества электрохемилюминесцентного анализа. Кассеты образуются из подложек, на которых присутствует множество связывающих доменов, способных специфически связываться с одним или более аналитов,представляющих интерес. Связывающие домены изготавливают в виде конфигурированных мультиматричных мультиспецифических поверхностей ("PMAMS") на подложке. Поверхности PMAMS предлагают существенное усовершенствование известных ранее способовECL-анализа, например, многократное увеличение плотности анализов, которые могут быть выполнены, и создание возможности проведения множества различных анализов, которые могут выполняться быстро или одновременно. Кассета может включать в себя множество электродов, способных селективно стимулироватьECL-эмиссию света от ECL-меченых реагентов,связанных со связывающим доменами. Фиг. 47 изображает многоструктурное ЕСL устройство,имеющее электроды 4700, 4704, матрицу 4702 со связывающими доменами 4706 и микропроцессор, содержащий контроллер 4720 для генерации и анализа ECL-сигнала, соединяемый посредством подводящих проводов 4710-4716. В варианте осуществления изобретения,проиллюстрированном на фиг. 1, кассета содержит две подложки 10,12, в которой множество связывающих доменов 14 находится на поверхности первой подложки 10, а множество пар электрод/противоположный электрод 16 находится на поверхности второй подложки 12. Связывающие домены и пары электрод/противоположный электрод выстраиваются так, чтобы при совмещении первой и второй подложек 10,12 каждая из множества пар электрод/противоположный электрод 16 помещалась смежно с одним из множества связывающих доменов 14. Первая подложка 10, поддерживающая связывающие домены 14, предпочтительно является поверхностью PMAMS с тонкопленочным золотым покрытием и прозрачными связывающими доменами. Вторая подложка 12 предпочтительно является плоским прозрачным пластмассовым листом, имеющим на себе пары прозрачных электрода/противоположного электрода 16. Связывающие домены 14 предпочтительно изготавливаются микроштамповкой органическо 001198 12 го монолитного монослоя (состоящего из отдельных мономеров), конфигурированного на поверхности подложки, где мономер имеет биотин или связывающую составляющую. Авидин или стрептавидин затем связывается с экспонированным биотином (см., например, патент США 5,093,268). Затем связывающие реагенты накладываются путем нанесения дискретного количества подходящего связывающего реагента, помеченного биотином, такого, как антитело, меченое биотином, который способен селективно связываться с исследуемым аналитом,на те участки поверхности подложки, где штамповался монослой. Фиг. 1 А иллюстрирует систему, содержащую кассету (фиг. 1), заключенную в корпус (11). В некоторых вариантах осуществления изобретения, желательно обратимо иммобилизировать на поверхности указанное или заранее заданное количество одного или более реагентов. Такая иммобилизация широко применяется в любом способе, посредством которого реагент связывается с поверхностью, включая, но не ограничиваясь ими; ковалентные химические связи, неспецифическая адсорбция; осушка реактива на поверхности; электростатические взаимодействия; гидрофобные и/или гидрофильные взаимодействия; удержание или унос в жидкостях или гелях; биологическое специфическое связывание (например, взаимодействия типа лиганд/рецептор или гибридизация олигонуклеотидов); связи металл/лиганд; хелатообразование, и/или включение в полимеры. Количество реагента, иммобилизированное на поверхности, может быть предварительно определено несколькими способами. Например, количество реагента на поверхности может быть определено одним или более объемом и/или элементом площади, в которых находится реактив. Оно может быть также определено числом отдельных молекул реагента, которые иммобилизируются на поверхности. Количество реагента может быть определено в единицах плотности конкретного реагента в данной области. Количество реагента может быть определено как процент поверхности, несущей конкретный реагент, либо по отношению к количеству других реагентов, находящихся на поверхности. Количество реагента может также быть определено как такое количество реагента, которое должно присутствовать на конкретной поверхности, чтобы дать достаточную интенсивность ЕСL, позволяющую достичь нужную специфичность анализа. В конкретном примере золотая поверхность площадью в 1 см 2 может быть покрыта монослоем алкантиолов. Реагенты могут также быть обратимо иммобилизованы на покрытых поверхностях. Покрытие может служить для усиления иммобилизации для некоторых реагентов и/или для ослабления или запрещения иммобилизации для других реагентов. Поверхность может быть 13 полностью покрыта, либо она может быть частично покрыта (то есть конфигурированное покрытие). Покрытие может быть однородно по составу, или оно может включать элементы различного состава. В данном примере, покрытие может быть конфигурированной пленкой монослоя, которая иммобилизирует иммуноглобулинG посредством ковалентных химических связей на некоторых участках, и препятствует его иммобилизации на других участках. Покрытие может также служить для предварительного определения количества (-в) одного или более реагентов, иммобилизованных на поверхности в последующих стадиях или реакциях. Или же, количество конкретного реагента может регулироваться ограничением количества реагента, который осаждается. Наличие поверхности, которая имеет реактивы (или покрытие), иммобилизованные количественным, восстанавливаемым образом, дает возможность обратимо и количественно измерять ECL-сигнал от образца, в результате чего может быть осуществлена калибровка. Предпочтительно, пары электрод/противоположный электрод 16, имеют субсантиметровый размер, и изготавливаются вместе с электродными подводящими проводами 20 (например, из прозрачной металлической пленки) способами, хорошо известными для изготовления жидкокристаллических дисплеев и электрохромных панелей дисплеев. Электродные подводящие провода 20 соединены электрическими проводами 19 к генератору сигнала специальной формы 18. Предпочтительно, чтобы пары электрод/противоположный электрод были доступны по отдельности при компьютерном управлении так, чтобы электрический потенциал мог выборочно прикладываться к дискретным связывающим доменам. Фотоэлектрический приемник 22 и цифровой компьютер 24 обеспечивают регистрацию и анализ результатов, после того стимуляции ECL-эмиссии подходящей метки, связанной со связывающим доменом. Фиг. 1 А иллюстрирует систему, содержащую кассету, подводящие электрические провода, генератор сигналов специальной формы,средство детектирования света и цифровой компьютер, как описано на фиг. 1, заключенную в корпус (11). Кассета вставляется в корпус через отверстие (15). В другом варианте осуществления изобретения используется один рабочий электрод для одновременного генерирования ECL-сигнала во множестве связывающих доменов. В этом варианте изобретения ECL-сигнал от каждого связывающего домена идентифицируется с помощью формирователя светового изображения. Вообще говоря, преимущество анализа проводимого с использованием кассет в соответствии с настоящим изобретением, заключается в использовании множества дискретных связывающих доменов. Например, использова 001198 14 ние таких кассет делает возможным быстродействующее и/или параллельное детектирование,или измерение широкого разнообразия аналитов, представляющих интерес. В предпочтительном варианте настоящего изобретения, анализ в соответствии с изобретением также предусматривает эффективное использование ECLмеченого реагента, аналита или связывающей поверхности. ECL-анализ в соответствии с настоящим изобретением предусматривает контактирование множества связывающих доменов с образцом, в котором предполагается содержание исследуемого аналита и стимуляцию ECLэмиссии от связанной ЕСL-метки, где ECLметка находится на аналите, или аналита; на реагенте, который связывается с аналитом, или на множестве связывающих доменов. Изобретение также относится к способамECL-анализа для детектирования или измерения исследуемого аналита, предусматривающим а) контактирование одного или более из множества дискретных связывающих доменов,причем упомянутое множество связывающих доменов являются иммобилизованными на поверхности одной или более подложек, в которых упомянутое контактирование происходит с образцом, содержащим молекулы, связанные с электрохемилюминесцентной меткой, причем упомянутый образец не контактирует с какимилибо электродами или противоположными электродами в процессе указанной стадии контактирования; б) введение электрода в непосредственную близость к упомянутому одному или нескольким из множества связывающих доменов; в) приложение напряжения со специальной формой сигнала, эффективной для стимуляцииECL в упомянутом одном или более из множества связующих доменов; и детектирование или измерение ECL. В другом варианте своего осуществления,изобретение относится к способам ECL-анализа,предусматривающим: а) контактирование одного или более из множества дискретных связывающих доменов,причем упомянутое множество связывающих доменов (i) является иммобилизованным на поверхности одной или более подложек, и (ii) является пространственно центрированным с и находится в близости с множеством пар электрод/противоположный электрод, где имеет место упомянутое контактирование с образцом,содержащим молекулы, связанные с электрохемилюминесцентной меткой,б) приближение электрода и противоположного электрода вплотную к упомянутому одному или более из множества связывающих доменов; в) приложение напряжения со специальной формой сигнала, эффективной для стимуляции ЕСL в упомянутом одном или более из множества связующих доменов; и 15 г) детектирование или измерение электрохемилюминесценции. Множество связывающих доменов на подложке получают возможность взаимодействовать с анализируемыми образцами. Поверхности РМАМS могут далее приводиться в контакт с растворами, содержащими реагенты, необходимые для выполнения анализа. Затем, связывающая поверхность приводится в контакт (например, прессуется) с поверхностью электрода(предпочтительно чистого, или не бывшего в употреблении электрода), к которому затем прикладывается электрический потенциал для стимуляции ECL. В предпочтительном способе проведения анализа с использованием устройства фиг. 1,образец, в котором предполагается содержание аналита, представляющего интерес, наносят на многочисленные связывающие домены 14 вместе с ECL-мечеными реагентами, подходящими для детектирования аналита. Подложка 11 и подложка 12 затем совмещаются так, чтобы каждый из многочисленных связующих доменов 14 расположился между электродом и противоположным электродом одной из многочисленных пар 16 электрод/противоположный электрод, и чтобы образец оказался заключенным между ними. Следует отметить, что пара электрод/противоположный электрод не обязательно должна создавать механический контакт с связывающим доменом, чтобы стимулировать ЕСL,когда соответствующий потенциал прикладывается к паре электрод/противоположный электрод. Электрический потенциал со специальной формой сигнала, подходящей для стимуляцииECL-эмиссии, прикладывается посредством электрических проводов 19 от генератора сигналов специальной формы к многочисленным парам электрод/противоположный электрод 16. Любой сигнал, испускаемый ECL-меткой, находящейся на многочисленных связывающих доменах 14, детектируется фотоприемником 22, и записывается и анализируется цифровым компьютером 24. Изобретение относится к способу детектирования в объеме многокомпонентного жидкого образца множества аналитов, представляющих интерес, которые могут присутствовать в образце в различных концентрациях. Вообще говоря, множество аналитов может детектироваться от многокомпонентного образца в молярных концентрациях менее 10-3. Предпочтительно, чтобы множество аналитов могло детектироваться в молярных концентрациях менее 10-12 из многокомпонентного образца. Изобретение относится к детектированию в многокомпонентном образце, которое может быть выполнено как гетерогенный анализ, то есть, анализ, в котором множество несвязанных меченых реагентов отделяется от множества связанных меченых реагентов перед тем, как 16 связанные меченные реагенты будут подвергнуты воздействию электрохимической энергии и как гомогенный анализ, то есть, анализ, в котором множество несвязанных меченых реагентов и связанных меченых реагентов вместе подвергаются воздействию электрохимической энергии. В анализах настоящего изобретения, электромагнитное излучение, используемое для детектирования конкретного аналита, может быть дифференцировано от электромагнитного излучения, соответствующего другим аналитам, путем идентификации его положения и/или локализации как одной или более отличительных особенностей конфигурации, причем упомянутая конфигурация соответствует конфигурации связывающих доменов в PMAMS. В гомогенном анализе настоящего изобретения детектируется электромагнитное излучение, испускаемое связанными мечеными реагентами, которое может либо увеличиваться,либо уменьшаться по величине электромагнитного излучения, испускаемого связанными мечеными реагентами, по сравнению с несвязанными реактивами, или детектируется электромагнитное излучение, испускаемое от источников, соответствующих в пространстве одной или более особенностям конфигурации, по отношению к конфигурации связывающих доменов в PMAMS. В конкретном примере способа изобретения, проиллюстрированного на фиг. 20, "сэндвич"-анализ проводится на подложке (5) с множеством связывающих доменов (BD) на ее поверхности, которые являются специфичными для связывания конкретного аналита (An). Когда образец, в котором предполагается содержание аналита, наносят на связующие домены, то аналит связывается с этими доменами. Антитела(Аb), которые являются подходящими для избирательно связывающихся аналитов (An) и которые были помечены ECL-меткой (TAG), для образования конъюгата Ab-TAG, затем наносят на аналит на связующих доменах. После этого излишек несвязанного конъюгата Ab-TAG смывается со связующих доменов, и потенциал с формой сигнала, подходящей для стимуляции электрохемилюминесценции, прикладывается кTAG посредством (не показанных) электродов,в результате чего стимулируется ECL-эмиссия от любой метки TAG на связывающих доменах. Сигнал ECL детектируется фотоприемником и регистрируется цифровым компьютером (например, как показано позициями 22 и 24 на фиг. 1). Другие варианты осуществления изобретения, его отличительные признаки и модификации описаны ниже. 5.1. Получение связывающей поверхности. Чтобы лучше понять изобретение, ниже дается более подробное описание приготовления связующих доменов на подложке. Конфигу 17 рированная матрица связывающих доменов на поверхности, которые являются специфичными для множества аналитов, упоминается здесь как конфигурированная, мультиматричная, мультиспецифичная поверхность, или PMAMS.PMAMS приготавливается на подложке, например, посредством конфигурирования самоформирующихся монослоев ("SAM") ( Ferguson и соавт., 1993, Macromolecules, 26(22), стр. 58705875; Prime и соавт. 1991, Science, 252, стр. 1164-1167; Laibinis и соавт. 1989, Science, 245,стр. 845-847; Kumar и соавт., 1984., Langmuir, 10Chem., 101, стр. 522-528). Способы конфигурирования поверхности также предусматривают использование физического травления (например, механической микрообработки) (Abbott и соавт., 1992, Science, 257, стр. 1380-13827, Abbott, 1994, Chem.Mater., 6(5), стр. 596-602), микролитографию (Laibinis и соавт., 1989, Science,245, стр. 845-847), связывание химических групп с поверхностью посредством фотоактивационной химии (Sundberg и соавт., 1995, J.Am.Chem. Soc., 117(49), стр. 12050-12057) и осуществление микроштамповки (Kumar и соавт.,1994,Langmuir, 10(5), стр. 1498-1511; Kumar и соавт., 1993, Appl.Phys.Lett., 63 (14), стр. 20022004). Другие способы конфигурирования поверхности предусматривают процедуры для пространственно регулируемого распределения текучих сред или частиц (например, нанесение микроручкой (например, использование микрофлюидальной трубочки для перенесения на поверхность, используя Х-Y-перемещение, микрокаппилярное нанесение (Kim и соавт., 1995,Nature, 376, стр. 581), струйная технология, или нанесение шприцем-дозатором. Для получения сложных поверхностных конфигураций могут использоваться комбинации этих методов. Фиг. 5 А изображает подложку 600 со связывающими доменами независимой формы, которые просто в целях иллюстрации представлены как геометрические формы 602, чтобы показать, что на одной подложке могут присутствовать домены с различными специфичностями связывания. Поверхность 604 между связывающими доменами может быть альтернативно гидрофобной или гидрофильной, что позволяет установить границы нанесения связывающего реагента для образования связывающих доменов. Связывающие домены и/или поверхности между связывающими доменами могут альтернативно иметь тенденцию и быть устойчивыми к неспецифическому связыванию, и/или они могут иметь тенденцию и быть устойчивыми к присоединению связывающих реагентов посредством ковалентного или нековалентного взаимодействия. В случае, если неспецифическое связывание посредством гидрофобных взаимодействий не является способом, желательным для присоединения связывающих химических молекул к поверхности, то для предотвращения слу 001198 18 чайного неспецифического связывания может быть добавлено моющее средство. Вообще говоря, связывающие домены по ширине или диаметру составляют от 0,1 мкм до 1 мм, или более, в зависимости от геометрии домена. Поверхности селективно дериватизируются для того, чтобы компоненты для специфического связывания подвергались воздействию, например, раствора для ЕСL-анализа. Кроме того, неспецифические взаимодействия в связывающих доменах уменьшаются в присутствии агента специфического связывания, что может быть достигнуто путем введения таких компонентов, как полиэтиленгликоли на доступной поверхности дискретных связывающих доменов (Prime и соавт., 1993, J. Chem. Soc, 115,стр. 10714-10721; Prime и соавт., 1991 Science,252, стр. 1164-11677; Pale-Grosdemalnge и соавт., 1991, J. Chem. Soc., 113, стр. 12-20). Вообще говоря, PMAMS может содержать от 2 до 108 связывающих доменов. Предпочтительно, число связывающих доменов составляет от 50 до 500. В других вариантах осуществления изобретения число связывающих доменов составляет от 25 до 100. Подложка может быть сделана из различных материалов широкого ряда, включая, но не ограничиваясь ими, таких как: стекло, пластмасса, керамика, полимерные материалы, эластомерные материалы, металлы, сплавы, составная фольга, полупроводники, диэлектрики,кремниевые и/или слоистые материалы, и т.д. Дериватизированные эластомерные подложки могут быть получены, например, как описываетFerguson и соавт., 1993, Macromolecules, 26, стр. 5870-5875; Ferguson и соавт., 1991, Science, 253,стр. 776-778; Chaudhury и соавт., 1992, Science,255, стр. 1230-1232. Поверхность подложки, на которой приготовлены PMAMS, может содержать различные материалы, например, сита, войлоки, высокоэластичные материалы, гели, твердые вещества(например, полученные из металлов) эластомеры, и т.д. Поверхность подложки может обладать различными структурными, химическими и/или оптическими свойствами. Например, поверхность может быть жесткой или гибкой, плоской или деформированной, прозрачной, полупрозрачной, частично или полностью отражающей свет или непрозрачной и может обладать сложными свойствами, областями с различными свойствами, а также может быть составлена из более чем одного материала. Поверхность может иметь связывающие области конфигурированной поверхности и/или конфигурированные области, где может происходить катализ, в соответствии с изобретением, на одной или более поверхностях, и/или адресную матрицу электродов на одной или более поверхностях. Поверхности подложен могут быть конфигурированы в любых подходящих формах, включая плоскую, шарообразную, кубообразную и ци 19 линдрическую. В одном из вариантов изобретения подложка, несущая PMAMS, является стержнем. В другом варианте изобретения, подложка, несущая РМАМS, содержит углерод,например, графит, стеклоуглерод или сажу. В одном варианте осуществления изобретения, подложка, несущая PMAMS, содержит одно или более углеродных волокон. Эти волокна могут быть аморфным или графитовым углеродом. Они могут также быть углеродными нанометровыми трубочками, трубчатыми кластерами атомов углерода или членами семейства фуллеренов. В предпочтительном варианте изобретения, подложка, несущая РМАМS, содержит одну или более углеродных фибрилл (Гиперионные фибриллы торговая марка) (патент США 4,663,230). Отдельные тонкие волокна (как раскрыто в патентах США 4,663,230, 5,165,909,и 5,171,560) могут иметь диаметры, составляющие приблизительно от 3,5 нм до 70 нм, и длину более чем 102 диаметров, внешнюю область из множества в основном, непрерывных слоев упорядоченных углеродных атомов и отличающуюся внутреннюю центральную область. Лишь для иллюстрации, например, типичный диаметр для углеродной фибриллы может приблизительно составлять между 7 и 25 нм, а типичная длина может составлять от 1 мкм до 10 мкм. Углеродные материалы могут быть изготовлены так, чтобы они образовали агрегаты. Как раскрыто в патенте США 5,110, 693 и в приведенных там ссылках, две или более отдельных углеродных фибриллы могут образовывать микроскопические агрегаты из спутанных фибрилл. Эти агрегаты могут иметь размеры в пределах от 5 нм до нескольких см. Просто в целях иллюстрации, один тип микроскопического агрегата ("сахарная вата, или СС") напоминает шпиндель или прут запутанных волокон с диаметром, который может находиться в диапазоне от 5 нм до 20 мкм, с длиной, которая может находиться в диапазоне от 0,1 мкм до 1000 мкм. Снова в качестве иллюстрации другой тип микроскопического агрегата из фибрилл("птичье гнездо, или BN") может быть почти сферическим с диаметром, который может составлять в диапазоне от 0,1 мкм до 1000 мкм. Могут быть образованы большие агрегаты каждого типа (СС и/или BN) или из смесей каждого типа (см. ниже). Фибриллами, которые могут использоваться в подложке, являются, но не ограничиваются ими: отдельные фибриллы, агрегаты из одной или более фибрилл, суспензии из одной или более фибрилл, дисперсионные системы фибрилл, смеси фибрилл с другими материалами(например, с маслами, парафинами, воском, полимером, гелем, пластмассой, адгезивом, эпоксидной смолой, тефлоном, металлами, органическими жидкостями, органическими твердыми веществами, неорганическими твердыми веще 001198 20 ствами, кислотами, щелочами, керамикой, стеклом, резиной, эластомерами, биологическими молекулами и среды, и т.д.) также как и их комбинации. Фибриллы могут быть магнитными в некоторых случаях и немагнитными в других. Степень, до которой фибриллы могут быть сделаны магнитными или немагнитными, зависит от количества катализатора, который оказывается в фибрилле в результате процесса производства фибриллы, такой процесс раскрывается в американских патентах 4,663,230, 5,165,909, и 5,171,560. Поверхности PMAMS располагаются на подложках, в подложках, или вблизи подложек, описанных выше. Поверхности РМАМ могут быть продуцированы из различных типов групп, связывающихся с поверхностью. Самоформирующимися монослоями, которые могут быть использованы,чтобы формирования монослоя на поверхности,с которой они связываются, являются, но не ограничиваются ими: алкантиолы (которые связывают золото и другие металлы), алкилтрихлорсилан (который, например, связывает кремний, двуокись кремния), алканкарбоновые кислоты (например, которые связывают окиси алюминия), а также их комбинации. Сначала может быть сформирован монослой, а затем используется химическое сшивание для присоединения связывающих реагентов. В результате дериватизации после самосборки монолита получают более правильную двухмерную кристаллическую упаковку монослоя на поверхности подложки, с меньшим количеством точечных отверстий или дефектов. Монослой может быть дериватизирован с помощью связывающих реагентов до или после самосборки. Регулярные дефекты в монослое могут быть желательными,и могут быть получены путем дериватизации до самосборки монослоя или поверхности подложки. Если дериватизируемая группа (например,экспонируемая связывающая группа на связывающем реактиве является стерически незатрудненной, то она может создавать плотноупакованную поверхность на экспонируемом конце, но с регулярными зазорами на металлической поверхности. Это благоприятствует протеканию заряда через указанные регулярные зазоры к ECL-меченым компонентам, связанным с частями, контактирующими с раствором образца. Формирование дефектных монослоев известно в технике. Другими способами формирования дефектных монослоев являются, но не ограничиваются ими, формирование монослоев из разбавленных растворов связывающего реагента; прекращение реакции, формирующей монослой, перед завершением; повреждение более цельных монослоев радиацией (например,ионными частицами), светом или химическими реагентами. В одном из вариантов, многократная штамповка без ремаркировки штампа может 21 давать ряд дефектных монослоев (Wilbur и соавт., 1995, Langmuir, 11, стр. 825). Поверхность PMAMS может быть генерирована на поверхности матриц. Матрицы могут быть высоко проводящими, например, металлические электроды или проводящие полимерные пленки; или матрицы могут быть диэлектриками; или матрицы полупроводниковые и/или из проводящих сред. Материал для матрицы может быть ионным проводником или пористым материалом. Такие пористые материалы могут применяться в качестве материала для подложки,и/или проводящего материала, и/или фильтрующего материала, и/или материала, образующего каналы (например, пропускающего текучие среды, ионные объекты и т.д.). Пористый материал может быть объединен с добавками. Например, составные структуры могут быть изготовлены из пористых материалов с дополнительными пористыми материалами, из проводящих материалов, полупроводящих материалов, структур, образующих каналы и/или растворов (например, ионными текучими средами). Такие композиты могут быть слоистыми структурами, структурами типа "сэндвича" и/или композитами с вкрапленными другими соединениями. Может использоваться твердая матрица, которая является пористым материалом, нанесенным на металлический электрод. Альтернативно, пористый материал наслаивается по типу "сэндвича" между проводящими материалами, полупроводящими материалами или комбинациями полупроводящих и проводящих материалов. Один или более связывающих доменов могут находиться на одной сплошной плите из пористого материала, и/или они могут быть расположены на множестве дискретных элементов на подложке, каждый из которых имеет один или более связывающих доменов. Поверхность пористого материала(например, геля) может быть плоской, полусферической или принимать любую правильную или неправильную форму, и/или она может обладать различными физическими свойствами(например, быть эластичной, жесткой, низкой плотности, высокой плотности, градиентной плотности, сухой, влажной и т.д.), и/или она может обладать различными оптическими свойствами (например, быть прозрачной, полупрозрачной, непрозрачной, отражающей, преломляющей и т.д.), и/или может обладать различными электрическими свойствами (например,быть проводящей, полупроводящей, изолирующей, переменно проводящей, например в зависимости от того, является ли она сухой или влажной и т.д.). Конфигурация каналов может быть сформирована в матрице. Слои из пористого материала могут быть толщиной от 5 микрон до 2000 микрон. Толщина слоев из пористого материала может также превышать 2 мм. 22 Поры могут частично и/или полностью пронизывать материал, или они могут быть частью сети из пор. Эти поры могут иметь размеры, составляющие в широком интервале от 50 до 10000 мкм. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, материал может иметь некоторые поры с размерами в пределах от 200 до 500 , а некоторые поры с размерами в пределах от 0,5 мкм до 100 мкм. Пористость материала может быть постоянной по всему материалу или она может увеличиваться или уменьшаться в зависимости от положения в материале. Материал может иметь широкое разнообразие пор различного размера,распределенных хаотически и/или случайно. Пористый материал может быть составлен из более, чем из одного материала. Например, материал может иметь некоторые поры, которые являются достаточно большими, чтобы пропускать молекулы такого размера, как биологические клетки; некоторые поры, которые могут пропускать биологические среды такого размера, как белки или антитела; а некоторые поры, которые могут пропускать только небольшие с молекулярной массой 1000 органические молекулы, и/или их комбинации. Пористость материала может быть такой,что одна или несколько молекул, жидкостей,твердых веществ, эмульсий, суспензий, газов,гелей и/или дисперсных систем могут диффундировать в этот материал, внутри этого материала и/или через него. Пористость материала является такой, что биологические среды могут диффундировать (активно или пассивно) или могут быть внедрены определенными способами в-, внутрь-и/или через материал. Примерами биологических сред являются, но не ограничиваются ими: цельная кровь, фракционированная кровь, плазма, сыворотка, моча, растворы белков, антител или их фракции, клетки, субклеточные частицы, вирусы, нуклеиновые кислоты,антигены, липопротеины, липосахариды, липиды, гликопротеиды, углеводы, пептиды, гормоны или фармакологические агенты. Пористый материал может иметь один или более слоев различной пористости так, что биологические среды могут проходить через один или более слоев, и не проходить через другие слои. Пористый материал может быть способен поддерживать ток благодаря потоку ионов. Более усовершенствованным пористым материалом является пористый набухающий в воде гель, например, полиакриламид, или агар. Существует множество других гелевых композиций (например, см. Soane D.S., Polymier Application for Biotechnology (Применение полимеров для биотехнологии), под редакцией Soane D.S.,Simon u Schuster: Englewood Cliffs, NJ, 1992;Hydrogels in Medicine and Pharmacy (Гидрогели в медицине и фармацевтике), Vol. I-III, под редакцией Peppas N.A., CRC Press, Boca Raton, FL, 23 1987). Связывающие домены могут быть связаны с матрицами ковалентными и нековалентными связями. (По этой теме было написано много обзоров и книг; некоторыми примерами которых являются: Tampion J. u Tampion M.D.Medicine and Pharmacy, выше). Например, белок может быть прикреплен к структурированному сополимеру полиакриламида и N-акрилоилсукцинимида путем обработки раствором белка. Связывающие домены могут также быть интегрированы в пористую матрицу в стадии до полимеризации или гелеобразовании. В одном из вариантов изобретения, связывающие домены могут быть связаны с неструктурированными полимерами и посредством множества сшивающих химических агентов. Полимеры могут быть затем структурированы (например, с использованием, которые включают амидные связи, дисульфиды, нуклеотиды, вступающие в реакцию с эпоксидными полимерами, и т.д.)Am.Chem.Soc., 102(20), стр. 6324-36). Связывающие домены могут быть присоединены к мономерным звеньям, которые потом внедряются в полимерные цепи во время полимеризации (см. Adalsteinsson О., 1979, J. Mol. Catal.,6(3), стр. 199-225). В другом варианте осуществления изобретения, связывающие домены могут быть включены в гели, захвата связующих доменов в поры во время полимеризации/гелеобразования или проникновения связывающих доменов в пористую матрицу и/или пленку. Кроме того, связывающие домены могут адсорбироваться на поверхности пористых матриц(например, полимерных гелей и пленок) посредством неспецифической адсорбции, вызванной,например, гидрофобным и/или ионным взаимодействием. В качестве сшивающего или связывающего агента может успешно использоваться биотин. В связывающие домены могут быть введены авидин, стрептавидин или другие связывающие агенты на основе биотина. Поверхности РМАМS могут быть продуцированы на пористых материалах (например,гели) с различным размером пор и содержанием 24 растворителя. Например, полиакриламидные гели, с различными размерами пор, могут быть получены путем изменения концентрации акриламида и степени поперечной связи. На такой поверхности PMAMS с размерами пор меньше, чем аналит, реакции связывания будут происходить в основном на поверхности геля. В этом случае может использоваться фильтрация и/или гель-электрофорез, чтобы концентрировать аналиты на поверхности геля и модулировать кинетику (например, увеличивать скорость) реакции связывания. Более быстрая кинетика предпочтительна в быстродействующем анализе (например, короткие промежутки времени до получения результатов), и может индуцировать повышенную чувствительность за более короткий промежуток времени. На поверхностях PMAMS с размерами пор больше, чем аналит, реакции связывания могут происходить на поверхности также, как в большем объеме геля. В этом случае для повышения кинетики связывания и для удаления несвязанных объектов с поверхности, может использоваться фильтрация и/или электрофорез. Поверхности РМАМS, сформированные на гелях, могут храниться влажными, и/или они могут храниться в высушенном состоянии и восстанавливаться во время анализа. Реагенты,необходимые для ECL-анализа, могут быть введены в гель перед хранением (посредством проникновения в гель или посредством введения во время формирования геля) и/или они могут быть добавлены во время анализа. Конфигурированные связывающие домены поверхности PMAMS могут быть генерированы посредством нанесения на подложку капель или микрокапель в жидком виде, каждая из которых заключает связующий домен в матрице. Отвердение и/или гелеобразование жидкости может быть затем индуцировано хорошо известными методами такими, как полимеризация, перекрестное сшивание, охлаждение до температуры ниже гелеобразования, нагрев). Агенты, которые вызывают отвердение или гелеобразование,могут быть включены в капли так, чтобы в некоторое время после их нанесения, капли затвердевали и/или образовывали гель. Последующая обработка (например, экспонирование воздействием света, излучения и/или окислительно-восстановительного потенциала) может использоваться,чтобы вызвать отвердение и/или гелеобразование. В других вариантах, такие капли или микрокапли могут быть взвесями, форполимерными смесями, группами частичек,и/или по существу твердыми каплями. Кроме того, может применяться осаждение из газовой фазы. Формирование конфигурации может быть достигнуто, посредством формирования слоистой структуры матриц, каждая из которых заключает один или несколько связующих доменов. Например, агарозу, конъюгированную(стандартными химикатами) с антителом можно было бы налить в контейнер и дать зажелероваться посредством охлаждения. Затем, на первый слой могут быть нанесены последующие слои и слои, содержащие другие. Поперечное сечение этой слоистой структуры дает сплошную поверхность, представляющую множество различных связывающих доменов. Такие поперечные сечения могут быть уложены в стопку и эта стопка может быть разрезана образованием другого поперечного сечения, в результате чего может быть получена поверхность PMAMS с еще большей плотностью связующих доменов. Альтернативно линии матрицы, содержащей данный связывающий элемент, пролегают смежно друг с другом и/или накладываются друг на друга. Такие структуры могут также разрезаться в поперечном сечении и использоваться в качестве РМАМ поверхности. Формирование конфигурации может также быть достигнуто, благодаря преимущественной способности некоторых матриц к разделению. Например, смесь нуклеотидных зондов может быть разделена посредством электрофореза в полиакриламидной пластинке, производящей поверхность, представляющую множество различных связывающих доменов. Жидкостные микротрубочки могут также использоваться для приготовления связывающих доменов PMAMS на подложке. Частичный перечень жидкостных микротрубочек включает полые капилляры, капилляры, сделанные и/или заполненные матриксом (например, пористая или набухшая в растворителе среда), твердые подложки, на которые могут быть нанесены тонкие пленки или капли жидкости. Капилляр может быть твердым, и реагенты могут протекать по внешней поверхности капилляра, резервуар с текучей средой реагента может быть обращен к той стороне пористого матрикса, который приводится в контакт с поверхностьюPMAMS. Например, резервуар с реактивом может непрерывно или периодически снова наполняться так, чтобы данная сторона пористого матрикса могла периодически наносить реактивы (например, алкантиолы, чтобы формировать монослои и/или связывающие реактивы и т.д.) многократно. Кроме того, может использоваться изменение пористости матрикса для регулирования потока реактива к поверхности. Различные или идентичные связывающие реагенты могут присутствовать в множестве капилляров,и/или многочисленные отличающиеся связывающие агенты могут присутствовать в данном капилляре. Капилляры приводятся в контакт с поверхностью PMAMS (например, конфигурированный монослой SAM) так, чтобы некоторые домены подвергались воздействию связывающих реагентов с образованием дискретных связывающих доменов. Если необходимо, то различные связывающие реагенты, каждый из ко 001198 26 торых находится в отдельной микрофлюидальной трубочке, могут подводиться одновременно из матрицы жидкостных трубочек на металлическую поверхность, SAM и т.д. Микрофлюидальные трубочки могут также использоваться для нанесения микропечати с желательной молекулой перед нанесением на поверхность подложки. Например, отдельные микрофлюидальные подающие трубочки могут использоваться для нанесения различных связывающих реагентов, связанных с компонентом, стимулирующим адсорбцию на поверхности подложки (например, свободный тиол на углеводородном линкере, который способствует адсорбции на золото),для формирования PMAMS. Таким образом,например, микропечать, нанесенная посредством использования микрофлюидальных подводящих трубочек с антителами различной специфичности, которые включают линкер со свободным тиолом, могут использоваться, чтобы наносить такие антитела на желательные участки на золотой поверхности, в целях формирования дискретных связывающих доменов изPMAMS. Другим методом конфигурированной подачи текучей среды является использование устройств микропечати, которые подают микрокапли текучей среды посредством эжекции[выбрасывания] капли через маленькое отверстие (например, струйный принтер). Эжекция капель в этих устройствах может вызываться посредством различных механизмов, включая нагревание, электростатический заряд и/или давление от пьезоэлектрического устройства. Конфигурирование более, чем одной жидкости может быть достигнуто с помощью многочисленных отверстий и/или одного отверстия и соответствующего переключения оптических модуляторов. В одном из способов приготовления поверхности PMAMS микрофлюидальные подающие трубочки используются для подачи (предпочтительно одновременно) непосредственно на дискретные области на поверхности капли, содержащие желательные связывающие реагенты для формирования дискретных связывающих доменов. Связывающие реагенты могут содержать функциональную химическую группу, которая образует связь с химической группой на поверхности, на которую он наносится. В другой модификации связывающие реагенты в капле неспецифически адсорбируются или связываются с поверхностью (например, осушиваются на поверхности). В другом случае, капля (-и), осажденная на поверхность, содержит реагенты, которые могут формировать матрицу. Эта матрица может быть твердым телом, полимером или гелем. Формирование матрицы может быть осуществлено путем выпаривания растворителя. Оно может происходить посредством полимеризации мономерных звеньев. Оно может происходить по 27 средством поперечного сшивания уже сформированных полимеров. Оно может происходить посредством модуляции температуры (например, охлаждением и/или нагреванием). Оно может быть осуществлено другими способами. Например, полимерные соединения могут охлаждаться путем охлаждения или путем добавления реагента, который вызывает гелеобразование. Формирование твердой матрицы может быть стимулировано путем генерирования реакционноспособных соединений на электроде(или другим излучением), путем добавления реактивов, которые стимулируют отверждение или гелеобразование при прохождении или нагревании. Кроме того, поверхность может содержать катализаторы, способные к инициации формирования матрицы (например, гелеобразование или полимеризация). В предпочтительном методе, для предотвращения растекания нанесенных текучих сред или гелей, могут использоваться конфигурированные гидрофильные/гидрофобные домены. Такая текучая среда или гель могут содержать связывающие реагенты, для связывания с поверхностью на подложке для формирования связывающих доменов PMAMS. В этом случае,использование такой гидрофильно/гидрофобной границы способствует ограничению продуцированного связывающего домена дискретной областью. Альтернативно, текучая среда содержит реагенты, которые могут формировать матрицу на поверхности, и связывающие реагенты будут заключаться внутри заданной области при осаждении на поверхности. Например, гидрофильный/гидрофобный барьер может применяться для удержания капли в заданной области. Кроме того, либо гидрофильные, либо гидрофобные участки могут представлять группы, которые могут быть введены (например, посредством ковалентной или нековалентной связи) в матрицу, что позволяет достичь более устойчивую адгезию [прилипание] матрицы к подложке (Itaya и Bard, 1978, Anal. Chem., 50(11), стр. 14871489). В другом методе наносимая текучая среда или гель представляет собой образец, содержащий исследуемый аналит, и образец наносится на приготовленную поверхность PMAMS. В одном предпочтительном примере капилляры,содержащие гидрофильные растворы, могут использоваться для осаждения раствора на дискретные участки, создавая гидрофильные домены, окруженные гидрофобными областями. С другой стороны, гидрофобные связывающие домены, окруженные гидрофильными областями, могут использоваться с гидрофобной текучей средой, содержащей связывающие реагенты или аналит (-ы). "Гидрофобный и гидрофильный" являются относительными понятиями, по отношению друг к другу и/или по отношению к наносимому образцу то есть, может регулироваться распространение или смачивание текучей 28 средой или гелем образца, наносимого на связывающие домены. Далее, регулируемое нанесение раствора из микрофлюидальной матрицы может быть осуществлено с использованием физических особенностей поверхности (например, лунки или каналы на поверхности). Микрофлюидальные подающие трубочки могут быть включены в кассету, или, более предпочтительно, использоваться для нанесения специфических реагентов на подложку перед использованием. Больше чем один связывающий химический агент может быть нанесен на ту же самую поверхность подложки и/или, может быть создана поверхность как с гидрофильными, так и с гидрофобными связывающими доменами с использованием многочисленных штампов. Например, участок, где желательно, чтобы гидрофильный связывающий домен был в положении 1, а гидрофобный связывающий домен в положении 2 может быть приготовлен следующим образом. Делается первый гидрофильный штамп, который имеет диск в положении 1 и больший круг в положении 2. Второй гидрофобный штамп делается с диском в положении 2, который подгоняется внутри круглого монослоя, оставленного штампом 1. Наконец, поверхность промывается гидрофобным раствором компонентов монослоя. В частности, поверхность PMAMS производится микроконтактной печатью, то есть штамповкой. Монослой, приложенный таким образом, состоит из связывающихся с поверхностью групп, например, для золотой поверхности предпочтительно использовать тиольную группу с алкановым спейсером (например, (CH2)n). Спейсерная группа связывается (предпочтительно ковалентной связью) с линкерной группой А. Группой "А" может быть, например, авидин, стрептавидин или биотин или любой другой подходящий связывающий реагент с доступным комплементарным связывающимся партнером "В". Связь А:В может быть ковалентной или нековалентной, и некоторые связывающие химические агенты, известные специалистам, которые можно использовать, раскрытыBard и соавт., (в патенте США 5,221,605 и 5,310,687). "В" далее связывается со связывающим реагентом, таким, как антитело, антиген,нуклеиновая кислота, фармацевтическое или другое вещество, подходящее для формирования связывающего домена, который может связываться с одним или несколькими из исследуемых аналитов в испытуемом образце. Группа В может также быть связана с ECL-ТАG или меткой. Сшивающая группа В может подаваться в монослой SAM посредством капилляра или матрицы микрофлюидальных подающих трубочек (фиг. 5 А-5 В), способных поместить множество реагентов "В" с различными специфичностями к связывающим поверхностям на связь"А" монослоя. А и В могут быть также связаны 29 прежде, чем прикрепиться к монослою. Как уже обсуждалось, на фиг. 5 А, представлены формы независимых связывающих доменов, просто в целях иллюстрации, в виде геометрических форм 602, чтобы показать, что на одной подложке 600 могут присутствовать элементы с различными специфичностями связывания. Фиг. 5 Б представляет вид сверху матрицы 606 микрофлюидальных трубочек (например, капилляров). Пятнышки 610 представляют собой микрофлюидальные трубочки в поперечном сечении. Фиг. 5 В представляет вид сбоку матрицы 608 микрофлюидальных трубочек. Линии, изображенные сверху вниз являются отдельными микрофлюидальными трубочками 610. Геометрические формы 612 на нижней плоскости представляют характерные связывающие домены, образованные при нанесении связующих реагентов из каждого отдельного капилляра. Например, после первой штамповки, обсуждаемой ниже, области голой поверхности(например, золотой) могут реагировать со вторым алкантиолом, который не имеет сшивающую химическую группу А и по своим свойствам гидрофобности /гидрофильности противоположен первому верхнему монослою. Таким образом, на поверхности формируются специфически связывающиеся домены. Связывающий реагент, который является специфичным для одного исследуемого аналита,может использоваться для каждого связывающего домена, либо может использоваться такой связующий реактив, который специфически связывается с многочисленными аналитами,представляющими интерес. Еще в одной модификации поверхность подложки может быть проштампована многократно материалами (например, связующими реактивами, ECL-метками, SAM), имеющими различные химические сшивающие агенты и/или связующие составляющие, как показано выше на фиг. 5 А. Связывающие конфигурируемые реагенты могут быть стабильными и/или стойкими химическими группами (например, переносящими условия, которым они подвергаются), которые позже соединяются с менее стабильными или стойкими связывающими группами. Многочисленные связывающие соединения могут быть использованы для оптимизации условий каждой стадии в получении PMAMS-поверхности и/или для облегчения получения PMAMS поверхностей. Например, первая PMAMS поверхность может быть изготовлена обычным способом и затем модифицирована для создания различныхPMAMS поверхностей. В другом примере,обычная PMAMS поверхность может вступать в реакцию со смесью растворов связывающих реагентов, которые сами по себе содержат связывающие домены, направляющие их к конкретным областям (например, к связывающим доменам) на PMAMS поверхности. Например, 001198 30 конфигурация связывающих доменов, каждый из которых представляет различную олигонуклетидную последовательность, присоединяется к поверхности. Эту поверхность затем обрабатывают раствором, содержащим смесь вторичных связывающих реагентов, каждый из которых присоединен к олигонуклеотидной последовательности, комплементарной последовательности, присутствующей на поверхности. Таким образом, может быть достигнуто конфигурирование этих вторичных связующих элементов. Предпочтительно, олигонуклеотидные последовательности представляют собой 6-30 меры ДНК. Некоторые наборы из 6-30 мерных последовательностей могут содержать в основном комплементарные последовательности,чтобы приближенные константы связывания для гибридизации были подобны в пределах данного набора и заметно отличимы от менее комплементарных последовательностей. В другом варианте осуществления изобретения вторичные связующие элементы представляют собой белки (например, антитела). Способы, описанные для ингибирования смачивания или растекания нанесенных на поверхность реагентов образца, как описано в части 5.13 ниже, могут также использоваться в приготовлении PMAMS (и/или в прикладывании образца). Приложенный потенциал (например, от пары электрод/противоположный электрод) может использоваться для последующего регулирования осаждения и/или распыления реагентов и/или образцов (см., например,Abbott и соавт., 19894, Langmuir, 10(5), стр. 1493-1497).PMAMS-связывающие реагенты могут быть расположены на материалах, которые содержат углерод. Они могут также быть расположены на отдельных углеродных фибриллах,либо PMAMS-связывающие реагенты могут быть расположены на агрегатах из одной или более фибрилл. Во многих вариантах воплощения связующие PMAMS реактивы могут быть расположены на суспензиях одной или более фибрилл, дисперсиях фибрилл, смесях фибрилл с другими материалами (описано на примере выше), а также их комбинаций.PMAMS-cвязывающие реагенты могут быть расположены на множестве отдельных фибрилл и/или на агрегатах фибрилл, расположенных на подложке или в подложке или возле подложки. В одном из примеров, связующие реактивы расположены на рассеянных отдельных тонких фибриллах или агрегатах фибрилл. Эти фибриллы или агрегаты фибрилл могут быть пространственно локализованы в отдельных доменах на подложке, и могут составлять связывающие домены, как определено в настоящем описании. В другом примере, отдельные такие связывающие домены или множество таких связывающих доменов расположены в пространственно разделенных областях подложки. В не 31 ограничивающем примере отдельные такие связывающие домены или скопления связывающих доменов могут быть расположены в углублениях, ямках и/или отверстиях в подложке. В еще одном примере, отдельные связывающие домены или множество доменов могут находиться в каплях воды, гелях, эластомерах, пластмассах,маслах, и т.д., которые локализованы на поверхности подложки. Еще в одном примере,отдельные связывающие домены могут быть локализованы на подложке посредством покрытия (которое может быть конфигурировано),которое имеет различные аффинности связывания для различных связывающих реагентов и/или связывающих комплексов реактив/фибрилла. Связывающие домены, если необходимо,могут располагаться на множестве отдельных фибрилл, и/или агрегаты фибрилл могут быть приготовлены на подложке посредством одной или более жидкостных подающих трубочек (например, капилляра). Различные или идентичные связывающие реагенты могут находиться в или на множестве жидкостных подающих трубочек,и/или многочисленные отдельные связывающие агенты могут находиться в или на заданной жидкостной подающей трубочке. Капилляры могут быть приведены в контакт с подложкой точечным нанесением и/или через них могут подавать реактивы, в то время как либо микрофлюидальная подающая трубочка, и/или поверхность сканируется или перемещается друг относительно друга (то есть, способ нанесения,подобно письму ручкой). Жидкостная подающая трубочка может подавать связывающие реагенты, расположенные на фибриллах, к подложке так, чтобы некоторые области подвергались воздействию волокно-связующего комплекса реагента в целях создания дискретного связывающего домена(-ы). В предпочтительном аспекте различные связывающие реагенты, каждый из которых находится в различных жидкостных подающих трубочках, подаются одновременно из этой направляющей матрицы трубочек на подложку. В одном из примеров, связывающие реагенты и/или фибриллы, на которых они локализуются, подвергают дериватизации с помощью химической функциональной группы, которая образует связь (например, ковалентную или нековалентное взаимодействие) с поверхностью подложки. В некоторых вариантах связывающие реагенты и фибриллы нехарактерно связаны или адсорбируются на поверхности. Еще в одном аспекте, связывающие реагенты, локализованные на фибриллах, могут подаваться в углубления, лунки и/или отверстия в поверхности подложки. В другом примере, связующие реактивы подаются на поверхность, которая покрыта материалом, имеющим более сильную или более слабую аффинность связывания, для некоторых связывающих реагентов или связующих ком 001198 32 плексов реактив/фибрилла, в результате чего создаются домены реагентов, которые локализованы по всему пространству и отдельно от других связывающих реактивов. Связывающие реагенты локализованы на одной или более отдельных фибрилл или агрегатах фибрилл, которые являются магнитными. В таком случае, магнитная подложка может притягивать к подложке связывающие реагенты,локализованные на магнитных фибриллах. Подложка может содержать несколько раздельных областей, которые являются магнитными и окруженными областями, не являющимися магнитными. Связывающие реактивы,локализованные на магнитных фибриллах, могут быть локализованы на магнитных областях подложки. В одном из примеров, подложка может содержать одну или более раздельных областей, которые являются магнитными, и окружены областями, которые являются немагнитными, а напряженность магнитного поля в магнитных областях может модулироваться или переключаться. В этом аспекте использование такого модулируемого или переключаемого магнитного поля способствует присоединению или освобождению связывающих реагентов,локализованных на фибриллах, от поверхности подложки, что дает возможность размешивать или смешивать упомянутые домены. Вообще говоря, имеется от 2 до 10 связывающих доменов и, предпочтительно, от 25 до 500 доменов. Связывающие домены могут быть расположены на рабочем электроде и/или противоположном электроде. Различные варианты, описанные здесь для различных типов PMAMS, подложек, электродов и их конфигураций, могут быть также реализованы в комбинации друг с другом. Подложки РМАМS могут быть помещены на хранение (например, посредством защитных поверхностных покрытий, сушки поверхности,прочной упаковки в вакууме или в инертной атмосфере, охлаждения, и другими способами) для последующего использования. 5.2. Связывающие реагенты. Связывающие домены настоящего изобретения получают таким образом, чтобы они содержали связывающие реагенты, которые специфически связываются, по крайней мере, с одним исследуемым аналитом (лигандом). Связывающие реагенты в дискретных связывающих доменах отбираются так, чтобы связывающие домены имели нужную специфичность связывания. Связывающие реагенты могут быть отобраны из числа любых молекул, которые, как известно, способны или предположительно способны специфически связываться с исследуемым аналитом. Исследуемый аналит может быть выбран из числа тех, которые описаны в разделе 5.10 ниже, "анализ ЕСL, который может быть проведен". Так, например, связывающими 33 реагентами являются, но не ограничиваются ими: рецепторы, лиганды для рецепторов, антитела или их связывающие части (например, Fab,(Fab)'2), белки или их фрагменты, нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды, гликопротеины,полисахариды, антигены, эпитопы, клетки и клеточные компоненты, субклеточные частицы,составляющие углеводов, ферменты, ферментные субстраты, лектины, белок А, белок G, органические соединения, металлоорганические соединения, вирусы, прионы, вироиды, липиды,жирные кислоты, липополисахариды, пептиды,клеточные метаболиты, гормоны, фармакологические агенты, транквилизаторы, барбитураты,алкалоиды, стероиды, витамины, аминокислоты,сахара, небиологические полимеры, биотин,авидин, стрептавидин, органические сшивающие соединения, такие, как полимерные смолы,липопротеины, цитокины, лимфокины, гормоны, синтетические полимеры, органические и неорганические молекулы, и т.д. Нуклеиновые кислоты и олигонуклеотиды можно относить к ДНК, РНК и/или олигонуклеотидным аналогам,включая, но не ограничиваясь следующими: олигонуклеотиды, содержащие модифицированные основания или модифицированные сахара, олигонуклеотиды, содержащие основные химические, отличные от фосфодиэстерных связей (см., например, Nielsen, P.E. (1995) AnnuRev, Biophys. Biomcl. Street. 24, стр. 167-183),и/или олигонуклеотиды, которые были синтезированы или модифицированы для введения химических групп, которые могут быть использованы для образования связей (ковалентных или нековалентных) с другими молекулами (где мы определяем нуклеиновую кислоту или олиго(нуклеотид), как содержащий два или более нуклеотидных основания и/или производные нуклеотидных оснований). Поверхность РМАМS настоящего изобретения может иметь множество дискретных связывающих доменов, которые включают, по крайней мере, один связывающий домен, содержащий связывающие реагенты, которые идентичны друг другу и по своей специфичности отличаются от связывающих реагентов, содержащихся в других связывающих доменах, в результате чего обеспечивается связывание различных исследуемых аналитов различными связывающими доменами. Например, такая(TSH); связывающий домен, содержащий олигонуклеотид, гибридизирующийся с вирусом гепатита C(HCV); связующий домен, содержащий олигонуклеотиды, гибридизирующийся с вирусом иммунодефицита человека, ВИЧ (HIV); связывающий домен, содержащий антитело к ВИЧ-белку или гликопротеину, связывающий домен, содержащий антитело к антигену, специфичному для предстательной железы (PSA); и связывающий домен, содержащий антитело к 34 вирусу гепатита В (HBV); или любую их субпопуляцию. Поверхность PMAMS может иметь множество дискретных связывающих доменов, которые включают, по крайней мере, один связывающий домен, содержащий связывающие реагенты, которые отличаются по своей специфичности связывания, так, что один связывающий домен может связывать многочисленные исследуемые аналиты. Например, такая РМАМS включает связывающий домен, содержащий как антитело к рецептору Т-клеточного антигена,так и антитело к антигену Т-клеточной поверхности, такому как CD4 [антигенный маркер хелперных Т-лимфоцитов]. Поверхность PMAMS может иметь множество дискретных связывающих доменов, которые включают (i) по крайней мере, один связывающий домен, содержащий связывающие реагенты, которые идентичны друг другу и которые по своей специфичности отличаются по крайней мере, от одного из связывающих реагентов, содержащихся в других связывающих доменах; и (ii) по крайней мере, один связывающий домен, содержащий связывающие реагенты, которые отличаются по специфичности связывания. Например, изготавливают РМАМS,которая имеет а) по крайней мере, один связывающий домен, содержащий связывающие реагенты единого свойства, например, антитело к рецептору Т-клеточного антигена (например, к-, -рецептору Т-клеточного антигена, или к -,-рецептору Т-клеточного антигена), благодаря чему, по крайней мере, один связывающий домен связывает все клетки, экспрессирующие этот рецептор Т-клеточного антигена; и (б) по крайней мере, один связывающий домен, содержащий два различных связывающих реагента, например, антитело к рецептору Тклеточного антигена и антитело к CD4, благодаря чему, по крайней мере, один связывающий домен связывает CD4+-T-лимфoциты, экспрессирующие этот рецептор Т-клеточного антигена(то есть, субпопуляцию Т-лимфоцитов). В другом варианте осуществления изобретения, по крайней мере один связующий домен содержит связывающие реагенты, которые являются различными молекулами, но которые имеют одинаковые специфичности связывания(например, связывающие реагенты, такие как эпидермический фактор роста и антитело против рецептора эпидермического фактора роста). Множество связывающих реагентов могут быть выбраны так, что даже если связывающие реагенты отличаются друг от друга, и имеют различные специфичности связывания, то они будут распознавать один и тот же аналит (в альтернативном варианте, они будут распознавать различные аналиты). Так, например, если аналит имеет многочисленные связывающие компоненты (например, клетку, которая имеет раз 35 личные антигены поверхности клетки), то различные связывающие реагенты, которые связываются с различными связывающими компонентами, будут распознавать один и тот же аналит. Или, например, антитела к различным антигенам поверхности клетки на одной клетке, будут распознавать ту же клетку. И еще один пример,антитела к различным эпитопам одного антигена могут быть использованы в качестве связывающих реагентов для распознавания антигена. В еще одном варианте осуществления изобретения только тот связывывающий реагент(ы), который специфически связывает один исследуемый аналит, находится в одном или более связывающих доменов. Альтернативно, связывающие реагенты, которые специфически связывают больше чем один исследуемый аналит,находятся в одном или более связывающих доменах (например, перекрестно реагирующее антитело). В конкретном проекте могут использоваться связывающие реагенты, которые связываются с классом аналитов, имеющих, например, подобные свойства. Связывающие домены могут также быть включены в поверхность PMAMS, которая содержит связывающие реагенты, являющиеся специфичными для нужного стандартного аналита, и использующиеся в качестве внутреннего стандарта (например, связующий домен, который может контактировать с образцом, содержащим определенное количество аналита, с которым связываются связывающие реагенты). Многочисленные связывающие домены, содержащие связывающие реагенты, специфичные для одного и того же аналита(-ов), могут также быть включены в поверхность РМАМS так,чтобы сделать возможным статистическое усреднение аналитических результатов. Связывающие реагенты могут быть не только специфичными для одного и того же аналита, но могут быть и идентичными, распознавая тем самым одну и ту же связывающую часть на аналите. Таким образом, может быть получено множество связующих доменов (например, в диапазоне от 2 до 108), которые специфически связываются с одной и той же связывающей частью,так, чтобы данные электрохемилюминесценции(ECL) могли быть статистически усреднены для контроля за вариациями и для повышения точности. Множество связывающих доменов на поверхности PMAMS может быть специфичными для контрольного аналита или исследуемого аналита, или для обоих, на одной подложке. В качестве другого примера, может быть получен один или более дискретных связывающих доменов с известной начальной величиной концентрации ECL-меток. Встроенный ECLслой служит в качестве контроля для отслеживания, например, деградации метки и температурных эффектов. Можно использовать связывающий реагент, который является ферментом, специфич 001198 36 ным для субстрата (упомянутый субстрат является исследуемым аналитом), где продукт ферментативной реакции на подложке является агентом-"репортером" (агент, который можно обнаруживать), например, продукт, который стимулирует ECL-реакцию: флуоресцентная молекула; субстрат, который изменяет цвет после контакта с соответствующим ферментом (например, хромогенный субстрат для пероксидазы хрена), и т.д. Например, в таком варианте осуществления, ферментом, используемым в качестве связывающего реагента, может быть глюкозодегидрогеназа GDH), которую можно использовать для обнаружения или измерения глюкозы в образце. ECL-метка располагается внутри или возле связующего домена, содержащего GDH. Никотинамидадениндинуклеотид(NADH) продуцируется посредством действия ферменте на глюкозу, NADH способен вступать в реакцию с ECL-метками для стимулированияECL (Martin и соавт., 1993, Anal.Chim. Acta, 281,стр. 475). Связывающие домены, содержащие связывающие реагенты, которые увеличивают фоновое связывание (то есть, которые связываются со связывающим участком, присутствующем на исследуемом аналите, а также на других аналитах в образце), могут использоваться для увеличения отношения сигнал/шум во время детектирования или измерения электрохемилюминесценции. Так, например, если исследуемый аналит представляет собой определенную субпопуляцию клеток (например, CD4+-клeтки), а образец является жидким, например, кровь, которая содержит клетки пациента, то в качестве связывающего реагента может быть использовано антитело против сиаловой кислоты для того,чтобы увеличить фоновую связь фактически со всеми клетками в образце (так как сиалокислота является компонентом фактически всех гликопротеинов поверхности клетки), а затем в качестве связующего реактива (в одном и том же или в другом связующем домене, поскольку он содержит антитело против сиаловой кислоты) может быть использовано антитело к поверхностному антигену клетки, специфичному для данной клеточной субпопуляции (например,антитело против CD4). 5.3. Форма кривой напряжения. Форма кривой напряжения (изменение электрического потенциала в зависимости от времени), прилагаемого к множеству пар электрод/противоположный электрод ЕСL - камеры,должна быть достаточной, чтобы вызвать ЕСLреакцию. Эта форма кривой напряжения обычно бывает в виде однородной развертки напряжения, начинающейся с первого напряжения, перемещающейся равномерно ко второму напряжению, перемещающейся обратно через первое напряжение к третьему напряжению и затем возвращающейся опять к первому напряжению. 37 Например, форма кривой напряжения может начинаться в первом напряжении в диапазоне от 0,5 до 0,5 В, вплоть до второго напряжения в диапазоне от 1 до 2,5 В, и перемещаясь назад через первое напряжение к третьему напряжению, находящемуся в диапазоне от 0,0-до -1 В. Если взять другой пример, для более простых волн, то напряжение может изменяться от 0,0 до+3,5 В и до 0,0 В. Формы кривой напряжения могут включать зависимости с линейным наклоном, ступенчатые функции и/или другие функции. Формы кривой напряжения могут включать периоды времени, в течение которого напряжение остается установившимся на одном потенциале. Приложенный потенциал может управляться относительно одного или более электродов сравнения или, можно вообще не использовать электроды сравнения. Кроме того,может использоваться отрицательный потенциал. Таким образом напряжения, используемые для того, чтобы стимулировать ECL-эмиссию из кассеты настоящего изобретения, будут легко подобраны для оптимальной интенсивности сигнала ЕСL и оптимальных характеристикECL-метки и анализируемой среды. В некоторых применениях напряжение предпочтительно изменяется по мере того, как измеряется свет, испускаемый из связывающего домена. Особенно важно определить пороговое значение электрического поля, необходимого для того, чтобы заставить связывающий домен испускать свет. В этом случае электрический потенциал, прикладываемый к связующему домену, начинается со значения, которое, как надеются, ниже порога, требуемого для испускания света, и делается первое измерение испускаемого света. Если световой сигнал не зарегистрирован, или если световой сигнал - ниже заданного порога, то электрический потенциал,прикладываемый к паре электродов, увеличивается под управлением компьютера так, как это делается при компьютерном управлении источником напряжения или других измерениях света. Этот процесс может повторяться до тех пор,пока не будет получено заданное подходящее количества света. Таким образом, прикладываемое напряжение может использоваться в качестве сигнала анализа. ЕСL сигнал можно генерировать от переменного напряжения, приложенного к электродным парам. Обычный техник, который знаком с установками напряжения и тока, как раскрыто, например, в патентах США 5,324,457 и 5,068,088, будет способен легко выбрать оптимальные значения рабочих напряжений и развертку напряжения для стимуляции ECL-эмиссии. Потенциал, требуемый для генерации ECL,может генерироваться посредством освещения поверхности рабочего электрода, если рабочий электрод является полупроводником или содер 001198 38 жит другую составляющую, которая генерирует электрический ток в ответ на действие света. 5.4. Электроды раздельного доступа и способы их использования. Для раздельного доступа к множеству пар электрод/противоположный электрод могут использоваться многочисленные способы. Фиг. 14-18 иллюстрируют несколько таких иллюстративных методов. Для примера эти фигуры изображают четыре пары электрод/противоположный электрод 101, 102, 103, 104 и генератор сигналов специальной формы, который обычно является цифровым компьютером и который предпочтительно является тем же самым компьютером, который используется для обработки ЕСL, обнаруженной средством детектирования. На фиг. 14 каждая пара электрод/противоположный электрод 101-104 имеет отдельный доступ посредством пары линий, связанных с генератором сигналов. Например, линии 105,106 обеспечивают доступ к паре электрод/противоположный электрод 101. Соответствующий сигнал может прикладываться генератором сигналов в любой заданный момент времени к любой одной или более пар линий,соединенных с различными парами электрод/противоположный электрод. Чтобы уменьшить число связей, требуемых, чтобы обеспечить раздельный доступ к электродным парам, обеспечиваются варианты,альтернативные к схеме прямого соединения фиг.14. Например, фиг. 15 иллюстрирует схему раздельного доступа к элементам строки/столбца, для подачи электроэнергии к некоторым или ко всем электродам. В этой схеме один из электродов 201, 202 в каждом столбце из множества пар электрод/противоположный электрод связан с общим электрическим проводом 205 на подложке 200, и каждый из противоположных электродов в каждой строке из множества пар электрод/противоположный электрод связан с проводом 207, 208 на подложке 200. Провода 205,206 соединяются с соединениями С 1, С 2, соответственно, на краю подложки 200, и провода 207, 208 соединяются с соединениями R1, R2,соответственно. Каждое из этих соединений потом соединяется отдельной линией с генератором волновой формы. В результате, в конфигурации фиг. 15 количество требуемых связей и сигнальных линий из генератора импульсов уменьшилось с 8 до 4. Чтобы сделать возможной быструю и последовательную подачу энергии каждой электродной паре, предпочтительно использовать переключающее устройство, управляемое компьютером. Конфигурация, представленная на фиг. 16 изображает множество электродов, соединенных с первым мультиплексором [устройство уплотнения/разуплотнения линий связи] 310. Множество противоположных электродов соединяется со вторым мультиплексором 320. 39 Первый мультиплексор также соединяется с первым полюсом источника напряжения 330,который обычно подает электрический потенциал, изменяемый во времени, описываемый ниже. Второй мультиплексор, также соединяется со вторым полюсом источника напряжения. Используя линии доступа А 0-А 3, электрически соединенные с каждым из мультиплексоров и соединенные со схемой защелки 340, процессор компьютера 350 может управлять мультиплексорами, чтобы они выборочно соединяли любой или все первые электроды к первому полюсу источника напряжения, и любой или все вторые электроды к второму полюсу источника напряжения. Как показано на фиг. 17, множество источников напряжения соединяется через отдельные наборы мультиплексоров с каждым из электродов. Если первый электрический потенциал или область значений электрических потенциалов запрашивается на конкретную электродную пару, то мультиплексоры 410, 420, соединенные с источником напряжения 430, обеспечивающим этот потенциал, адресуются процессором компьютера 350, обычно через схему защелки 340,таким образом присоединяя этот конкретный источник напряжения к рассматриваемой паре электродов. Если отличающийся электрический потенциал или область значений электрических потенциалов требуется для другой электродной пары, то мультиплексоры 440, 450, связанные с тем отличающимся источником напряжения 460, адресуются процессором компьютера, таким образом соединяя этот источник напряжения через связанные мультиплексоры 440, 450 к паре электродов. Если матрица электродов в этом варианте осуществления изобретения имеет, по крайней мере, часть электродных пар, независимо приводимых в действие, как показано на фиг. 14 или 15, то тогда, например, одну электродную пару можно приводить в действие одним источником напряжения, в то время как другая электродная пара одновременно приводится в действие другим источником напряжения. С другой стороны, два источника напряжения фиг. 17 могут быть заменены одним источником напряжения, соединенным параллельно с обоими наборами мультиплексоров, позволяя приводить в действие две электродных пары из того же источника напряжения. Вместо двойного набора мультиплексоров для каждого источника напряжения, как показано на фиг. 17, можно обеспечить множество источников напряжения 520, 530, как показано на фиг. 18. Эти источники напряжения могут быть соединены посредством электрического переключателя 510, управляемого компьютером, или переключателями к отдельному набору мультиплексоров 310, 320. Как показано на фиг. 18, компьютер направил бы переключатель 510,чтобы соединить конкретный источник напря 001198 40 жения с мультиплексорами, и также направил бы мультиплексоры (сообщая их адресные линии А 0-А 3), чтобы соединить выбранный источник напряжения с конкретной желательной электродной парой. С другой стороны, электрический потенциал, прикладываемый к каждой из электродных пар в любом варианте может быть изменен. Это особенно выгодно, когда используется кассета, имеющая множество различных связывающих доменов. Такая кассета может требовать различной области значений прикладываемого электрического потенциала в различных связывающих доменах. Рассматривается несколько различных вариантов, способствующих изменению электрического потенциала, приложенного к каждому электроду. Предпочтительно, если можно использовать источник напряжения, управляемый компьютером. Это такой источник, который может управляться компьютером в целях отбора конкретного электрического потенциала, который будет подан. С другой стороны, он может быть запрограммирован на последовательное приложение электрических потенциалов в конкретном интервале в течение заданного времени. В такой системе адресные линии, электрически соединенные с компьютером и источником напряжения, позволяют компьютеру программировать источник напряжения так, чтобы он производил конкретный электрический потенциал, который нужно прикладывать к электродной паре, чтобы подавать ей энергию. Можно также использовать дополнительные способы для адресации множества электродных пар. Например, можно поместить множество контрольных электродов вплотную к каждому из множества пар электрод/противоположный электрод, чтобы они воспринимали напряжение, приложенное к ним. Таким образом можно осуществить дополнительное управление формой сигнала напряжения. Фиг. 36 изображает другой вариант осуществления изобретения; матрицы электродов(3600, 3601) поддерживаются на каждой из двух поверхностей (3602, 3603), отделенных конфигураций зазоров в изоляторе 3604 (например,пластмассовый лист с перфорированными отверстиями 3605). Каждый электрод может пересекать множество зазоров. Если потенциал прикладывается между одним электродом на каждой поверхности, то ток может проходить только через зазор, контактирующий с обоими электродами, таким образом ограничивая местоположение любого процесса электрохимической реакции или ECL, которые могут происходить. В предпочтительном варианте изобретения, показанном на фигуре, электроды (3600, 3601) представляют собой матрицы линий на подложке. Два набора электродов на двух поверхностях ориентированы перпендикулярно друг к другу. Зазоры в изолирующем листе расположены 41 только в местах пересечения электродов с каждой поверхностью. Этот вариант изобретения имеет то преимущество, что он требует меньше электрических проводов для раздельного доступа к электродным парам. В другом варианте изобретения, изолятор 3604 опускается, и поверхности помещаются вплотную так, чтобы только узкий зазор оставался между двумя поверхностями. В этом варианте изобретения потенциал, приложенный между электродами, находящимися на каждой поверхности, будет преимущественно вызывать ток, проходящий в местах пересечения электродов (то есть, где расстояние между электродами минимально), ограничивая, тем самым, локализацию любого процесса электрохимической реакции или ECL, которые могут происходить. 5.5. Детектирование света. Свет, генерированный посредством стимуляции ECL-эмиссии, детектируется подходящим или расположенными возле устройства настоящего изобретения. Световым детектором может быть, например, пленка, фотоэлектронный умножитель [ФЭУ], фотодиод, лавинный фотодиод, прибор с зарядовой связью (ПЗС, "CCD") или другой световой детектор или камера. Световой детектор может быть отдельным детектором для детектирования последовательных эмиссий, или он может состоять из множества(набора) детекторов, чтобы детектировать и пространственно разрешать одновременные эмиссии на одной или многих длинах волн испускаемого света. Испускаемый и детектируемый свет может быть видимым светом или может испускаться как невидимое излучение, такое как инфракрасное или ультрафиолетовое излучение. Детектор или детекторы могут быть неподвижными или подвижными. Испускаемый свет или другое излучение может проводиться к детектору или детекторам посредством линз,зеркал и волоконнооптических световодов или кабелей световодов (одиночных, многожильных, фиксированных или подвижных), помещенных на или смежных со связующей поверхностью кассеты, или детектор может прямо принимать свет. Кроме того, подложки, поверхности PMAMS и поверхности электрода сами по себе могут использоваться для напряжения или пропускания света. Поверхность РМАМS может быть сформирована на поверхности множества детекторов света так, чтобы каждый детектор принимал свет только от одного связывающего домена. Матрица детекторов света может быть ПЗС чипом [микросхемой], и связывающие домены могут быть связаны (используя стандартную химию связывания) с поверхностью полупроводникового прибора. Капли, нанесенные на связывающие домены, или возле них, на вторую поверхность, могут использоваться как микролинзы, для регу 001198 42 лирования или направления испускаемого света. Альтернативно, детектор света может ориентироваться прямо перед кассетой; а различные устройства, фокусирующие свет, такие как параболические отражатели или линзы могут применяться вместо световодных кабелей, чтобы направлять свет от любого множества связывающих доменов к детектору. Свет, испускаемый, по крайней мере, из двух дискретных связывающих доменов, может быть измерен одновременно или последовательно. Ошибка из-за теплового дрейфа, старения устройства, или собственные электрические шумы в световых детекторах могут управляться с помощью средства "прерывателя" между световым измерительным прибором и измеряемым связывающим доменом. Прерыватель может быть любым из обычных механических прерывателей, хорошо известных специалистам, таких как крутящийся диск с щелями или вырезами,которые позволяют проходить свету. Альтернативно, свет может прерываться затвором LCD[жидкокристаллическим затвором, ЖК-затвором], массивом из ЖК-затворов, твердотельных оптического модулятора или оптических модуляторов или подобных. Альтернативно, может использоваться плоский массив ЖК-затворов или твердотельных световых оптических модуляторов типа известных в технике оптических вычислений. Эти устройства предпочтительно располагаются между плоскостью кассеты и световода (или световодов) или светофокусирующих приборов, которые направляют свет из связывающих доменов в детектор света. В одном из вариантов изобретения, затвор располагается выше каждого из связывающих доменов. При использовании ЖК-затвора или оптического модулятора затворы могут модулироваться на различных частотах, чтобы одновременно обеспечить различные скорости прерывания для различных связывающих доменов, испускающих свет. При использовании этого метода множество различных световых сигналов могут накладываться и одновременно измеряться одним детектором. Электронный полосовой фильтр, электрически соединенный со световым детектором, может потом использоваться для разделения одного электрического сигнала на несколько электрических составляющих, каждая из которых соответствует одной из множества отдельных световых составляющих. Прерывая свет, как описано выше, или используя другой механизм, хорошо известный в технике, создается импульс света переменной составляющей(АС), что позволяет с помощью электроники отфильтровывать шумовую составляющую постоянного тока (DC). Также, ECL-сигнал может быть калиброван путем сравнения с результатами, предварительно определенными со стандартными реактивами, чтобы корректировать модуляцию сигнала из-за истощения реактива. 43 5.6. Анализ ECL-сигналов. Сигналы, исходящие от заданного связывающего домена, могут иметь определенный диапазон значений, и эти значения коррелируют с количественным измерением, что обеспечивает "аналоговый" сигнал. В другом методе "цифровой" сигнал получают от каждого домена, что свидетельствует о присутствии или отсутствии аналогов. Статистический анализ используется для обоих методов, а особенно для передачи множества цифровых сигналов так, чтобы обеспечить количественный результат. Некоторые аналиты,однако, требуют присутствия/отсутствия цифрового сигнала, указывающего на пороговую концентрацию. "Аналоговые" и/или "цифровые" представления данных могут использоваться отдельно или в комбинации. Можно использовать другие статистические способы для работы с PMAMS. Например, возможно создать градиенты концентрации PMAMS на поверхности(Chaudhury и соавт., 1992, Science (Наука), 256,стр. 1539-1541). Этот метод используется для того, чтобы определить концентрации посредством статистического анализа связывания в зависимости от градиента концентрации. Могут быть получены многочисленные линейные матрицы PMAMS с градиентами концентрации и с разнообразием различных специфических связывающих реагентов. Градиенты концентрации могут образовываться благодаря тому, что дискретные связывающие домены представляют различные концентрации связующих реактивов. Присутствие систем контроля анализа на связующей поверхности кассеты также важно для гарантии единообразия каждого анализа, в целях контроля изменения сигнала (например,изменения в результате деградаций, флуктуаций, старения кассет и других деталей, тепловых изменений, шумов в электронной схеме и шумов в фотодетекторе, и т.д.). Например, для одного и того же аналита могут использоваться многочисленные избыточные связывающие домены (содержащие идентичные связывающие реагенты или различные связывающие реагенты, которые характерны для одного и того же аналита). В другом примере, используются аналиты известной концентрации или используются контрольные домены поверхности PMAMS,которые ковалентно связаны с известным количеством ECL-метки или с известным количеством ECL-метки в растворе. Анализ, проводимый в соответствии с настоящим изобретением, позволяет быстро и эффективно собрать большое количество данных,которые могут быть сохранены, например, в виде базы данных, состоящей из совокупности клинической или исследовательской информации. Собранные данные могут также использоваться для быстрой судебной или персональной идентификации. Например, множество нуклеотидных зондов, после того, как они подверга 001198 44 лись воздействию образца ДНК человека, могут быть использованы в качестве ДНК-фингериринта, который можно легко использовать для идентификации клинических и исследовательских образцов. 5.7. Приготовление многоэлектродных матриц. Электроды, вообще говоря, могут составлять по диаметру или по ширине от 0,001 до 10 мм. Предпочтительный диапазон размеров электродных пар составляет от 0,01 до 1 мм (ширина, диаметр или самое широкое измерение зависят от геометрии электродных пар). Предпочтительно, электроды изготавливают из подходящих проводящих материалов,таких как прозрачные металлические пленки или полупроводники (например, золото или окись индия-олова, соответственно), хорошо известные в технике, например, для изготовления ЖКИ - жидких кристаллических индикаторов [дисплеев] и т.п. В кассете в собранном виде, между первой и второй подложками, остается место, достаточное для того, чтобы поместить туда анализируемый образец, например,тонкую пленку или смоченную поверхность. Электроды могут быть изготовлены из материалов, которые содержат углерод, углеродное волокно, углеродные нанометровые трубочки и/или их комбинаций. Электроды могут быть изготовлены из углеродных фибрилл. Одна или более отдельных фибрилл и/или одна или более совокупностей фибрилл, могут быть сформированы в больший агрегат совокупность (патент США 5,124,075). Этот больший агрегат представляет собой прослойку или сеть (в дальнейшем упоминается как "тонковолокнистая прослойка"), в которой фибриллы могут быть спутаны или переплетены. Тонковолокнистые прослойки обычно имеют поверхностную площадь между 50 и 400 м 2/г. Например, тонковолокнистая прослойка может использоваться как рабочий электрод,противоположный электрод или контрольный электрод в аналитической и/или препаративной электрохимии. В одном из примеров, тонковолокнистая прослойка используется как электрод для электрохемилюминесценции (ECL). Связывающие домены поверхности PMAMS могут поддерживаться тонковолокнистой прослойкой. Поверхность PMAMS настоящего изобретения имеет множество дискретных связывающих доменов, из которых два или более могут быть идентичны друг другу или могут отличаться. Тонковолокнистая прослойка поддерживает один или более связующих доменов. Для получения множества связывающих доменов на тонковолокнистой прослойке могут использоваться одна или более микрофлюидальных подающих трубочек. Различные или идентичные связывающие реагенты могут нахо 45 диться в множестве микрофлюидальных подающих трубочек, и/или многочисленные отличающиеся связывающие агенты могут находиться в микрофлюидальной подающей трубочке. Фиг. 22 А и 22 Б изображают множество микрофлюидальных подающих трубочек 2201,предпочтительно в матрице, которые используются для того, чтобы подавать, предпочтительно одновременно, на домены тонковолокнистой прослойки 2200 капли, содержащие желаемые связывающие реактивы, чтобы образовать дискретные связывающие домены 2202. Связывающие реагенты образуют связь с компонентами, находящимися на тонковолокнистой прослойке. Связующие реактивы могут нехарактерно адсорбироваться на прослойке или высыхать на поверхности. Желаемые связывающие реагенты подаются на тонковолокнистую прослойку во время вакуумной фильтрации, применяемой к прослойке. В этом случае, вакуумная фильтрация втягивает несколько-, ни одного-, или все связывающие реагенты в- или через прослойку, и при этом уменьшается величина бокового распространения связывающих реагентов на поверхности прослойки во время процесса конфигурирования. Тонковолокнистые прослойки приготавливаются посредством надавливания суспензий углеродных фибрилл на подложке, через которую может проходить жидкость суспензии (например, фильтр). Примерами фильтров, которые могут использоваться для образования тонковолокнистых прослоек, являются: фильтровальная бумага, фильтры, образованные из полимерных(например, нейлон) мембран, металлические микросетки, керамические фильтры, стеклянные фильтры, эластомерные фильтры, стекловолоконные фильтры и/или комбинации двух или более из таких материалов фильтра. Специалисту должно быть понятно, что эти материалы просто примеры многих возможных материалов, подходящих для фильтрации суспензий твердых веществ. Фиг. 23 А и 23 Б иллюстрируют вариант изобретения, в котором тонковолокнистые прослойки могут быть изготовлены посредством фильтрации под разряжением. Дисперсные системы и/или суспензии углеродных фибрилл 2301 фильтруют, используя фильтр 2300, оборудованный, но необязательно мембранным фильтром 2303 и/или фильтровальной подложкой 2302. Суспензию фильтруют, используя всасывание, прикладываемое источником вакуума 2305 к фильтру, например, колбой фильтра 2306. Тонковолокнистая прослойка 2304 собирается либо и на мембране фильтра 2303 и на подложке фильтра 2302, либо на чем-то одном из них. Тонковолокнистая прослойка 2304 с мембранным фильтром 2303, или без него, может быть снята с фильтра. 46 В другом варианте изобретения, суспензии фибрилл пропускаются через фильтр при помощи давления. В одном из примеров, давление подается на сжатую суспензию фибрилл, посредством уплотнения поршнем сжатого слоя воздуха и/или жидкости над суспензией. В конкретном примере, суспензия фибрилл набирается в шприц, поршень представляет собой поршень [плунжер] шприца, а фильтр представляет собой фильтр одноразового шприца (специалистам известно много таких фильтров). Суспензия фибрилл пропускается через фильтр посредством капиллярного действия или фильтруется посредством дренажа суспензии вили через фильтр. В другом варианте изобретения, отдельные фибриллы или агрегаты фибрилл ковалентной связью перекрестно связываются с прослойкой. Фибриллы дериватизируют с использованием фоточувствительных компонентов, которые полимеризуются под действием света. Фильтр может быть использован для захвата фибрилл в поры, в результате чего формируется составная прослойка, в которой фильтр действует как подложка. Фиг. 24 иллюстрирует, как может быть приготовлена тонковолокнистая прослойка 2400, а именно, путем пропускания жидкого раствора фибрилл 2401,подаваемого источником 2402, между двумя большими роликами 2403. В этом процессе, который может быть аналогичен процессам, используемым в изготовлении бумаги или полимерных листов, ролики выжимают жидкость из суспензии, в результате чего образуется большая, сплошная прослойка из фибрилл, из которой могут быть вырезаны меньшие прослойки. Тонковолокнистые прослойки могут быть свободными (например, неподдерживаемыми) или поддерживаемыми. Скорость фильтрации можно варьировать для достижения желаемых свойств прослойки. Такими свойствами, которые могут варьироваться, являются однородность или неоднородность структуры, степень спутанности фибрилл или агрегатов фибрилл, толщина, пористость прослойки и/или комбинацию этих свойств. Суспензия углеродных фибрилл зажимается, а жидкость, в которой фибриллы суспендированы, удаляется. В одном из примеров жидкости, в которой суспендированы фибриллы, выпаривают. В другом примере жидкость удаляют путем нагревания. Еще в одном примере суспензию подвергают центрифугированию, а полученную жидкость (например, супернатант) удаляют. В другом примере жидкость удаляют путем откачки. Суспензия может быть помещена в один или несколько фильтров, описанных ранее, и суспензию осушают путем выпаривания. Суспензия может быть осушена путем нагревания или обжигом в печи, либо жидкость может быть удалена путем вымораживания или экстрагиро 47 вания жидкости. Еще в одном примере жидкость удаляется откачкой насосом. Для удаления жидкости из суспензии могут быть использованы многие другие методы, которые хорошо известны специалистам. Суспензии фибрилл, подходящие для формирования тонковолокнистой прослойки путем фильтрации, могут быть получены путем диспергирования одной или более углеродных фибрилл в подходящей жидкости, полутвердом веществе или геле. Примерами подходящих жидкостей являются, но не ограничиваются ими, вода, этанол, метанол, гексан, метиленхлорид, буферные растворы, поверхностноактивные вещества [ПАВ], органические растворители, растворы, содержащие биологические среды (например, такие как: белки, антитела или их фрагменты, клетки, субклеточные частицы, вирусы, нуклеиновые кислоты, антигены, липопротеины, липосахариды, липиды,гликопротеины, углеводы, пептиды, гормоны или фармакологические агенты, растворы небольших молекул, полимерные предшественники, растворы кислот или щелочей, масел и/или их комбинаций). Суспензия фибрилл может быть приготовлена путем диспергирования углеродных фибрилл в водном растворе путем обработки ультразвуком. В другом варианте изобретения, можно добавлять поверхностно-активное вещество и/ или моющее средство. Тонковолокнистая прослойка, вообще говоря, может иметь толщину в диапазоне между 0,01 мкм и 10,000 мкм. В предпочтительных вариантах тонковолокнистая прослойка имеет толщину между 1 мкм и 100 мкм. В особенно предпочтительных вариантах тонковолокнистые прослойки находятся в диапазоне от 10 до 200 по ширине или диаметру. Тонковолокнистую прослойку можно неоднократно промывать и повторно фильтровать,чтобы удалить остаточные материалы, остающиеся от суспензии. Тонковолокнистые прослойки путем фильтрации или путем выпаривания нагревают(например, в печи) для удаления из суспензии остаточной жидкости, не удаленной при фильтрации. Последовательные стадии фильтрации могут использоваться, для получения прослойки из фибрилл, составленные из одного или более раздельных слоев, которые находятся либо в контакте или непосредственной близости к одному или более других слоев. Слои могут различаться по своим свойствам, включая, но не ограничиваясь ими, пористость, плотность,толщину, распределению размеров отдельных фибрилл и/или микроскопических агрегатов фибрилл, по типу, количеству и/или размерам тонковолокнистых агрегатов, по химической дериватизации фибрилл (см. ниже), и/или по 48 наличию других веществ, связанных с фибриллами. Фиг. 25 изображает многослойную тонковолокнистую прослойку 2500, приготовленную в последовательных стадиях фильтрации. Толстый слой 2501 толщиной от 0,5 до 100 мкм из плоских фибрилл образует первый слой; толстый слой 2502 толщиной от 0,5 до 10 мкм,включающий составляющие, такие как поли(этиленгликоли), которые устойчивы к адсорбции белков и других молекул, образует второй слой; толстый слой 2503 толщиной от 0,5 до 5 мкм, который включает один или более связывающих доменов (см. выше), содержит третий слой. Связывающие домены содержат одно или более антител 2504, которые могут связывать аналит 2505. Этот комплекс антитело/аналит может связывать меченное антитело 2506. Метка может быть ECL-меткой. В других вариантах меткой может быть одна или несколько из множества меток, описанных в другом месте в настоящем описании. Такая многослойная прослойка может быть автономной [свободной] или поддерживаться на одной из множества возможных подложек, описанных выше. Могут быть образованы многослойные прослойки, в которых имеются комбинации слоев, в которых некоторые или все слои могут быть различны. Фильтр, используемый для формирования тонковолокнистой прослойки, фибриллы и/или тонковолокнистая прослойка могут быть покрыты. В конкретных вариантах эти покрытия могут быть металлическими. Эти покрытия могут быть нанесены так, чтобы некоторые части были покрыты, а другие части - нет. В одном из примеров, покрытие наносится электроосаждением. В другом примере покрытие наносится электролизным осаждением. Фильтр покрывают металлом, и фибриллу дериватизируют с химической функциональной группой, которая образует связь с упомянутым металлом. Фильтр представляет собой металлический экран или металлический лист. Тонковолокнистая прослойка может быть плоской или искривленной, регулярной или нерегулярной, круглой, овальной, прямоугольной или одной из многих форм, жесткой или гибкой,прозрачной, полупрозрачной, частично или полностью непрозрачной и может иметь различные свойства или области с различными отдельными или сложными свойствами. Прослойка может быть диском или пластиной, вырезанной из листа. Множество тонковолокнистых прослоек может быть изготовлено, предпочтительно одновременно, и предпочтительно в матрице. В одном из примеров, матрица микрофлюидальных подающих трубочек образует множество тонковолокнистых прослоек на подложке, как описано выше. В другом примере, множество фильтров, или конфигурированный фильтр (на 49 пример, с областями различной пористости) используют для получения матрицы тонковолокнистых прослоек. Маска с множеством отверстий (например,экран) используется, чтобы покрыть некоторые части фильтра или подложки, и множество дискретных тонковолокнистых прослоек делаются одновременно или путем фильтрации и/или путем выпаривания. Тонковолокнистые прослойки могут иметь плотность от 0,1 до 3,0 г/см 2. Прослойка может иметь переменную плотность. Например, чтобы увеличить или уменьшить плотность, к прослойке в разное время могут прикладываться механическая сила или давление. Тонковолокнистые прослойки могут иметь поры. Эти поры могут простираться частично и/или полностью через прослойку или могут быть частью сети пор. Вообще говоря, эти поры могут иметь размеры в диапазоне от 50 до 1000 мкм. В предпочтительном варианте, тонковолокнистая прослойка имеет поры с размерами в диапазоне от 200 до 500 . Пористость прослойки может зависеть от плотности прослойки, наряду с другими факторами. Пористость прослойки может быть постоянна по всей прослойке или может увеличиваться или уменьшаться как функция положения в прослойке. Тонковолокнистая прослойка может иметь широкое разнообразие пор различного размера, распределенных хаотическим и/или случайным образом. Тонковолокнистая прослойка может содержать отличающиеся области различной пористости. Например, тонковолокнистая прослойка может иметь один или более слоев, каждый из которых имеет различную пористость. Тонковолокнистые прослойки могут иметь столбцы различной пористости, которые проходят через прослойку. Пористость прослойки может варьироваться путем включения различных количеств агрегатов углеродных фибрилл, где агрегаты имеют различный размер, форму, состав, или комбинации. В конкретном примере, прослойка приготовлена от отдельных фибрилл, СС фибрилл(описано выше) и BN фибрилл (описано выше),или различных комбинаций. Например, тонковолокнистая прослойка может иметь некоторые поры, которые являются достаточно большими,чтобы пропускать предметы такого размера, как биологические клетки; некоторые поры, которые могут пропускать биологические среды такого размера, как белки или антитела; некоторые поры, которые могут пропускать только небольшие (с молекулярной массой 1000) органические молекулы и/или их комбинации. Пористость прослойки может быть такой,что одна или более молекул, жидкостей, твердых тел, эмульсий, суспензий, газов, гелей и/или дисперсных систем могут диффундировать в-,внутрь- и/или через прослойку. Пористость тон 001198 50 коволокнистой прослойки такова, что биологические среды могут диффундировать (активно или пассивно) или вдавливаться определенным образом в прослойку, внутри прослойки и/или через прослойку. Примерами биологических сред являются, но не ограничиваются ими: цельная кровь, фракционированная кровь, плазма, сыворотка, моча, растворы белков, антитела или их фрагменты, клетки, субклеточные частицы, вирусы, нуклеиновые кислоты, антигены,липопротеины, липосахариды, липиды, гликопротеины, углеводы, пептиды, гормоны или фармакологические агенты. Тонковолокнистая прослойка может иметь один или более слоев различной пористости так, что материал может проходить через один или более слоев, но не через другие слои. Тонковолокнистая прослойка поддерживается материалом или на другом материале. Например, таким материалом подложки может быть металл, пластики, полимер, эластомер,гель, бумага, керамика, стекло, жидкость, воск,масло, парафин, органическое твердое тело, углерод или смесь двух или более каждого из материалов. Материал может быть твердым или жидким. Если он твердый, то он может содержать одно или множество отверстий или пор. В конкретных примерах, подложка может быть металлическим ситом, нейлоновой фильтровальной мембраной или фильтровальной бумагой. Подложка может быть проводником, полупроводником и/или диэлектриком. В варианте изобретения, раскрытом в патентах США 5,304,326 и 5,098,771, фибриллы могут быть диспергированы в другом материале. Например, фибриллы могут быть диспергированы в масле, воске, парафине, пластиках(например, (ABS), полистирол, полиэтилен, акрилонитрил, и т.д.), в керамике, тефлоне, полимерах, эластомерах, гелях и/или в их комбинациях. Проводится диспергирование фибрилл в других материалах. Дисперсии фибрилл в других материалах могут формоваться, прессоваться, отливаться, скручиваться, переплетаться и/или скручиваться для получения желаемой формы и/или вида. Тонковолокнистая прослойка может включать другой материал, например,тонкое волокно, чешуйки или металлические шарики для увеличения проводимости прослойки. В другом примере тонковолокнистая прослойка может включать другие углеродные,стеклянные и/или металлические волокна различных размеров, формы и плотности для создания пористости, отличной от той, которая может быть достигнута с одной фибриллой. В другом аспекте прослойка может включать магнитные шарики (например, шарики типа "DYNAL"). В последнем примере, шарики могут служить либо для изменения свойства прослойки, либо они могут быть самостоятельно использованы в качестве подложек для иммобилизации связывающих доменов. 51 Другие углеродные фибриллы (например,углеродные нанометровые структуры, углеродные структуры в виде нанометровых трубочек,фуллерены в виде сферических кластеров из 60 атомов углерода, фуллерены в виде трубчатых кластеров атомов углерода, фуллерены или их комбинации) могут использоваться вместо углеродных фибрилл. Углеродные фибриллы могут быть получены с использованием химических функциональных групп, ковалентно связанных с их поверхностью. Как описано в международной публикацииWO 90/14221, такими химическими функциональными группами являются,но не ограничиваются ими, следующие группы: СООН, ОН, NH2N - гидроксисукцинимид (NHS)- сложные эфиры, поли-(этиленгликоли), тиолы,алкильные группы СН 2)n) и/или их комбинации. Эти и другие химические функциональные группы могут использоваться для связывания других материалов с поверхностью фибрилл. Некоторые химические функциональные группы (например, СООН, NH2, SH, NHS сложные эфиры) могут использоваться для присоединения других небольших молекул к фибриллам. Имеется множество возможных комбинаций таких химических функциональных групп и небольших молекул. Во многих вариантах осуществления изобретения, NHS-сложноэфирные группы используются для присоединения других молекул или материалов, несущих нуклеофильную химическую функциональную группу (например,амин). В предпочтительном варианте, нуклеофильная химическая функциональная группа присутствует на и/или в биомолекуле, или натуральной и/или химически дериватизированной. Примерами подходящих биомолекул являются,но не ограничиваются ими: аминокислоты, белки и их функциональные фрагменты, антитела,связывающие фрагменты антител, ферменты,нуклеиновые кислоты и их комбинации. Этот метод является одним из многих возможных методов и, в общих чертах применим к материалам, приведенным в вышеуказанных примерах и многим другим аналогичным материалам и/или биомолекулам. В предпочтительном варианте реагенты, которые могут использоваться для ECL, могут быть присоединены к волокнам посредством NHS - сложноэфирных групп. Антитело, которое может использоваться вECL-анализе, может быть присоединено к одной или нескольким фибриллам посредством ковалентных связей (например, путем реакции сNHS - сложноэфирной группой), реакцией с соответствующим линкером (см. выше), путем неспецифического связывания, и/или их комбинацией. Нуклеиновые кислоты и/или клетки могут присоединяться к фибриллам или тонковолокнистым прослойкам посредством ковалентных связей с NHS - сложноэфирными группами, связанными с фибриллами. 52 Может оказаться предпочтительным регулировать степень неспецифического связывания материалов с фибриллами и/или прослойками из фибрилл. В качестве простого, но не ограничивающего примера, можно указать случаи, когда желательно уменьшать или предотвращать неспецифическую адсорбцию белков, антител,фрагментов антител, клеток, субклеточных частиц, вирусов, сыворотки и/или одного или более их компонентов, ECL-меток (например, производные от RuII (бипиридин)3 и RuIII(бипиридин)3), оксалатов, триалкиламинов, антигенов, аналитов, и/или их комбинаций. В другом примере, может оказаться желательным увеличить связывание биомолекул. Одна или более из химических групп, которые уменьшают и предотвращают неспецифическое связывание, могут находиться в, на-,или вблизи к одной или более фибрилле, одному или более тонковолокнистому агрегату и/или тонковолокнистой прослойке. Неспецифическое связывание может регулироваться путем ковалентного присоединения РЕG-звеньев к одной или более фибрилле и/или тонковолокнистой прослойке. Заряженные остатки (например,фосфаты, ионы аммония) могут ковалентно присоединяться к одной или более фибрилле или к тонковолокнистой прослойке. Материалы, используемые в подложке,электродах и/или связывающих доменах могут быть обработаны с помощью поверхностноактивных веществ для уменьшения неспецифического связывания. Например, фибриллы или тонковолокнистые прослойки можно обрабатывать с помощью поверхностно-активных веществ и/или моющих средств, которые хорошо известны специалистам (например, серия"Tween, Triton, Span, Brij" [названия]). Фибриллы или тонковолокнистые прослойки промывают, пропитывают, инкубируют с, и/или обрабатывают ультразвуком в растворах поверхностно-активных веществ и/или моющих средств. Растворы PEG и/или молекул, которые ведут себя так же, как PEG (например, олиго- или полисахариды, другие гидрофильные олигомеры или полимеры) ("Polyethylene glycol chemistry;Biotechnical and biomedical applications, Karris,J.M. Editor, 1992, Plenum Press) могут использоваться вместо и/или в сочетании с поверхностно-активными веществами и/или моющими средствами. Нежелательная неспецифическая адсорбция некоторых структурных элементов типа вышеперечисленных, может быть блокирована конкурентной неспецифической адсорбцией. Такой конкурентносвязывающейся молекулой может быть бычий сывороточный альбумин(BSA) и иммуноглобулин G(lgG). Неспецифическое связывание ECL-метки может быть уменьшено путем химической модификации этой метки. Например, метку TAG можно модифицировать, чтобы увеличивалась 53 ее гидрофильность (например, добавляя гидрофильное, полярное, водородное соединение,и/или заряженные функциональные группы к бипиридиновым лигандам в Ru (бипиридин)3), и таким образом уменьшать неспецифическое связывание метки с другими поверхностями. Может оказаться желательным иммобилизировать биомолекулы или другие среды на фибриллах или тонковолокнистых прослойках. Можно присоединять антитела, фрагменты антител, белки, ферменты, ферментные субстраты,ингибиторы, кофакторы, антигены, гаптены,липопротеины, липосахариды, клетки, субклеточные компоненты, клеточные рецепторы, вирусы, нуклеиновые кислоты, антигены, липиды,гликопротеиды, углеводы, пептиды, аминокислоты, гормоны, белок-связывающие лиганды,фармакологические агенты, и/или их комбинации. Также может оказаться желательным присоединять к фибриллам небиологические структурные элементы, такие как, например, полимеры, эластомеры, гели, покрытия, ECL-метки,окислительно-восстановительные активные вещества (например, трипропиламин, оксалаты),неорганические материалы, хелатообразующие агенты, сшивающие агенты и т.д. Одна или более или множество различных молекул может неспецифически связываться(например, адсорбироваться) с поверхностью фибриллы или тонковолокнистой прослойки. Биологические молекулы или другие среды могут связываться с фибриллами или тонковолокнистыми прослойками путем неспецифической адсорбции. Степень неспецифической адсорбции для любой данной фибриллы, тонковолокнистой прослойки и/или биомолекулы определяется определенными свойствами каждой из перечисленных. Некоторые химические функциональные группы или биологические молекулы, присутствующие на фибриллах, могут уменьшать или увеличивать неспецифическое связывание. Присутствие гидрофобных и/или гидрофильных участков на поверхности белка может увеличивать или уменьшать неспецифическое связывание белка с фибриллами или тонковолокнистыми прослойками. Гидрофильные и/или гидрофобные участки используются для регулирования неспецифического связывания в контролируемых областях. Фибриллы могут быть дериватизированы с помощью алкильных цепей (СН 2) и/или карбоновокислотных групп в целях увеличения неспецифического связывания биологических молекул, или сред, или других материалов. Фиг. 26 схематически иллюстрирует вышеупомянутый вариант осуществления изобретения в случае одной фибриллы. Фибриллу 2600 дериватизируют посредством алкильных цепей 2601. Биомолекулы 2602,2603, и 2604 неспецифически связываются с 54 алкильными цепями. Полимер/эластомер 2605 также может быть связан. Для иммобилизации биомолекул, биологических сред и других материалов путем неспецифического связывания используются недериватизированные фибриллы, тонковолокнистые агрегаты и/или тонковолокнистые прослойки.ECL-метку получают так, чтобы она селективно связывалась с подложкой и/или электродом. Например, дериватизированная ECL-метка, которая имеет определенный суммарный отрицательный заряд; может иметь относительно низкое сродство с электродом при более восстановительном потенциале, и затем имеет более высокое сродство с электродом, поскольку потенциал электрода становится более окислительным. Сродство ECL-метки и/или связывающих реагентов с электродом делается так, чтобы его можно было модулировать (например, уменьшать сродство во время связывания и/или стадий промывания и увеличивать сродство ECLметки и/или связывающих реагентов так, чтобы увеличивать эффективный потенциал, воспринимаемый посредством ECL-метки во время считывания результатов ECL). Молекулы (как биологические, так и не биологические), изображенные на фиг. 28, могут присоединяться к фибриллам посредством ковалентной связи. Фибриллы 2800, несущие химические функциональные NHS-сложноэфирные группы могут образовывать ковалентные связи 2801 с биомолекулами или биологическими средами 2802, 2803. Эти биологические среды могут использовать аминогруппы для образования ковалентной связи посредством реакции с NHS - сложноэфирной группой. Полимер 2808 является иммобилизованным. Универсальность NHS -сложноэфирных групп в качестве связывающих агентов для молекул очевидна для каждого специалиста, и специалист сам может выбрать подходящие биомолекулы, и подходящие реакционные условия для осуществления иммобилизации. Пара частиц и/или молекул "M1" и "S1", из которых одна или более прикрепляются к фибрилле, обладают взаимным сродством или способностью к связыванию. Такими парами M1/S1 могут быть антитело/антиген, антитело/гаптен,фермент/субстрат, фермент/кофактор, фермент/ ингибитор, лектин/углевод, рецептор/гормон,рецептор/эффектор, нуклеиновая кислота/нуклеиновая кислота, белок/нуклеиновая кислота,вирус/лиганд, клеткаклеточный рецептор, и т.д. Существует много комбинаций "связывающихся пар" M1/S1, и можно выбрать соответствующие комбинации, подходящие для достижения желаемого связывания. Любая или обе из M1 иS1 могут быть прикреплены к одной или нескольким фибриллам. Фиг. 27 и 28 иллюстрируют некоторые из многих возможных конфигураций, которые 55 возможны в данном варианте изобретения. На фиг. 27 фибрилла 2700, дериватизированная посредством алкильных цепей 2701, неспецифически связывается с молекулой 2702, которая обладает взаимным сродством или способностью к связыванию с другой молекулой 2703. Молекула 2703 также связывается с другой молекулой 2704. Блокирующая молекула 2705 может быть неспецифически адсорбирована на фибрилле. Блокирующий полимер 2706 и/или полимер 2707, который имеет лиганд (2708),обладающий сродством к молекуле 2709, являются неспецифически адсорбированными. На фиг. 28 фибрилла 2800 ковалентно связана посредством 2801 с биомолекулами 2802 и 2803 и с линкерной молекулой 2804. Линкерная молекула 2804 имеет взаимное сродство или способность к связыванию с другой биомолекулой 2805. Биомолекула 2803 обладает взаимным сродством или способностью связываться с другой линкерной молекулой 2806, которая ковалентно связана с 2807. Полимер 2808 с лигандом 2812, который является специфичным для связывающегося партнера 2809, ковалентно связан с фибриллой. Блокирующие молекулы (например, BSA) 2811 и блокирующие полимеры 2810 являются ковалентно связанными. Фибрилла может быть дериватизирована биотином и/или биотинилированным линкером,а авидин и/или стрептавидин может связываться с этим линкером. Авидин и/или стрептавидин могут связываться с фибриллой, может связываться биотинированное антитело и/или белок. Авидин и/или стрептавидин могут быть иммобилизованы на фибрилле либо путем неспецифического связывания, либо посредством ковалентной связи, другой или той же самой связывающейся пары, или их комбинации. Использование (стрепт-) авидина и биотина в качестве"связывающейся пары" является широко применяемым методом связывания биомолекул или биологических сред с другими материалами и хорошо известным специалистам (Spinke и соавт., 1993, Langmuir, 9, стр. 1821). Связывающаяся пара может быть моноклональным антителом и антигеном, который связывается с этим антителом. Могут образовываться многочисленные связывающиеся пары. (например, M1/S1/M2).M1-моноклональное антитело, S1-антиген по отношению к M1, и М 2 - антитело, которое связывается c S1. Этот комплекс может составлять антитело/антиген/ антитело - "сэндвич" - комплекс (такие антитела могут быть или могут не быть моноклональными). М 2 может быть антителом, меченым ECL-активной меткой (см. выше), флуоресцентной меткой, радиоактивной меткой, ферментной меткой, и/или их комбинациями.M1 может быть молекулой, которая может образовывать комплекс с металлом, ионом металла, или с металлоорганическим соединением("хелатообразующим агентом), S1 - представляет собой металл, ион металла, или металлоорганическое соединение ("хелат"), который образует комплекс с M1, a М 2 - часть на биологической молекуле, которая связывается с M1/S1 комплексом (Gershon u Khiko, 1995, Journal ofImmunological Methods, 7371). Изготовление металлических электродных конфигураций и проводящих элементов для распределения электрического тока к таким электродам на поверхности, осуществляется способами, хорошо известными в технике (см.,например, Leventis и соавт., патент США 5,189,549). Приготовление металлических пленок на прозрачных поверхностях используется для производства ЖКИ - жидкокристаллических дисплеев и может быть адаптировано к изготовлению электродов в соответствии с настоящим изобретением. Haneko, 1987, Liquid Crystal TVCrystal Displays [ЖК - телевизионные дисплеи,принципы действия и применение ЖКдисплеев, КТК Scientific Publishers, Tokyo,D.Reidel Publishing. Прозрачные электродные поверхности могут быть также изготовлены,например, в соответствии со способом автораDiMilla и соавт., 1994, J.Am.Chem.Soc., 116 (5),стр. 2225-2226. Пленки из титана толщиной 0,5 нм и из золота толщиной 5 нм осаждаются на прозрачных подложках (стекло или пластмасса). Тонкий золотой слой, приготовленный способом DiMilla (см. ранее), может использоваться для изготовления прозрачной электрической структуры способом Kumar (см. выше). Желательны модификации этой процедуры с целью увеличения толщины слоев проводника для улучшения способности проводить ток при предпочтительном сохранении прозрачности, и эти модификации совершенно очевидны обычному специалисту. Такие методы могут использоваться для изготовления поверхностей электродов, которые выстраиваются с- или вблизи с дискретными связующими доменами PMAMS. Кроме того, пленки и/или монослои могут быть образованы из компонентов, которые облегчают перенос электрического потенциала с поверхности электрода к ЕСL-метке в отличие от использования изолирующих компонентовZhang и Bard. Например, для переноса электронов может использоваться перекрытие пиорбиталей в экстенсивно сопряженных системах. Такой перенос пи-орбитальных электронов обеспечивается полипиролом или другими сопряженными кольцами, или структурами, связанными двойной связью. Можно использовать олигонуклеотиды,для модуляции переноса электронов. Например,чтобы увеличить скорости переноса электронов можно использовать перекрывание пи-связей в двухцепочечной ДНК. Олигонуклеотиды, связанные с поверхностью электрода, можно ис 57 пользовать в качестве связывающего агента в связывающем домене. После связывания комплементарной олигонуклеотидной последовательности образуется двойная нить с организованным перекрыванием пи-связей. В конкретном варианте осуществления изобретения, первый или первично иммобилизованный (например, ковалентно связанный с подложкой) олигонуклеотид помечается ЕСL-меткой. В другом варианте, второй комплементарный олигонуклеотид или олигонуклеотид с последовательностью, частично комплементарной первому олигонуклеотиду, помечаются ECL-меткой. Третий олигонуклеотид комплементарный, или частично комплементарный второму олигонуклеотиду, также помечается (например, "сэндвич"анализ). Можно также использовать разветвленные цепи олигонуклеотидов. Можно также использовать олигонуклеотиды и/или олигонуклеотидные аналоги (например, олигонуклеотиды с модифицированными основаниями, и/или с модифицированными остовами, содержащими,например, азот и/или серу). Могут быть осуществлены различные исследования. Переменная стабильность пи-перекрывания в олигонуклеотидах и/или в олигонуклеотидных комплексах может отслеживаться посредством модуляции электронного переноса. Сигнал (например, свет,генерированный ECL и/или измерение импеданса, генерированный от пи-связи, стабилизированной ECL-меченой двухспиральной олигонуклеотидной парой, может быть коррелирован относительно сигнала и/или ожидаемого сигнала от более неупорядочного, одноцепочечного олигонуклеотида. Можно кореллировать вариацию ЕСL-сигнала между полностью комплементарным, ECL-меченым, двухцепочечными олигонуклеотидом и частично комплементарным, ECL-меченым, двухцепочечным олигонуклеотидом. Кроме того, могут быть использованы олигонуклеотидные комплексы из множества олигонуклеотидов. Например, можно использовать тройные спирали. Модуляция скоростей переноса электронов может быть измерена с использованием ECLдетектирования, а также электронных средств.ECL-метки могут быть ковалентно связаны с олигонуклеотидными нитями и/или нековалентно связаны (например, включены прослойками). ДНК может связана с электродом без использования линкера (например, адсорбция 5'тиолированной ДНК, на золоте) или с использованием короткого (10 атомов) линкера для гарантии низкого сопротивления переносу электронов с ДНК на электрод. Может использоваться связывающаяся цепь, которая может эффективно переносить электроны с электрода на нить ДНК (например, цепь полиацетилена). Могут использоваться смешанный монослой и/или пленка, где имеется, по крайней мере, один элемент монослоя или пленки, поскольку, в этом случае может быть облегчен 58 перенос электрического потенциала. Альтернативно, молекула или частица, которая облегчает перенос электрического потенциала, адсорбируется на монослое или пленке. Так, например,могут использоваться пи-конъюгированные монослои и/или проводящие микрочастицы, которые адсорбируются на-, и/или локализуются у поверхности электрода. В монослое и/или пленке создаются конфигурированные регулярные промежутки. При использовании регулируемых конфигураций промежутков в,по существу,упорядоченном перпендикулярно, монослоеSAM, состоящем из длинной цепи алкантиолов(то есть, изолирующих), к которому впоследствии присоединяется ECL-метки, может регулироваться эффективный потенциал, приложенный к ECL-меткам. Например, фиг. 11 изображает кассету 1200, сформированную из одной подложки 1202 с металлическим слоем 1204,конфигурация SАМ 1206 и промежутков 1208 между элементами конфигурации SAM.ECL-меченые белки, могут быть нековалентно связанными с поверхностью монослоя.ECL-меченый белок может адсорбироваться на золотой поверхности, дериватизированной алкантиолом с концевой метильной группой. Золотая поверхность может действовать как рабочий электрод или как противоположный электрод. Множество связывающих доменов может присутствовать на одной подложке,как показано на фиг. 11-13. В предпочтительных вариантах,связывающие домены содержат меченные и/или немеченные белки и/или нуклеиновые кислоты и/или клетки и/или химические молекулы. Альтернативно, длина компонентов монослоя (например, длина алкановой цепи в монослоях алкантиола), может варьироваться и тем самым может регулироваться эффективный потенциал на экспонируемой поверхности монослоя. Вообще говоря, алкантиолы могут иметь углеродные цепи с длиной от одного атома углерода до 100 атомов углерода. В предпочтительном варианте длина углеродной цепи алкантиола составляет от 2 до 24 атомов углерода. Длина углеродной цепи алкантиола составляет от 2 до 18 атомов углерода. Длина углеродной цепи составляет от 7 до 11 атомов углерода. Такими алкантиолами могут быть разнообразные головные группы, подвергаемые воздействию анализируемых сред, включая метильные группы, гидроксильные группы, амины, карбоновые кислоты, олиго(этиленгликоли), фосфатные группы, фосфорильные группы, биотин,нитрилтрехуксусную кислоту, глутатион, эпоксиды динитрофенил и/или NHS - сложные эфиры. Другими головными группами являются лиганды, обычно используемые для очистки и иммобилизации рекомбинантных гибридных белков (например, Sassenfeld, 1990, TIBTECH, 8,стр. 88-93). Связывающие домены могут быть в различной степени дериватизированы для полу 59 чения различных плотностей связывающих реагентов. Например, могут использоваться различные плотности активируемых химических соединений и/или может быть осуществлена дериватизация в различной степени. Для достижения нужной плотности связывания могут быть использованы смешанные химические соединения. Смешанные монослои могут быть использованы для регуляции плотности активируемых групп и/или связывающих реагентов. Плотность связывающих групп регулируется в целях оптимизации отношения ECL-сигнал/ шум. Полное количество сайтов связывания внутри связывающего домена(-ов) регулируется для оптимизации интенсивности светового сигнала ECL по отношению к другим световым сигналам ECL из другого связующего домена(ов), независимо от того, детектируются ли такие световые сигналы ECL последовательно или одновременно; и/или по отношению к детектированию света. Импульс напряжения может прикладываться так, чтобы активизировать ECL-меткой,связанной с связывающим доменом (-ами) в пределах поверхности PMAMS один или более раз. Электронный потенциал, достаточный для того, чтобы активизировать генерацию светаECL, может прикладываться многократно к одной и той же поверхности, дериватизированной алкантиолом, со связанным ярлыком ECL, в результате чего генерируются многочисленные сигналы света ECL. Электронный потенциал прикладывается достаточным, чтобы обратимо генерировать ЕСL. Потенциал прикладывается так, чтобы генерировать ECL квазиобратимо. В квазиобратимой последовательности импульсов напряжения, связывающий домен, внутри которого ассоциируется ECL-метка (например, связывается), может быть химически и/или физически изменен. Последовательность импульсов прикладываемого напряжения может производить необратимую генерацию ECL-света. Далее, может прикладываться электрический потенциал, достаточный для освобождения компонентов монослоя. Желательно освобождать такие компоненты монослоя, где объем над поверхностью электрода мал (например, другая подложка или пластина, опирающаяся на поверхность электрода). Таким образом, как только монослой разрывается, даже те ECL-метки,которые эффективно не возбуждены, могут возбуждаться поверхностью электрода, и генерировать электрохемилюминесцентный сигнал, при этом ECL-метки ограничиваются небольшим объемом, ограничивая диффузию с электрода. Могут использоваться различные композиции монослоя, для регулирования степенью разрыва монослоя для данного потенциала. Монослои с компонентами, имеющими высокую степень сродства, будут более резистентными к разрыву монослоя. Более длинная цепь алкантиолов более устойчива к разрыву, чем короткая цепь ал 001198 60 кантиолов. Варьируя длину цепи, можно достичь желаемой стабильности. Для модуляции ECL-сигнала может использоваться модификация связывающих доменов в пределах поверхности PMAMS. Серия импульсов напряжения прикладывается так,чтобы генерировать множество ЕСL-сигналов. Упомянутое множество ECL-сигналов может использоваться для того, чтобы получить дополнительные и/или улучшенные результаты. Статистический анализ скорости модуляцииECL-сигнала может быть коррелирован с общим качеством одного или более связывающих доменов. Кроме того, упомянутое множество ECLсигналов может использоваться для того, чтобы увеличить отношение сигнал/шум, например,путем фильтрации некоторых ECL-сигналов последовательности. Кроме того, множество импульсов электронного потенциала с определенной формой сигнала могут использоваться для уменьшения нежелательной модуляции сигнала из-за неспецифического связывания. Электронный потенциал может прикладываться, для предотвращения неспецифического связывания некоторых заряженных объектов. Кроме того,электронный потенциал может прикладываться так, чтобы способствовать локализации возле связывающего домена(-ов) некоторых исследуемых аналитов или химических объектов. Импульс прикладываемого напряжения, подает большее перенапряжение (например, более высокий потенциал чем требуется, чтобы генерировать ECL). Перенапряжение может быть использовано для модуляции ECL -сигналов в серии импульсов напряжения или в единичном импульсе напряжения. Кроме того, перенапряжение можно использовать, чтобы модулировать кинетику реакции ECL и/или модулировать связывающий потенциал химически и/или физически. Далее, один или несколько импульсов напряжения и/или других электронных зондов,известных специалистам можно использовать для оценки и/или корреляции и/или экстраполяции данных качества и/или электронных свойств электрода(-ов). Предпочтительно, эффективность ECL реакции может быть увеличена путем расширения площади поверхности рабочего электрода,путем приведения в контакт с электродами дополнительных проводящих средств. Могут использоваться проекции или удлинения от электрода (например, провода или нитевидные кристаллы) из проводящих материалов или проводящих частиц, чтобы увеличить площадь поверхности электрода так, чтобы электрическое поле стало ближе к ECL-метке. Альтернативно выемки или углубления в электродных структурах могут служить для той же цели. В частности, проводящие частицы могут заполнять промежутки на поверхности электрода и/или покрывать подложку или монослой так,чтобы электрическое поле вокруг ECL-метки