Pdx1-экспрессирующая энтодерма

011953 Настоящая заявка представляет собой частичное продолжение заявки на патент США 11/021618,озаглавленной Дефинитивная энтодерма (Definitive endoderm), поданной 23 декабря 2004 г., которая испрашивает приоритет в соответствии 119(е) 35 Свода Законов США согласно следующим трем предварительным патентным заявкам: предварительной заявке US 60/566293, озаглавленной PDX1 экспрессирующая энтодерма (PDX1 Expressing endoderm), поданной 27 апреля 2004 г.; предварительной заявке US60/587942, озаглавленной Поверхностный клеточный рецептор к хемокинам для выделения дефинитивной энтодермы (Chemokine cell surface receptor for the isolation of definitive endoderm),поданной 14 июля 2004 г., и предварительной заявке US60/586566, озаглавленной Поверхностный клеточный рецептор к хемокинам для выделения дефинитивной энтодермы (Chemokine cell surface receptor for the isolation of definitive endoderm), поданной 9 июля 2004 г. Область техники изобретения Настоящее изобретение относится к области медицины и клеточной биологии. В частности, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим PDX1-положительные клетки энтодермы млекопитающих, и к способам получения, выделения и применения таких клеток. Предпосылки создания изобретения Плюрипотентные стволовые клетки человека, такие как эмбриональные стволовые клетки (ЭС) и эмбриональные зародышевые клетки (ЭЗ), впервые были выделены в культуре без фидерных фибробластов в 1994 г. (см. Bongso et al., 1994) и с фидерными фибробластами (Hogan, 1997). Позднее Thomson,Reubinoff и Shamblott создали стабильные культуры ЭС и ЭЗ клеток человека, используя слои митотически инактивированных фидерных клеток мыши (Reubinoff et al., 2000; et al., Shamblott 1998; Thomson etal., 1998). ЭС и ЭЗ клетки человека (ЭСКч) открывают уникальные возможности для исследования ранних стадий развития человека, а также для лечебного вмешательства при некоторых болезненных состояниях, таких как сахарный диабет и болезнь Паркинсона. Например, применение инсулинпродуцирующих клеток, происходящих от ЭСКч, могло бы дать значительное улучшение по сравнению с существующими процедурами клеточной терапии, в которых используют клетки из поджелудочной железы доноров. Однако в настоящее время не известно, как получить инсулинпродуцирующие -клетки из ЭСКч. Поэтому ограничением современных способов клеточной терапии сахарного диабета с использованием островковых клеток поджелудочной железы является нехватка островковых клеток (инсулоцитов) высокого качества, необходимых для трансплантации. Проведение процедуры клеточной терапии для всего лишь одного пациента, больного диабетом I типа, требует трансплантации приблизительно 8108 островковых клеток поджелудочной железы (Shapiro et al., 2000; Shapiro et al., 2001a; Shapiro et al, 2001b). Поэтому для получения достаточного для успешной трансплантации числа клеток необходимо по меньшей мере два органа здоровых доноров. ЭСКч дают источник исходного материала, из которого можно получать значительные количества высокодифференцированных клеток для клеточной терапии заболеваний человека. Два свойства делают ЭСКч исключительно подходящими для применения в клеточной терапии: плюрипотентность и возможность поддерживать эти клетки в культуре в течение продолжительного периода времени. Плюрипотентность характеризуется способностью ЭСКч дифференцироваться в производные всех трех первичных зародышевых листков (энтодермы, мезодермы и эктодермы), из которых, в свою очередь, помимо внезародышевых тканей (например, плаценты) и клеток зародыша образуются все типы соматических клеток зрелого организма. Хотя плюрипотентность и придает необычайную полезность ЭСКч, в то же время она обуславливает исключительные сложности, возникающие при исследованиях и манипуляциях с этими клетками и их производными. Вследствие широкого разнообразия типов клеток, которые могут возникать в дифференцирующихся культурах ЭСКч, подавляющее большинство типов клеток образуются с очень низкой эффективностью. Кроме того, успех оценки образования любого отдельного типа клеток существенно зависит от определения соответствующих маркеров. Достижение эффективной направленной дифференцировки очень важно для применения ЭСКч в терапевтических целях. Для того чтобы использовать ЭСКч в качестве исходного материала для наработки клеток, которые можно применять для клеточной терапии, было бы полезным решить следующие проблемы. Например,для того чтобы получить количество клеточного материала, необходимое для лечения путем трансплантации островковых клеток, было бы полезно на самых ранних стадиях эффективно направлять дифференцировку ЭСКч по линии образования островковых/-клеток поджелудочной железы. Полезным дополнением к эффективному регулированию процесса дифференцировки была бы возможность выделять и описывать промежуточные типы клеток, возникающие по пути дифференцировки к островковым/-клеткам поджелудочной железы, и использовать такие клетки в качестве предшественников соответствующей линии дифференцировки для дальнейших этапов дифференцировки. Краткое изложение сущности изобретения Способы реализации настоящего изобретения относятся к композициям, содержащим PDX1 экспрессирующие (PDX1-положительные) клетки энтодермы, а также к способам их получения. Допол-1 011953 нительные способы реализации относятся к популяциям клеток, обогащенным PDX1-положительными клетками энтодермы, и способам получения таких популяций клеток. Другие способы реализации относятся к способам повышения (уровня) экспрессии PDX1 в клетках энтодермы, а также идентифицикации факторов, полезных для дальнейшей дифференцировки PDX1-отрицательной и/или PDX1 положительной энтодермы. В некоторых примерах реализации композиций и способов, описанных в этой заявке, PDX1-положительные клетки энтодермы представляют собой PDX1-положительные клетки энтодермы передней (головной) кишки/средней кишки. В определенных предпочтительных способах реализации композиций и способов, описанных в данной заявке, PDX1-положительные клетки энтодермы представляют собой PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки (головной кишки). В других предпочтительных способах реализации PDX1-положительные клетки энтодермы представляют собой PDX1-положительные клетки энтодермы задней части передней кишки. Некоторые способы реализации настоящего изобретения относятся к культурам клеток, содержащим PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки, отличающимся тем, что PDX1 положительные клетки энтодермы представляют собой мультипотентные клетки, которые могут дифференцироваться в клетки, ткани или органы, развивающиеся из передней части кишечной трубки. В некоторых способах реализации такие культуры клеток содержат клетки человека. В таких культурах клеток человека клетки PDX1-положительной энтодермы прямой кишки могут составлять по меньшей мере приблизительно 2%, по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 10% или по меньшей мере приблизительно 25% числа клеток человека в указанной культуре. В некоторых способах реализации настоящего изобретения количество клеток рассчитывают без учета присутствующих в указанной культуре фидерных клеток, и оно составляет по меньшей мере приблизительно 2%, по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 10% или по меньшей мере приблизительно 25%. В некоторых описанных в настоящей заявке способах реализации культур клеток, PDX1 положительные клетки энтодермы передней кишки могут экспрессировать маркер, выбранный из группы, состоящей из содержащего гомеобокс (гомеобокссодержащего) гена А 13 (НОХА 13), гомеобокссодержащего гена С 6 (НОХС 6) и SOX17. В других способах реализации культуры клеток, содержащие клетки PDX1-положительной энтодермы передней кишки, практически не содержат клеток висцеральной энтодермы, клеток париетальной энтодермы и/или нервных клеток. В некоторых способах реализации культуры клеток также содержат один из следующих компонентов: соединение - ретиноид, такое как ретиноевая кислота (RA), FGF-10 или В 27. Дополнительные способы реализации настоящего изобретения относятся к обогащенным, выделенным или в значительной степени очищенным популяциям PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки, отличающимся тем, что PDX1-положительные клетки энтодермы представляют собой мультипотентные клетки, которые могут дифференцироваться в клетки, ткани или органы, развивающиеся из передней части кишечной трубки. В некоторых способах реализации PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки получают из плюрипотентных клеток, таких как эмбриональные стволовые клетки человека. Другие способы реализации настоящего изобретения относятся к популяциям клеток, которые содержат клетки, отличающиеся тем, что по меньшей мере приблизительно 90% этих клеток представляют собой PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки, и где указанныеPDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки представляют собой мультипотентные клетки,которые способны дифференцироваться в клетки, ткани или органы, образующиеся из передней части кишечной трубки. В предпочтительных способах реализации PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки составляют по меньшей мере приблизительно 95% популяции клеток. В еще более предпочтительных способах реализации PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки составляют по меньшей мере приблизительно 98% популяции клеток. Другие описанные в настоящей заявке примеры реализации относятся к способам получения PDX1 положительных клеток энтодермы передней кишки путем обработки культуры клеток или популяции клеток, содержащей клетки дефинитивной энтодермы, которые практически не экспрессируют PDX1(PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы) фактором дифференцировки передней трубки,например, таким как ретиноид. Ретиноид, например ретиноевую кислоту, можно добавлять в количестве,варьирующем приблизительно от 0,01 до 50 мкМ. В некоторых способах реализации дифференцировкуPDX1-отрицательной дефинитивной энтодермы в PDX1-положительную энтодерму передней кишки усиливают посредством добавления к культуре клеток или популяции клеток FGF-10 и/или В 27. FGF-10 можно добавлять в концентрации приблизительно от 5 до 1000 нг/мл. В некоторых способах реализации В 27 добавляют к культуре клеток или популяции клеток в количестве, составляющем приблизительно от 0,1 до 20%. FGF-10 и/или В 27 можно добавлять к культуре клеток или популяции клеток приблизительно в то же время, что и ретиноид, либо каждый фактор можно добавлять по отдельности с перерывами продолжительностью до нескольких часов. В определенных способах реализации ретиноид добавляют к культуре PDX1-отрицательной дефинитивной энтодермы, возраст которой составляет приблизительно 4 дня. Другие примеры реализации относятся к способам применения факторов дифференцировки передней кишки для дальнейшего повышения эффективности образования PDX1-положительных клеток энто-2 011953 дермы прямой кишки или популяции клеток, которую привели в контакт с ретиноидом, например с ретиноевой кислотой. В таких примерах реализации эффективность дифференцировки PDX1 отрицательной дефинитивной энтодермы в PDX1-положительную энтодерму передней кишки увеличивают посредством добавления в культуру клеток или популяцию клеток активина А и/или активина В. Активин А и/или активин В можно добавлять в концентрации приблизительно от 5 до 1000 нг/мл. Другие примеры реализации относятся к способам повышения эффективности образования PDX1 положительных клеток энтодермы передней кишки в культуре клеток или популяции клеток посредством дифференцировки PDX1-отрицательных клеток в среде, содержащей ретиноид, причем указанную среду предварительно кондиционировали посредством поддержания или выращивания в ней клеток определенных типов. Такие типы клеток включают, без ограничения, эмбриональные стволовые клетки или другие плюрипотентные клетки, которые предварительно подвергли дифференцировке в среде, содержащей сыворотку или белки, принадлежащие к надсемейству факторов роста TGF, такие как активин А,активин В, Nodal и/или фактор морфогенеза костей (BMP). В некоторых примерах реализации в культуру клеток или популяцию клеток добавляют кондиционированную среду в количестве, составляющем приблизительно от 1 до 100% всей среды для культивирования. Факторы роста надсемейства TGF и/или кондиционированную среду можно добавлять в культуру клеток или популяцию клеток приблизительно в то же время, что и ретиноид, либо можно добавлять каждый фактор по отдельности отдельно с перерывами продолжительностью до нескольких часов. Примеры реализации настоящего изобретения относятся также к способам получения популяции клеток, обогащенной PDX1-положительными клетками энтодермы передней кишки. В определенных примерах реализации эти способы включают этап получения популяции плюрипотентных клеток, в которой по меньшей мере одна из плюрипотентных клеток содержит по меньшей мере одну копию нуклеиновой кислоты, которая находится под контролем промотора PDX1. В некоторых примерах реализации эта нуклеиновая кислота содержит последовательность, кодирующую зеленый флуоресцентный белок(GFP) или его биологически активный фрагмент. В других примерах реализации дополнительные этапы способа включают дифференцировку плюрипотентных клеток в PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки, причем указанные PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки представляют собой мультипотентные клетки и могут дифференцироваться в клетки, ткани или органы, образующиеся из передней части кишечной трубки, и отделение PDX1-положительных клеток от PDX1 трицательных клеток. В некоторых примерах реализации описанных здесь способов этап дифференцировки дополнительно включает добавление в популяцию плюрипотентных клеток по меньшей мере одного фактора роста, принадлежащего надсемейству TGFP, в количестве, достаточном для того, чтобы стимулировать дифференцировку плюрипотентных клеток в PDX1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы, и добавление к PDX1-отрицательным клеткам дефинитивной энтодермы факторов дифференцировки передней кишки в количестве, достаточном для того, чтобы стимулировать дифференцировку PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки. Некоторые примеры реализации настоящего изобретения относятся к способу увеличения (уровня) экспрессии продукта гена PDX1 в SOX17-экспрессирующих (SOX17-положительных) клетках дефинитивной энтодермы посредством приведения в контакт таких клеток с фактором дифференцировки в количестве, достаточном для того, чтобы увеличить экспрессию продукта гена PDX1. В некоторых примерах реализации фактор дифференцировки выбирают из группы, состоящей из ретиноевой кислоты (RA),FGF-10 и В 27. Дополнительные примеры реализации настоящего изобретения относятся к способу идентификации фактора роста, способного стимулировать дифференцировку PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки. В таких способах PDX1 отрицательные клетки дефинитивной энтодермы приводят в контакт с потенциальными факторами дифференцировки и определяют, увеличилась ли экспрессия PDX1 в популяции клеток после контактирования с потенциальным фактором дифференцировки по сравнению с уровнем экспрессии PDX1 в популяции клеток до контактирования с указанным потенциальным фактором. Увеличение экспрессии PDX1 в популяции клеток указывает на то, что исследуемый потенциальный фактор дифференцировки способен стимулировать дифференцировку PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в PDX1 положительные клетки энтодермы передней кишки. В некоторых примерах реализации уровень экспрессии PDX1 определяют способом количественной полимеразой цепной реакции (Q-PCR). Некоторые примеры реализации вышеупомянутого способа включают дополнительно этап определения экспрессии гена НОХА 13 и/или гена НОХС 6 в популяции клеток до и после контакта с потенциальным фактором дифференцировки. В некоторых примерах реализации потенциальный фактор дифференцировки представляет собой малую молекулу (small molecule), например ретиноид, такой как ретиноевая кислота. В других потенциальный фактор дифференцировки представляет собой полипептид, например фактор роста, такой как FGF-10 (фактор роста фибробластов 10). Другие примеры реализации настоящего изобретения относятся к способу идентификации фактора,-3 011953 способного стимулировать дифференцировку PDX1-положительных клеток передней кишки. В таких способах реализации PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки приводят в контакт с потенциальным фактором дифференцировки и определяют, увеличивается или уменьшается экспрессия маркера в популяции клеток после контактирования с потенциальным фактором дифференцировки по сравнению с уровнем экспрессии того же маркера в популяции клеток до приведения в контакт с потенциальным фактором дифференцировки. Увеличение или уменьшение уровня экспрессии маркера указывает на то, что потенциальный фактор дифференцировки способен стимулировать дифференцировкуPDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки. В некоторых примерах реализации экспрессию маркера определяют способом количественной ПЦР. В некоторых примерах реализации потенциальный фактор дифференцировки представляет собой малую молекулу, например ретиноид, такой как ретиноевая кислота. В других потенциальный фактор дифференцировки представляет собой полипептид,например фактор роста, такой как FGF-10. В некоторых областях не существует общепринятого определения термина "содержать". В настоящей заявке термин "содержать" используют в "открытом" значении, что допускает включение любых дополнительных элементов. С учетом этого, дополнительные примеры реализации настоящего изобретения описаны в приведенных ниже параграфах. 1. Культура клеток, содержащая клетки человека, в которой по меньшей мере 2% указанных клеток человека представляют собой панкреатический и дуоденальный гомеобокссодержащий фактор-1 (PDX1)положительные клетки энтодермы передней кишки, причем указанные PDX1-положительные клетки энтодермы являются мультипотентными клетками, которые могут дифференцироваться в клетки, ткани или органы, образующиеся из передней части кишечной трубки. 2. Культура клеток согласно параграфу 1, в которой по меньшей мере приблизительно 10% указанных клеток человека представляют собой PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки. 3. Культура клеток согласно параграфу 1, в которой по меньшей мере приблизительно 10% указанных клеток человека представляют собой PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки. 4. Культура клеток согласно параграфу 1, в которой по меньшей мере приблизительно 25% указанных клеток человека представляют собой PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки. 5. Культура клеток согласно параграфу 1, в которой присутствуют фидерные клетки человека и по меньшей мере приблизительно 2% клеток человека, не являющихся указанными фидерными клетками человека, представляют собой PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки. 6. Культура клеток согласно параграфу 1, в которой указанные PDX1-положительные клетки энтодермы экспрессируют гомеобокссодержащий ген А 13 (НОХА 13). 7. Культура клеток согласно параграфу 1, в которой указанные PDX1-положительные клетки энтодермы экспрессируют ген, гомеобокссодержащий ген С 6 (НОХС 6). 8. Культура клеток согласно параграфу 1, в которой указанные PDX1-положительные клетки энтодермы экспрессируют SOX17. 9. Культура клеток согласно параграфу 1, в которой указанные PDX1-положительные клетки энтодермы экспрессируют PDX1 на более высоком уровне, чем маркер, выбранный из группы, состоящей из альфа-фетопротеина (AFP), SOX7, SOX1, ZICl и NFM. 10. Культура клеток согласно параграфу 1, в которой указанная культура клеток практически свободна от клеток, выбранных из группы, состоящей из клеток висцеральной энтодермы, клеток париетальной энтодермы и нервных клеток. 11. Культура клеток согласно параграфу 1, в которой указанная культура клеток содержит по меньшей мере приблизительно 1 PDX1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 10 PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы. 12. Культура клеток согласно параграфу 1, где указанная культура клеток содержит по меньшей мере приблизительно 1 PDX1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 5 PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы. 13. Культура клеток согласно параграфу 1, где указанная культура клеток содержит по меньшей мере приблизительно 1 PDX1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 4 клетки PDX1-отрицательной дефинитивной энтодермы. 14. Культура клеток согласно параграфу 1, которая дополнительно содержит эмбриональную стволовую клетку. 15. Культура клеток согласно параграфу 14, где указанные эмбриональные стволовые клетки получены из ткани, выбранной из морулы, внутренней массы клеток эмбриона и гонадных валиков эмбриона. 16. Культура клеток согласно параграфу 1, которая дополнительно содержит ретиноид. 17. Культура клеток согласно параграфу 16, в которой ретиноид представляет собой ретиноевую кислоту (RA). 18. Культура клеток согласно параграфу 1, которая дополнительно содержит фактор роста фибробластов FGF-10. 19. Культура клеток согласно параграфу 1, которая дополнительно содержит В 27. 20. Культура клеток согласно параграфу 1, которая дополнительно содержит и RA и FGF-10.-4 011953 21. Культура клеток согласно параграфу 20, которая дополнительно содержит В 27. 22. Популяция клеток, содержащая клетки, где по меньшей мере приблизительно 90% указанных клеток представляют собой PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки человека, причем указанные PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки представляют собой мультипотентные клетки, которые способны дифференцироваться в клетки, ткани или органы, образующиеся из передней части кишечной трубки. 23. Популяция клеток согласно параграфу 22, в которой по меньшей мере приблизительно 95% указанных клеток представляют собой PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки. 24. Популяция клеток согласно параграфу 22, в которой по меньшей мере приблизительно 98% указанных клеток представляют собой PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки. 25. Популяция клеток согласно параграфу 22, в которой указанные PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки экспрессируют ген HOXA13. 26. Популяция клеток согласно параграфу 22, в которой указанные PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки экспрессируют ген HOXC6. 27. Популяция клеток согласно параграфу 22, в которой указанные PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки экспрессируют SOX17. 28. Популяция клеток согласно параграфу 22, в которой указанные PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки экспрессируют PDX1 на более высоком уровне, чем маркер, выбранный из группы, состоящей из AFP, SOX7, SOX1, ZICl И NFM. 29. Способ получения клеток PDX1-положительной энтодермы передней трубки, который включает следующие этапы: получение популяции клеток, содержащей PDX1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы; и добавление к указанной популяции клеток ретиноида в количестве, достаточном для того, чтобы стимулировать дифференцировку по меньшей мере части указанных PDX1-отрицательных клеток энтодермы в PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки, причем указанные PDX1 положительные клетки энтодермы передней кишки являются мультипотентными и способны дифференцироваться в клетки, ткани или органы, образующиеся из передней части кишечной трубки. 30. Способ согласно параграфу 29, который дополнительно включает этап предоставления времени,достаточного для образования PDX-1-положительных клеток энтодермы передней кишки, причем указанное время, достаточное для образования PDX-1-положительных клеток энтодермы передней кишки,определяют посредством обнаружения присутствия PDX1-положительных клеток энтодермы прямой кишки в указанной популяции клеток. 31. Способ согласно параграфу 29, отличающийся тем, что по меньшей мере приблизительно 2% указанных PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы дифференцируются в PDX1 положительные клетки энтодермы передней кишки. 32. Способ согласно параграфу 29, отличающийся тем, что по меньшей мере приблизительно 5% указанных PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы дифференцируются в PDX1 положительные клетки энтодермы передней кишки. 33. Способ согласно параграфу 29, отличающийся тем, что по меньшей мере приблизительно 10% указанных PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы дифференцируются в PDX1 положительные клетки энтодермы передней кишки. 34. Способ согласно параграфу 29, отличающийся тем, что по меньшей мере приблизительно 25% указанных PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы дифференцируются в PDX1 положительные клетки энтодермы передней кишки. 35. Способ согласно параграфу 29, отличающийся тем, что обнаружение присутствия клеток PDX1 положительной энтодермы прямой кишки в указанной популяции клеток включает определение экспрессии PDX1. 36. Способ согласно параграфу 35, отличающийся тем, что указанные PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки экспрессируют PDX1 на более высоком уровне, чем маркер, выбранный из группы, состоящей из альфа-фетопротеина (AFP), SOX7, SOX1, ZICl и NFM. 37. Способ согласно параграфу 35, отличающийся тем, что экспрессию указанного PDX1 определяют методом количественной ПЦР. 38. Способ согласно параграфу 35, отличающийся тем, что экспрессию PDX1 определяют иммуноцитохимическим способом. 39. Способ согласно параграфу 29, отличающийся тем, что ретиноид представляет собой ретиноевую кислоту. 40. Способ согласно параграфу 39, отличающийся тем, что ретиноевую кислоту добавляют в концентрации приблизительно от 0,01 до 50 мкМ. 41. Способ согласно параграфу 39, отличающийся тем, что ретиноевую кислоту добавляют в концентрации приблизительно от 0,04 до 20 мкМ. 42. Способ согласно параграфу 39, отличающийся тем, что ретиноевую кислоту добавляют в кон-5 011953 центрации приблизительно от 0,1 до 10 мкМ. 43. Способ согласно параграфу 39, отличающийся тем, что ретиноевую кислоту добавляют в концентрации приблизительно 0,2 до 2,5 мкМ. 44. Способ согласно параграфу 39, отличающийся тем, что ретиноевую кислоту добавляют в концентрации приблизительно от 0,5 до 1,5 мкМ. 45. Способ согласно параграфу 39, отличающийся тем, что ретиноевую кислоту добавляют в концентрации, равной приблизительно 1 мкМ. 46. Способ согласно параграфу 39, отличающийся тем, что ретиноевую кислоту добавляют, когда возраст культуры составляет 4 дня. 47. Способ согласно параграфу 29, который дополнительно включает добавление в указанную культуру фактора, выбранного из группы, состоящей из FGF-10, FGF-4, активина А, активина В, В 27, кондиционированной среды и комбинаций указанных факторов, в количестве, достаточном для того, чтобы увеличить образование PDX-1-положительных клеток энтодермы передней кишки. 48. Способ согласно параграфу 47, отличающийся тем, что указанный фактор выбирают из группы,состоящей из FGF-10, FGF-4, активина А и активина В. 49. Способ согласно параграфу 48, отличающийся тем, что указанный фактор добавляют в концентрации приблизительно от 10 до 500 нг/мл. 50. Способ согласно параграфу 48, отличающийся тем, что указанный фактор добавляют в концентрации приблизительно от 20 до 200 нг/мл. 51. Способ согласно параграфу 48, отличающийся тем, что указанный фактор добавляют в концентрации приблизительно от 25 до 75 нг/мл. 52. Способ согласно параграфу 48, отличающийся тем, что указанный фактор добавляют в концентрации, равной приблизительно 50 нг/мл. 53. Способ согласно параграфу 48, отличающийся тем, что указанный фактор добавляют приблизительно в то же время, что и ретиноид. 54. Способ согласно параграфу 47, отличающийся тем, что указанный фактор представляет собой В 27. 55. Способ согласно параграфу 54, отличающийся тем, что В 27 добавляют в количестве, составляющем приблизительно от 0,1 до 20% всей среды. 56. Способ согласно параграфу 54, отличающийся тем, что В 27 добавляют в количестве, составляющем приблизительно от 0,2 до 5% всей среды. 57. Способ согласно параграфу 54, отличающийся тем, что В 27 добавляют в количестве, составляющем приблизительно от 0,5 до 2% всей среды. 58. Способ согласно параграфу 54, отличающийся тем, что В 27 добавляют в количестве, составляющем приблизительно 1% всей среды. 59. Способ согласно параграфу 54, отличающийся тем, что указанный фактор добавляют приблизительно в то же время, что и ретиноид. 60. Способ согласно параграфу 47, отличающийся тем, что указанный фактор представляет собой кондиционированную среду. 61. Способ согласно параграфу 60, отличающийся тем, что кондиционированную среду добавляют в количестве, составляющем приблизительно от 10 до 100% всей среды. 62. Способ согласно параграфу 60, отличающийся тем, что кондиционированную среду добавляют в количестве, составляющем приблизительно от 20 до 80% всей среды. 63. Способ согласно параграфу 60, отличающийся тем, что кондиционированную среду добавляют в количестве, составляющем приблизительно от 40 до 60% всей среды. 64. Способ согласно параграфу 60, отличающийся тем, что кондиционированную среду добавляют в количестве, составляющем приблизительно 50% всей среды. 65. Способ согласно параграфу 60, отличающийся тем, что кондиционированную среду добавляют примерно в то же время, что и ретиноид. 66. Способ согласно параграфу 60, отличающийся тем, что кондиционированную среду готовят посредством приведения в контакт дифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека(ЭСКч) со средой для культивирования клеток в течение 24 ч. 67. Способ согласно параграфу 66, отличающийся тем, что указанные ЭКСр в течение приблизительно 5 дней дифференцируются в среде для культивирования клеток, выбранной из группы, состоящей из RPMI, дополненной 3% сыворотки, RPMI с низким содержанием сыворотки, дополненной активином А и RPMI с низким содержанием сыворотки, дополненной ВМР 4. 68. Клетка PDX1-положительной энтодермы передней кишки, полученная способом согласно параграфу 29. 69. Способ получения популяции клеток, обогащенной PDX1-положительными клетками энтодермы передней кишки, который включает следующие этапы: получение популяции плюрипотентных клеток, в которой по меньшей мере одна клетка из указанной популяции плюрипотентных клеток содержит по меньшей мере одну копию нуклеиновой кислоты-6 011953 под контролем промотора PDX1, причем указанная нуклеиновая кислота содержит последовательность,кодирующую зеленый флуоресцентный белок (GFP) или его биологически активный фрагмент; дифференцировка указанных плюрипотентных клеток для получения PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки, причем указанные PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки являются мультипотентными и могут дифференцироваться в клетки, ткани или органы, образующиеся из передней части кишечной трубки; и отделение PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки от PDX1-отрицательных клеток. 70. Способ согласно параграфу 69, отличающийся тем, что указанная обогащенная популяция клеток содержит по меньшей мере приблизительно 95% PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки. 71. Способ согласно параграфу 69, отличающийся тем, что указанная обогащенная популяция клеток содержит по меньшей мере приблизительно 98% PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки. 72. Способ согласно параграфу 69, отличающийся тем, что этап дифференцировки дополнительно включает добавление к указанным плюрипотентным клеткам по меньшей мере одного фактора роста надсемейства TGFp в количестве, достаточном для того, чтобы стимулировать дифференцировку указанных плюрипотентных клеток в PDX1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы, и добавление к указанным PDX1-отрицательным клеткам дефинитивной энтодермы ретиноида в количестве, достаточном для того, чтобы стимулировать дифференцировку указанных PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки. 73. Способ согласно параграфу 72, отличающийся тем, что указанный ретиноид представляет собой ретиноевую кислоту. 74. Обогащенная популяция PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки, полученная способом согласно параграфу 69. 75. Способ увеличения экспрессии продукта гена PDX1 в SOX17-экспрессирующих клетках дефинитивной энтодермы, который включает приведение в контакт указанной клетки дефинитивной энтодермы с фактором дифференцировки в количестве, достаточном для увеличения экспрессии продукта гена PDX1. 76. Способ согласно параграфу 75, отличающийся тем, что указанный фактор представляет собой ретиноид. 77. Способ согласно параграфу 76, отличающийся тем, что указанный фактор дифференцировки представляет собой ретиноевую кислоту. 78. Способ согласно параграфу 75, отличающийся тем, что указанный фактор дифференцировки выбирают из группы, состоящей FGF-10, FGF-4, активина А, активина В, В 27, кондиционированной среды и комбинации указанных факторов. 79. Способ идентификации фактора дифференцировки, способного стимулировать дифференцировку PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки, который включает следующие этапы: получение популяции, содержащей PDX1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы; приведение в контакт указанной популяции, содержащей PDX1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы с потенциальный фактором дифференцировки; и определение того, увеличилась ли экспрессия PDX1 в указанной популяции клеток после контактирования с потенциальным фактором дифференцировки по сравнению с уровнем экспрессии PDX1 в указанной популяции клеток до приведения в контакт с таким потенциальным фактором дифференцировки,причем увеличение указанной экспрессии PDX1 в указанной популяции клеток указывает на то, что указанный потенциальный фактор дифференцировки способен стимулировать дифференцировку PDX1 отрицательных клеток в PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки, причем указанныеPDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки представляют собой мультипотентные клетки и могут дифференцироваться в клетки, ткани или органы, образующиеся из передней части кишечной трубки. 80. Способ согласно параграфу 79, отличающийся тем, что указанную экспрессию PDX1 определяют способом количественной ПЦР. 81. Способ согласно параграфу 79, который дополнительно включает этап определения экспрессии гена HOXA13 в указанной популяции клеток до и после контакта с указанным потенциальным фактором дифференцировки. 82. Способ согласно параграфу 79, который дополнительно включает этап определения экспрессии гена НОХС 6 в указанной популяции клеток до и после контакта с указанным потенциальным фактором дифференцировки. 83. Способ согласно параграфу 79, отличающийся тем, что указанный потенциальный фактор дифференцировки представляет собой малую молекулу. 84. Способ согласно параграфу 83, отличающийся тем, что указанная малая молекула представляет-7 011953 собой ретиноид. 85. Способ согласно параграфу 84, отличающийся тем, что указанный ретиноид представляет собой ретиноевую кислоту. 86. Способ согласно параграфу 79, отличающийся тем, что указанный потенциальный фактор дифференцировки представляет собой полипептид. 87. Способ согласно параграфу 79, отличающийся тем, что указанный потенциальный фактор дифференцировки представляет собой фактор роста. 88. Способ согласно параграфу 79, отличающийся тем, что указанный потенциальный фактор дифференцировки представляет собой FGF-10. 89. Способ идентификации фактора дифференцировки, способного стимулировать дифференцировку PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки, который включает следующие этапы: получение популяции, содержащей PDX1-положительные клетки передней кишки; приведение в контакт указанной популяции, содержащей PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки с потенциальным фактором дифференцировки; и определение того, увеличилась или уменьшилась экспрессия маркера в указанной популяции после контакта с потенциальным фактором дифференцировки по сравнению с уровнем экспрессии того же маркера в указанной популяции до приведения в контакт с потенциальным фактором дифференцировки,причем увеличение или уменьшение уровня экспрессии указанного маркера в указанной популяции указывает на то, что указанный потенциальный фактор дифференцировки способен стимулировать дифференцировку PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки. 90. Способ согласно параграфу 81, отличающийся тем, что экспрессию указанного маркера определяют способом количественной ПЦР. 91. Способ согласно параграфу 81, отличающийся тем, что указанный потенциальный фактор дифференцировки представляет собой малую молекулу. 92. Способ согласно параграфу 81, отличающийся тем, что указанный потенциальный фактор дифференцировки представляет собой полипептид. 93. Способ согласно параграфу 81, отличающийся тем, что указанный потенциальный фактор дифференцировки представляет собой фактор роста. 94. Вектор, содержащий репортерный ген, который функционально связан с регуляторной областьюPDX1. 95. Вектор согласно параграфу 94, отличающийся тем, что указанный репортерный ген представляет собой EGFP. 96. Клетка, содержащая вектор согласно параграфу 94. 97. Клетка согласно параграфу 97, в которой указанный репортерный ген, функционально связанный с регуляторной областью PDX1, встроен в хромосому. 98. Клетка согласно параграфу 97, в которой указанный репортерный ген представляет собой EGFP. 99. Клетка согласно параграфу 97, в которой указанный репортерный ген представляет собой EGFP. 100. Клетка согласно параграфу 97, которая является плюрипотентной. 101. Клетка согласно параграфу 100, которая представляется собой ЭСКч. 102. Клетка по п.97, которая представляет собой клетку дефинитивной энтодермы. 103. Клетка по п.97, которая представляет PDX1-положительную клетку энтодермы передней кишки. 104. Кондиционированная среда, приготовленная посредством следующих этапов: приведение в контакт свежей среды для культивирования клеток с популяцией дифференцированных ЭСКч в течение 24 ч, причем указанные ЭСКч предварительно подвергали дифференцировке в течение 5 дней в среде для культивирования клеток, выбранной из группы, состоящей из RPMI, дополненной 3% сыворотки, RPMI с низким содержанием сыворотки, дополненной активином А, и RPMI с низким содержанием сыворотки, дополненной ВМР 4; и удаление указанной популяции дифференцированных ЭСКч из среды. 105. Кондиционированная среда согласно параграфу 104, в которой свежая среда для культивирования клеток представляет собой RPMI. 106. Кондиционированная среда согласно параграфу 105, в которой RPMI представляет собой RPMI с низким содержанием сыворотки. 107. Способ кондиционирования среды, который включает следующие этапы: приведение в контакт свежей среды для культивирования клеток с популяцией дифференцированных ЭСКч в течение приблизительно 24 ч, причем указанные ЭСКч предварительно подвергали дифференцировке в течение 5 дней в среде для культивирования клеток, выбранной из группы, состоящей изRPMI, дополненной 3% сыворотки, RPMI с низким содержанием сыворотки, дополненной активином А и RPMI с низким содержанием сыворотки, дополненной ВМР 4; и удаление указанной популяции дифференцированных ЭСКч из среды. 108. Способ согласно параграфу 107, в котором свежая среда для культивирования клеток представляет собой RPMI. 109. Способ согласно параграфу 108, в котором RPMI представляет собой RPMII с низким содер-8 011953 жанием выворотки. Очевидно, что описанные выше способы и композиции относятся к клеткам, культивируемым in vitro. Однако описанные выше композиции дифференцированных in vitro клеток можно применять in vivo. Дополнительные способы реализации настоящего изобретения можно также найти в предварительной заявке на патент США 60/532004, озаглавленной DEFINITIVE ENDODERM (дефинитивная энтодерма), поданной 23 декабря 2003 г.; в предварительной заявке на патент США 60/566293, озаглавленной PDX1 EXPRESSING ENDODERM (PDX1-экспрессирующая энтодерма), поданной 27 апреля 2004 г., в предварительной заявке на патент США 60/586566, озаглавленной CHEMOKINE CELLSURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM (хемокиновый рецептор на поверхности клеток для выделения дефинитивной энтодермы), поданной 9 июля 2004 г.; и в предварительной заявке на патент CDJA60/587942, озаглавленной CELL SURFACE RECEPTOR FOR THEISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM (поверхностный рецептор клеток в выделении дефинитивной энтодермы), поданной 14 июля 2004 г.; и в предварительной заявке на патент США 11/021618, озаглавленной DEFINITIVE ENDODERM (дефинитивная энтодерма), поданной 23 декабря 2004 г. Краткое описание чертежей Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение предполагаемого пути дифференцировки для получения бета-клеток из ЭСКч. Первый этап этого пути направляет эмбриональную стволовую клетку по линии дифференцировки дефинитивной энтодермы и представляет собой один из наиболее ранних известных этапов дальнейшей дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в энтодерму,из которой развивается поджелудочная железа, эндокринные клетки или островковые/бета-клетки. Второй этап пути демонстрирует превращение SOX17-положительно/PDX1-отрицательной дефинитивной энтодермы в PDX1-положительную энтодерму передней кишки. Факторы, которые могут опосредовать эти переходы, выделены курсивом. Соответствующие маркеры для определения клеток-мишеней подчеркнуты. Фиг. 2 - схему расположения консервативных мотивов в кДНК SOX17 человека, на которой выделена область, используемая для процедуры иммунизации в компании GENOVAC (Германия). Фиг. 3 - древовидную диаграмму отношений, показывающую, что SOX17 наиболее близок SOX7 и несколько меньше - SOX18. Гомологичные белки SOX17 у разных видов более близки между собой по сравнению с отношением SOX17 к другим членам подсемейства F группы SOX у одного вида. Фиг. 4 - изображение результата анализа методом Вестерн-блот с использованием крысиного антиSOX17 антитела в качестве зонда. Этот результат демонстрирует специфичность данного антигена к белку SOX17 человека, уровень экспрессии которого в фибробластах повышен (over-expression) (полоска 1),и отсутствие иммунореактивности с EGFP (зеленый флуоресцирующий белок, полоска 2) и самым близким членом семейства SOX, SOX7 (полоска 3). Фиг. 5 А-В - микрофотографии, показывающие кластер SOX17-положительных (SOX17+) клеток,содержащий значительное количество клеток, помеченных одновременно и как AFP-положительные(альфа-фетопротеном). Он значительно отличается от других кластеров SOX17-положительных(SOX17+) клеток (В), в которых наблюдается небольшое количество AFP+ клеток, либо они вообще отсутствуют. Фиг. 6 А-C - микрофотографии, показывающие париетальную энтодерму и SOX17. На фотографии А показан результат иммуноцитохимического анализа на тромбомодулин (ТМ) человека, который локализован на поверхности клеток париетальной энтодермы, в дифференцированных случайным образом культурах эмбриональных стволовых клеток человека. Фотография В представляет собой поле, идентичное показанному на фотографии А, с двойной меткой на ТМ и SOX17. Фотография С представляет собой фазово-контрастное изображение того же поля с ядрами, окрашенными DAPI (4,6-диамидино-20-фенилиндол). Обратите внимание на полую корреляцию окрашенных ядер и метки SOX17. Фиг. 7 А-В - гистограммы, демонстрирующие экспрессию гена SOX17, определенную по методу количественной ПЦР и количество анти-SOX17-положительных клеток, которое определяют при помощиSOX17, в то время как ретиноевая кислота резко подавляет экспрессию SOX17 по сравнению с недифференцированной контрольной средой (SR20). Рисунок В демонстрирует, что эти изменения имеют идентичный профиль и сходную величину с изменениями числа SOX17+ клеток, что указывает на то, что измерение экспрессии гена SOX17 методом количественной ПЦР хорошо отражает изменения на уровне отдельной клетки. Фиг. 8 А - гистограмму, которая демонстрирует, что в культуре дифференцирующихся ЭСКч в присутствии активина А сохраняется низкий уровень экспрессии гена AFP, в то время как клетки, дифференцирующиеся случайным образом в среде, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, демонстрируют существенную повышающую регуляцию уровня альфа-фетопротеина (AFP). Разница в уровнях экспрессии приблизительно семикратная. Фиг. 8 В-С - изображения двух микрофотографий, демонстрирующих, что подавление экспрессииAFP активином А имеет место также на уровне одиночной клетки, на что указывает то, что в условиях обработки активином А (внизу) наблюдают очень редкие и меленькие кластеры AFP+ клеток по сравне-9 011953 нию со случаем, когда в среде содержится только 10% фетальной сыворотки (наверху). Очень редкие и меленькие кластеры AFP+ клеток по сравнению со случаем, когда в среде содержится только 10% фетальной сыворотки (наверху). Фиг. 9 А-В - рисунки для сравнения, на которых показано определение количества AFP+ клеток способом поточной цитометрии. Эта фигура демонстрирует, что величина изменения экспрессии генаAFP + клеток, что является дополнительным подтверждением применимости анализа способом количественной ПЦР для определения изменений, имеющих место на уровне отдельной клетки. Фиг. 10A-F - микрофотографии, которые демонстрируют, что воздействие на ЭСКч фактора nodal,активина А и активниа В (NAA) приводит к существенному увеличению числа SOX17+ клеток в течение 5 дней (А-С). По сравнению относительного количества SOX17+ клеток в общем числе клеток, присутствующих в каждом поле, которое определяли по числу ядер, окрашенных DAPI (D-F), можно увидеть,что после пятидневной обработки комбинацией NAA приблизительно 30-50% всех клеток являются иммунореактивными к SOX17. Фиг. 11 - гистограмму, которая демонстрирует, что активин А (0, 10, 30 или 100 нг/мл) вызывает зависящее от дозы повышение уровня экспрессии гена SOX17 в дифференцирующихся ЭСКч. Повышенная экспрессия устойчива через 3 дня обработки адгезивных культур, а также держится в течение последующих 1, 3 и 5 дней в суспензионных культурах. Фиг. 12 А-С - гистограммы, которые демонстрируют влияние активина А на экспрессию MIXL1(рисунок A), GATA4 (рисунок В) и HNF3b ( рисунок С). Зависимое от дозы активина А повышение уровней экспрессии наблюдается также для трех других маркеров дефинитивной энтодермы: MIXL1,GATA4 и HNF3b. Величина повышения уровня экспрессии в ответ на дозу активина поразительно сходна со значениями, наблюдаемыми для SOX17, что является решительным указанием на то, что активин А определяет популяцию клеток, которая экспрессирует одновременно все четыре гена (SOX17+, MIXL1+,GATA4+ и HNF3b+). Фиг. 13 А-С - гистограммы, которые демонстрируют влияние активина А на экспрессию AFP (рисунок A), SOX7 (рисунок В) и SPARC (панель С). Имеет место зависимое от дозы активина А снижение уровня экспрессии маркера висцеральной энтодермы AFP. Уровень маркеров недифференцированной энтодермы (SOX7) и париетальной энтодермы (SPARC) либо остается неизменным, либо демонстрирует снижение в определенные моменты времени, что указывает на то, что действие активина А не способствует выделению этих типов клеток внезародышевой энтодермы. Это также подтверждает тот факт, что повышенная экспрессия SOX17, MIXL1, GATA4 и HNF3b является следствием увеличения числа клеток дефинитивной энтодермы в ответ на воздействие активина А. Фиг. 14 А-В - гистограммы, демонстрирующие влияние активина А на экспрессию генов ZICl (рисунок А) и Brachyury (рисунок В). Устойчивая экспрессия маркера нейронов ZICl показывает, что активин А не оказывает дозозависимого влияния на дифференцировку нейронов. Имеет место заметное подавление дифференцировки мезодермы, вызываемое обработкой 100 нг/мл активина А, на что указывает снижение уровня экспрессии гена brachyury. Это, очевидно, является результатом усиленного образования дефинитивной энтодермы из предшественников мезодермы. При более низких уровнях активина А(10 и 30 нг/мл) экспрессия гена brachyury сохраняется в более поздние моменты времени дифференцировки по сравнению с контрольными культурами, не обработанными активином А. Фиг. 15 А-В - микрофотографии, показывающие снижение дифференцировки париетальной энтодермы в ответ на обработку активинами. В культуре (А), дифференцирующейся в среде, содержащей только сыворотку, найдены области париетальной энтодермы TMhi (высокий уровень экспрессии гена тромбомодулина), в то время как дифференцировка в ТМ+ клетки при введении в среду активинов (В) встречается редко, а общая интенсивность иммунореактивности - ниже. Фиг. 16A-D - микрофотографии, показывающие экспрессию маркеров в ответ на обработку активином А и активином В. ЭСКч в течение четырех последовательных дней обрабатывали активином А и активином В и метили антителами к SOX17, AFP и ТМ. Рисунок A - SOX17; рисунок B - AFP; рисунок С ТМ и рисунок D - фазовый контраст/DAPI. Обратите внимание на многочисленность SOX17 положительных клеток (А), связанную с полным отсутствием иммунореактивности AFP (В) и ТМ (С). Фиг. 17 - микрофотографию, показывающую возникновение дефинитивной энтодермы и висцеральной энтодермы in vitro из ЭСКч. Области висцеральной энтодермы определяют по AFPhi/SOXlo/-, а области дефинитивной энтодермы демонстрируют полностью противоположный профиль: SOX17/AFPlo/-. Данное поле было выбрано из-за близости этих двух областей друг к другу. Однако часто областиSOX17hi/AFPlo/- наблюдаются в абсолютной изоляции от любых областей, содержащих клетки AFPhi, что позволяет сделать предположение о раздельном происхождении клеток дефинитивной энтодермы и клеток висцеральной энтодермы. Фиг. 18 - схему, изображающую семейство TGF лигандов и рецепторов. Факторы, активирующие белки AR Smads и BR Smads полезны в получении дефинитивной энтодермы из эмбриональных стволовых клеток человека. (См. У. Cellphysiol. 187: 265-76). Фиг. 19 - гистограмму, показывающую индукцию экспрессии SOX17 в динамике по времени как- 10011953 результат обработки отдельными факторами TGF или их комбинациями. Фиг. 20 - гистограмму, показывающую увеличение числа SOX17+ клеток со временем в результате обработки комбинациями факторов TGF. Фиг. 21 - гистограмму, показывающую индукцию экспрессии SOX17 в динамике по времени как результат обработки комбинациями факторами TGF. Фиг. 22 - гистограмму, которая показывает, как активин А индуцирует дозозависимое увеличение числа SOX17+ клеток. Фиг. 23 - гистограмму, которая показывает, что добавлениеWnt3a к обработанным активином А и активином В культурам повышает уровень экспрессии SOX17 по сравнению с уровнями, индуцированными только активином А и активином В. Фиг. 24 А-C - гистограммы, показывающие, что дифференцировка в дефинитивную энтодерму усиливается в условиях с пониженным содержанием фетальной сыворотки. Обработка ЭСКч активинами А и В в среде, содержащей 2% фетальной сыворотки (2 АА), дает уровень экспрессии SOX17, в 2-3 раза превышающий уровень, получаемый при такой же обработке в среде, содержащей 10% фетальной сыворотки (10 АА) (рисунок А). Содержание фетальной сыворотки такое же влияние оказывает и на маркер дефинитивной энтодермы MIXL1 (рисунок В), а подавление AFP (висцеральная энтодерма) (рисунок С) больше в среде с 2% фетальной сыворотки, чем в среде с 10% фетальной сыворотки. Фиг. 25A-D - микрофотографии, которые показывают деление клеток SOX17+ в культуре. SOX17 иммунореактивные клетки присутствуют на дифференцирующейся границе колонии ЭСКч (С, D), они помечены ядерным антигеном пролиферирующих клеток (PCNA) (рисунок В), но не помечены одновременно ОСТ 4 (рисунок 1 С). Кроме того, DAPI-мечение ядер клеток SOX17+(стрелки) и клеток ОСТ 4+,недифференцированных ЭСКч (стрелки-указатели) (D), позволяет увидеть отчетливые картины митоза. Фиг. 26 - гистограмму, показывающую относительный уровень экспрессии CXCR4 в дифференцирующихся клетках ЭСКч в различных условиях среды. Фиг. 27A-D - гистограммы, демонстрирующие, что маркеры из панели маркеров дефинитивной энтодермы имеют сходный профиль экспрессии с CXCR4 в тех же условиях дифференцировки, что описаны для фиг. 26. Фиг. 28 А-Е - гистограммы, показывающие, что экспрессия маркеров энтодермы (BRACHYURY,MOX1), эктодермы (SOX1, ZICl) и висцеральной энтодермы (SOX7) демонстрирует обратное отношение к экспрессии CXCR4 в условиях обработки, показанных на фиг. 26. Фиг. 29A-F - микрофотографии, которые показывают относительные различия в SOX17 иммунореактивных клетках в условиях среды, описанных на фиг. 26-28. Фиг. 30 А-С - диаграммы рассеяния поточной цитометрии, которые демонстрируют увеличение числа CXCR4+ клеток при увеличении концентрации активина А, добавляемого в среду для дифференцировки. Фиг. 31A-D - гистограммы, которые показывают, что CXCR4+ клетки, выделенные из культуры,обработанной высокими дозами активина А (А 100-СХ+), оказываются даже более обогащенными маркерами дефинитивной энтодермы, чем родительская популяция. Фиг. 32 - гистограмму, показывающую экспрессию генов в CXCR4+ и CXCR4-клетках, разделенных способом проточной сортировки клеток (FACS), а также экспрессию генов в родительской популяции. Эта гистограмма демонстрирует, что практически всю экспрессию гена CXCR4, присущую каждой родительской популяции, осуществляют клетки CXCR4+, a CXCR4-популяции осуществляют очень незначительную часть экспрессии гена CXCR4, либо вообще не экспрессируют этот ген. Фиг. 33A-D - гистограммы, которые демонстрируют падение экспрессии генов мезодермы(BRACHYURY, MOX1) эктодермы (ZICl) и висцеральной энтодермы (SOX7) в CXCR4+ клетках, выделенных из популяции, обработанной высокой дозой активина А, в которой экспрессия этих маркеров недефинитивной энтодермы уже подавлена. Фиг. 34 А-М - гистограммы, показывающие профиль экспрессии генов - маркеров, которые можно использовать для идентификации клеток дефинитивной энтодермы. Анализ экспрессии маркеров дефинитивной энтодермы, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1 и CRIP1, показан на рисунках G-L соответственно. Анализ экспрессии генов-маркеров линий дифференцировки, описанных ниже, SOX17,SOX7, SOX17/SOX7, ТМ, ZICl и MOXl, показан на рисунках A-F соответственно. На рисунке М показан анализ экспрессии CXCR4. На рисунках А-М столбец, обозначенный ЭСКч (hESC), показывает экспрессию генов очищенными эмбриональными стволовыми клетками человека, 2NF обозначает клетки, обработанные 2% фетальной сыворотки без добавления активина, 0,1 А 100 обозначает клетки, обработанные 0,1% фетальной сыворотки, 100 нг/мл активина А, 1 А 100 обозначает клетки, обработанные 1% фетальной сыворотки, 100 нг/мл активина А; а 2 А 100 обозначает клетки, обработанные 2% фетальной сыворотки, 100 нг/мл активина А. Фиг. 35 - гистограмму, показывающую относительную экспрессию гена PDX1 в культуре ЭСКч после 4 и 6 дней с активином и без него в присутствии ретиноевой кислоты (RA) и фактора роста фибробластов (FGF-10), добавленных в день 4.- 11011953 Фиг. 36A-F - гистограммы, демонстрирующие относительную экспрессию маркерных генов в культуре ЭСКч после 4 и 6 дней с активином и без него в присутствии ретиноевой кислоты (RA) и фактора роста фибробластов (FGF-10), добавленных в день 4. На рисунках показаны относительные уровни экспрессии следующих маркерных генов: (A) SOX17, (В) SOX7, (С) AFP, (D) SOX1, (Е) ZICl и (F) NFM. Фиг. 37 А-С - гистограммы, демонстрирующие относительную экспрессию маркерных генов в культуре ЭСКч после 4 и 8 дней с активином и без него в присутствии или в отсутствие комбинаций ретиноевой кислоты (RA), фактора роста фибробластов (FGF-10) и фактора роста фибробластов (FGF-4), которые добавляли в день 4. На рисунках показаны относительные уровни экспрессии следующих маркерных генов: (A) PDX1, (В) SOX7 и (С) NFM. Фиг. 38A-G - гистограммы, демонстрирующие экспрессию маркерных генов в культуре клеток дефинитивной энтодермы, приведенных в контакт с 50 нг/мл FGF-10 в комбинации с 1 мкМ, 0,2 мкМ или 0,04 мкМ ретиноевой кислоты (RA), которые добавляли в день 4. Рисунки демонстрируют относительные уровни экспрессии следующих маркерных генов: (A) PDX1, (В) НОХА 3, (С) НОХС 6, (D) HOXA13,(Е) CDX1, (F) SOX1 и (G) NFM. Фиг. 39 А-Е - гистограммы, которые демонстрируют относительную экспрессию маркерных генов в культуре ЭСКч после 4 дней и 8 дней с активином и без него в присутствии комбинаций ретиноевой кислоты (RA), фактора роста фибробластов (FGF-10) и одного из следующих компонентов: заменителя сыворотки (SR), фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) или В 27. Рисунки показывают относительные уровни экспрессии следующих маркерных генов: (A) PDX1, (В) SOX7, (С) AFP, (D) ZICl и (Е)NFM. Фиг. 40 А-В - гистограммы, которые демонстрируют относительную экспрессию маркерных генов поджелудочной железы (PDX1, HNF6) и печени (HNF6) в культуре ЭСКч после 6 дней (непосредственно перед добавлением ретиноевой кислоты) и на 9 день (через 3 дня после воздействия ретиноевой кислоты). В эксперимент были включены разнообразные условия для сравнения добавления активина В в дозах 10 нг/мл (a10), 25 нг/мл (а 25) или 50 нг/мл (а 50) в присутствии либо 25 нг/мл (А 25), либо 50 нг/мл(А 50) активина А. Условия отсутствия активина А и активина В (NF) служат в качестве отрицательного контроля образования дефинитивной энтодермы и PDX1-положительной энтодермы. Рисунки демонстрируют относительные уровни экспрессии следующих маркерных генов: (А) PDX1 и (В) HNF6. Фиг. 41 А-C - гистограммы, которые демонстрируют относительную экспрессию маркерных генов в культуре ЭСКч с нг/мл (А 100), 50 нг/мл (А 50) или без (NF) активина А на 5 день (непосредственно перед добавлением ретиноевой кислоты) и на 2, 4 и 6 дни после воздействия ретиноевой кислоты (дни 7, 9 и 11 соответственно). Процентная доля, указанная под каждым столбиком, обозначает дозу фетальной сыворотки в 3-5 дни дифференцировки. Начиная с дня 7, клетки, обработанные ретиноевой кислотой (R), выращивали в среде RPMI, содержащей 0,5% фетальной сыворотки. Концентрация ретиноевой кислоты составляла 2 мкМ в день 7, 1 мкМ в день 9 и 0,2 мкМ в день 11. Рисунки демонстрируют относительные уровни экспрессии следующих маркерных генов: (A) PDX1, (В) ZICl, (С) SOX7. Фиг. 42 А-В - диаграммы, которые демонстрируют относительную экспрессию маркерных генов в культуре ЭСКч, обработанных активином А при низкой концентрации фетальной сыворотки с целью стимулировать дефинитивную энтодерму (день 5) и затем свежей (A25R) средой, содержащей 25 нг/мл активина А и ретиноевой кислотой, либо различными кондиционированными средами (MEFCM, CM2,CM3 и CM4) и ретиноевой кислотой с целью стимулировать PDX1-экспрессирующую энтодерму. Экспрессию маркеров определяли в дни 5, 6, 7, 8 и 9. Рисунки демонстрируют относительные уровни экспрессии следующих маркерных генов: (A) PDX1; (В) CDX1. Фиг. 43 - гистограмму, которая демонстрирует относительную экспрессию PDX1 в культуре ЭСКч,обработанной активином А при низкой концентрации фетальной сыворотки с целью стимулировать дефинитивную энтодерму, и затем свежей средой, содержащей активин А или ретиноевую кислоту (A25R),либо различными количествами ретиноевой кислоты в кондиционированной среде, разведенной в свежей среде. Во всех случаях общий объем сыворотки составлял 5 мл. Фиг. 44 - результат анализа способом Вестерн-блот, демонстрирующий PDX1, полученный посредством иммунопреципитации из обработанных ретиноевой кислотой клеток дефинитивной энтодермы на 3 (d8) и 4 (d9) дни после добавления ретиноевой кислоты и 50 нг/мл активина А. Фиг. 45 - сводную гистограмму, отражающую результаты активированной флуоресценцией сортировки клеток в потоке (FACS) PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки, генетически меченых репортерным геном EGFP под контролем промотора PDX1. Фиг. 46 - гистограмму, демонстрирующую относительные уровни экспрессии PDX1, нормированные по генам домашнего хозяйства (housekeeping genes), для отсортированных популяций живых клеток (Live), EGFP-отрицательных клеток (Neg) и EGFP-положительных клеток (GFP+). Фиг. 47 - гистограмму, демонстрирующую относительные уровни экспрессии PDX1, нормированные по генам домашнего хозяйства (housekeeping), для отсортированных популяций живых клеток,(Live), EGFP-отрицательных клеток (Neg), половину популяции EGFP-положительных клеток с самой низкой интенсивностью сигнала EGFP (Lo) и половины популяции EGFP-положительных клеток с самой высокой интенсивностью сигнала EGFP (Hi).- 12011953 Фиг. 48 А-Е - гистограммы, демонстрирующие относительные уровни экспрессии, нормированные по генам домашнего хозяйства (housekeeping), пяти маркеров панкреатической энтодермы в отсортированных популяциях живых клеток (Live), EGFP-отрицательных клеток (Neg) и EGFP-положительных клеток (GFP+). Рисунки: А - NKX2.2, В - GLUT2, С - HNF3, D - KRT19 И E - HNF4. Фиг. 49 - гистограммы, демонстрирующие относительные уровни экспрессии, нормированные по генам домашнего хозяйства (housekeeping), двух маркеров непанкреатической энтодермы (Neg) иEGFP-положительных клеток (GFP+). Рисунки: А - ZICl и В - GFAP. Подробное описание изобретения Критический этап раннего развития человеческого организма, называемый гаструляцией, начинается через 2-3 недели после оплодотворения. Гаструляция исключительно важна, поскольку именно в это время выделяются и организуются три первичных зародышевых листка (Lu et al., 2001; Schoenwolf,Smith, 2000). Из эктодермы впоследствии образуются наружные покровы тела и вся нервная система, в то время как сердце, кровь, скелетные мышцы и другие соединительные ткани являются производными мезодермы. Дефинитивной энтодермой называют зародышевый листок, ответственный за образование всей кишечной трубки, которая включает пищевод, желудок, толстый и тонкий кишечник, а также органы, которые являются производными кишечной трубки, такие как легкие, печень, тимус, паращитовидные железы, щитовидная железа, желчный пузырь и поджелудочная железа (Grapin-Botton, Melton, 2000;Kimelman, Griffin, 2000; Tremblay et al., 2000; Wells, Melton, 1999; Wells, Melton, 2000). Необходимо различать дефинитивную энтодерму и совершенно отдельную линию дифференцировки клеток, называемой первичной энтодермой. Первичная энтодерма в первую очередь отвечает за образование внезародышевых тканей, главным образом - париетальной и висцеральной частей энтодермы желточного мешка плаценты и материала внеклеточного матрикса оболочки Райхерта. Образование дефинитивной энтодермы в ходе процесса гаструляции начинается с миграции клеток,при которой клетки мезэнтодермы (клетки, из которых может образоваться мезодерма или энтодерма) мигрируют через структуру, называемую первичной полоской. Дефинитивная энтодерма образуется из клеток, которые мигрируют через переднюю часть полоски и через узелок (специализированная структура в передней области полоски). После миграции дефинитивная энтодерма в первую очередь заполняет переднюю часть кишечной трубки, а в последнюю очередь образует задний конец кишечной трубки. Экспрессия гена PDX1 в процессе развитияPDX1 (называемый также STF-1, IDX-1 и IPF-1) представляет собой фактор транскрипции, необходимый для развития поджелудочной железы и ростральной двенадцатиперстной кишки. PDX1 начинает экспрессироваться в панкреатической энтодерме, которая образуется из энтодермы задней части передней (головной) кишки и из которой образуются как экзокринные, так и эндокринные клетки, начиная с Е 8.5 (у мышей). Позднее, экспрессия PDX1 ограничена бета-клетками и частью дельта-клеток. Этот профиль экспрессии сохраняется во взрослом организме. PDX1 также экспрессируется в дуоденальной энтодерме в процессе раннего развития, приблизительно во время образования поджелудочной железы, затем в дуоденальных энтероцитах и в энтероэндокринных клетках, в антральном отделе желудка, а также в общем желчном, пузырном и желчных протоках. При ограничении экспрессии поджелудочной железой эта область экспрессии также ограничивается, главным образом, ростральной двенадцатиперстной кишкой.PDX1-Положительные клетки и связанные с ними способы Примеры реализации настоящего изобретения относятся к определенным новым способам получения PDX1-положительных клеток энтодермы, в которых PDX1-положительные клетки энтодермы являются мультипотентными клетками и могут дифференцироваться в клетки, ткани или органы, образующиеся из передней/средней частей кишечной трубки (PDX1-положительная энтодерма передней кишки/средней кишки). В настоящей заявке термин "мультипотентная" или "мультипотентная клетка" относится к типу клеток, которые могут дать начало ограниченному числу других отдельных типов клеток. В настоящей заявке термин "передняя кишка/средняя кишка" относится к клеткам передней части кишечной трубки, а также к клеткам средней части кишечной трубки, включая клетки в области границы передняя кишка/средняя кишка. Некоторые предпочтительные примеры реализации настоящего изобретения относятся к способам получения PDX1-положительных клеток энтодермы прямой кишки. В некоторых примерах реализации эти PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки представляют собой мультипотентные клетки, которые могут дифференцироваться в клетки, ткани или органы, образующиеся из передней части кишечной трубки (PDX1-положительной энтодермы передней кишки). Дополнительные предпочтительные способы реализации относятся к получению PDX1 положительных клеток энтодермы задней части передней кишки. В некоторых примерах реализации этиPDX1-положительные клетки энтодермы являются мультипотентными клетками, которые могут дифференцироваться в клетки, ткани или органы, образующиеся из задней части области передней кишки кишечной трубки.PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки, такие как те, которые получают описанными здесь способами, можно применять для получения полностью дифференцированных инсулин- 13011953 продуцирующих бета-клеток. В некоторых способах реализации настоящего изобретения PDX1 положительные клетки энтодермы передней кишки получают посредством дифференцировки клеток дефинитивной энтодермы, которые практически не экспрессируют PDX1 (PDX1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы, также называемой здесь дефинитивной энтодермой) с образованием PDX1 положительных клеток энтодермы передней кишки. PDX1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы можно получить посредством дифференцировки плюрипотентных клеток, таких как эмбриональные стволовые клетки, проводимой, как описано в настоящей заявке или любыми другими известными способами. Удобный и высокоэффективный способ получения PDX1-отрицательной дефинитивной энтодермы из плюрипотентных клеток описан в патенте США 11/021618, озаглавленном DEFINITIVEENDODERM (дефинитивная энтодерма), поданной 23 декабря 2004 г. Способы получения PDX1-положительных клеток обеспечивают основу для эффективного получения ацинусных клеток, клеток протоков и островковых клеток из плюрипотентных клеток. В определенных предпочтительных способах реализации PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки человека получают из PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы человека, которые, в свою очередь, получают из ЭСКч. Эти PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки человека можно затем применять для получения функциональных инсулинпродуцирующих бета-клеток. Для получения инсулинпродуцирующих -клеток, в количествах, которые могут быть полезны, желательно обеспечить высокую эффективность дифференцировки на каждом этапе дифференцировки, предшествующем образованию клеток поджелудочной железы. Поскольку дифференцировка PDX1 отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки представляет собой ранний этап пути получения функциональных островковых/бета-клеток (как показано на фиг. 1), высокая эффективность этого этапа является особенно желательной. Поскольку желательно, чтобы дифференцировка PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки была эффективной, некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к in vitro методике, результатом которой является превращение приблизительно 2-25% PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки. Обычно такие способы включают применение определенных условий культивирования и факторов роста в установленной временной последовательности. Дальнейшего обогащения популяции клеток PDX1-положительными клетками энтодермы передней кишки можно достичь путем выделения и/или очистки PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки от(из) других клеток популяции посредством использования реагента, который специфически связывает PDX1 положительные клетки энтодермы передней кишки. В качестве альтернативы PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки можно пометить репортерным геном, таким как ген флуоресцирующего зеленого белка (GFP), что позволяет определять экспрессию PDX1. Такие клетки с флуоресцентной меткой можно затем очищать способом активированной флуоресценцией сортировки клеток в потоке(FACS). Другие аспекты настоящего изобретения относятся к культурам клеток и обогащенным популяциям клеток, содержащим PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки, а также к способам идентификации факторов, полезных в дифференцировке и в образовании PDX1-положительной энтодермы передней кишки. Чтобы определить количество PDX1-положительных клеток энтодермы в культуре клеток или популяции клеток, желательно иметь способ отличать их от других клеток в культуре или популяции. Соответственно, определенные примеры реализации настоящего изобретения относятся к маркерам клеток,присутствие, отсутствие и/или относительные уровни экспрессии которых указывают на PDX1 положительные клетки энтодермы передней кишки, а к также способам обнаружения и определения экспрессии таких маркеров. В настоящей заявке "экспрессия" обозначает продуцирование продукта или вещества, а также уровень или количество продуцирования продукта или вещества. Таким образом, определение экспрессии конкретных маркеров обозначает определение относительного или абсолютного количества экспрессируемого маркера или определение присутствия или отсутствия маркера. В настоящей заявке термин "маркер" обозначает любую молекулу, которую можно наблюдать или обнаруживать. Например, маркер может включать, без ограничения, нуклеиновую кислоту, такую как транскрипт конкретного гена, полипептид, являющийся продуктом гена, полипептид, не являющийся продуктом гена,гликопротеин, углевод, гликолипид, липид, липопротеин или молекулу малого размера (например, молекулы с молекулярной массой менее 10,000 а.е.м.). В некоторых способах реализации настоящего изобретения присутствие, отсутствие и/или уровень экспрессии маркера определяют способом количественной ПЦР. Например, количество транскрипта,образуемого определенными генетическими макрерами, такими как PDX1, SOX17, SOX7, SOX1, ZICl,NFM, альфа-фетопротеин (AFP), гомеобокс А 13 (НОХА 13), гомеобокс С 6 (НОХС 6), и/или другими маркерами, описанными в настоящей заявке, определяют способом количественной ПЦР. В других примерах реализации для определения белков, экспрессируемых вышеупомянутыми генами, применяют иммуноцитохимический подход. В других способах реализации для определения количества или относительных долей таких маркеров используют и способы иммуногистохимии и способ количественной ПЦР. Применение описанных в настоящей заявке способов дифференцировки и обнаружения позволяет- 14011953 идентифицировать PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки, а также определять долюPDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки в культуре клеток или популяции клеток. Например, в некоторых способах реализации настоящего изобретения уровень экспрессии гена PDX1 получаемыми PDX1-положительными клетками энтодермы передней кишки или популяциями PDX1 положительных клеток энтодермы передней кишки по меньшей мере на 2 порядка величины выше, чем уPDX1-отрицательных клеток или популяций клеток. В других способах реализации настоящего изобретения уровень экспрессии гена PDX1 получаемыми PDX1-положительными клетками энтодермы передней кишки или популяциями PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки по меньшей мере на 2 порядка величины выше, чем у PDX1-отрицательных клеток или популяций клеток. В дальнейших способах реализации получаемые PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки или популяции PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки экспрессируют один или более маркеров,выбранных из группы, состоящей из PDX1, SOX17, НОХА 13 и НОХС 6 на уровне, который на 2 или более чем на 2 порядка величины выше, чем у PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы или популяций клеток. Композиции и способы, описанные в настоящей заявке, имеют несколько полезных свойств. Например, культуры клеток и популяции клеток, содержащие PDX1-положительную энтодерму, а также способы получения таких культур клеток и популяций клеток, можно применять для моделирования ранних стадий развития человека. Кроме того, описанные в настоящей заявке композиции и способы также служат для терапевтического вмешательства при таких болезненных состояниях, как сахарный диабет. Например, поскольку PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки служат источником лишь ограниченного числа тканей, их можно использовать для образования чистых типов тканей или клеток. Получение PDX1-отрицательной дефинитивной энтодермы (дефинитивной энтодермы) из плюрипотентных клеток Культуры клеток и/или популяции клеток, содержащие PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки, получают из плюрипотентных клеток посредством предварительного получения PDX1 отрицательной дефинитивной энтодермы (называемой также "дефинитивной энтодермой"). Способы дифференцировки плюрипотентных клеток с целью получения культур клеток и обогащенных популяций клеток, содержащих дефинитивную энтодерму, кратко описаны ниже, а подробно - в патенте США 11/021618, озаглавленном DEFINITIVE ENDODERM (дефинитивная энтодерма), поданном 23 декабря 2004 г. В некоторых из этих способов плюрипотентные клетки, которые используют в качестве исходного материала, представляют собой стволовые клетки. В определенных способах культуры клеток дефинитивной энтодермы и обогащенные популяции клеток, содержащие клетки дефинитивной энтодермы,получают из эмбриональных стволовых клеток. Эмбриональными называется здесь ряд стадий развития организма, начиная с единственной клетки зиготы и заканчивая многоклеточной структурой, которая уже не содержит других плюрипотентных или тотипотентных клеток, кроме развитых гамет. Кроме эмбрионов, образовавшихся в результате слияния гамет, термин эмбриональный относится к эмбрионам,возникшим в результате переноса ядер соматических клеток. В предпочтительном способе получения клеток дефинитивной энтодермы в качестве исходного материала для клеток дефинитивной энтодермы применяют эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСКч). Такие плюрипотентные клетки могут представлять собой клетки, взятые из морулы, внутренней клеточной массы эмбриона, или клетки, полученные из гонадных валиков эмбриона. Эмбриональные стволовые клетки человека можно поддерживать в культуре в плюрипотентном состоянии без существенной дифференцировки при помощи хорошо известных в данной области способов. Такие способы описаны, например, в патентах США 5453357,5670372, 5690926, 5843780, 6200806 и 6251671. В некоторых способах получения клеток дефинитивной энтодермы ЭСКч поддерживают на слое фидерных клеток. В таких способах можно использовать любой фидерный слой, позволяющий поддерживать ЭСКч в плюрипотентном состоянии. Примером обычно используемых для культивирования эмбриональных стволовых клеток человека фидерных слоев является слой фибробластов мыши. Позднее был разработан слой фидерных фибробластов человека для культивирования ЭСКч (см. заявку на патент США 2002/0072117). Альтернативные способы получения дефинитивной энтодермы позволяют поддерживать плюрипотентные ЭСКч без фидерного слоя. Способы поддержания ЭСКч без фидерного слоя описаны в заявке на патент США 2003/0175956. Используемые в настоящем изобретении эмбриональные стволовые клетки человека можно поддерживать в культуре с добавлением сыворотки либо без нее. В некоторых процедурах поддержания эмбриональных стволовых клеток применяют заменители сыворотки. В других применяют методики культивирования без сыворотки, например, описанные в заявке на патент США 2003/0190748. Стволовые клетки поддерживают в культуре в плюрипотентном состоянии путем повторяющегося пересева до тех пор, пока не станет желательной их дифференцировка в дефинитивную энтодерму. В некоторых способах дифференцировки в клетки дефинитивной энтодермы достигают, добавляя в культуру стволовых клеток факторы роста надсемейства трансформирующих факторов роста бета (TGFP) в количестве, достаточном для того, чтобы стимулировать дифференцировку в дефинитивную энтодерму.- 15011953 Факторы роста, которые можно применять для получения дефинитивной энтодермы, выбирают из подгрупп Nodal/активин или белка морфогенеза костей (BMP). В некоторых предпочтительных способах дифференцировки фактор роста выбирают из группы, состоящей из белка Nodal, активина А, активина В и ВМР 4. Кроме того, для получения клеток дефинитивной энтодермы можно применять фактор ростаWnt3a и другие члены семейства Wnt. В определенных способах дифференцировки можно применять комбинации описанных выше факторов роста. В некоторых воплощениях описанных здесь способов дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в клетки дефинитивной энтодермы к клеткам добавляют упомянутые выше факторы таким образом, чтобы факторы роста присутствовали в культуре в концентрациях, достаточных для того, чтобы стимулировать дифференцировку по меньшей мере части стволовых клеток в дефинитивную энтодерму. В некоторых способах упомянутые выше факторы роста присутствуют в культуре в концентрации, равной по меньшей мере приблизительно 5 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 10 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 25 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 50 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 75 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 100 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 200 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 300 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 400 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 500 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 1000 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 2000 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 3000 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 4000 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 5000 нг/мл или больше чем приблизительно 5000 нг/мл. В определенных способах упомянутые выше факторы роста после добавления в культуру клеток удаляют. Например, можно удалять факторы не позднее приблизительно одного дня, приблизительно двух дней, приблизительно трех дней, приблизительно четырех дней, приблизительно пяти дней, приблизительно шести дней, приблизительно семи дней, приблизительно восьми дней, приблизительно девяти дней или приблизительно десяти дней после добавления. В предпочтительных способах реализации изобретения факторы роста удаляют через приблизительно четыре дня после добавления. Культуры клеток дефинитивной энтодермы можно выращивать в среде с пониженным содержанием сыворотки или без сыворотки. В определенных условиях культивирования концентрация сыворотки может оставлять приблизительно от 0,05 до 20% об./об. Например, в определенных способах дифференцировки концентрация сыворотки в среде может быть меньше приблизительно 0,05% (об./об.), меньше приблизительно 0,1% (об./об.), меньше приблизительно 0,2% (об./об.), меньше приблизительно 0,3%(об./об.), меньше приблизительно 15% (об./об.) или меньше приблизительно 20% (об./об.). В некоторых способах клетки дефинитивной энтодермы выращивают без сыворотки или с заменителем сыворотки. В других способах клетки дефинитивной энтодермы выращивают в присутствии В 27. В таких способах реализации концентрация добавки может составлять приблизительно от 0,2 до 20% об./об. Мониторинг дифференцировки плюрипотентных клеток в PDX1-отрицательную дефинитивную энтодерму (дефинитивную энтодерму) За развитием культуры ЭСКч в дефинитивную энтодерму можно следить, определяя экспрессию маркеров, характерных для дефинитивной энтодермы. В некоторых способах экспрессию конкретных маркеров определяют, устанавливая присутствие или отсутствие этого маркера. В качестве альтернативы, экспрессию конкретных маркеров можно определять путем измерения уровня этого маркера в культуре клеток или популяции клеток. В таких способах измерение экспрессии маркера может быть качественным или количественным. Один из способов количественной оценки экспрессии маркера с генов этого маркера осуществляют посредством применения количественной ПЦР. Способы выполнения количественной ПЦР хорошо известны в данной области. Для количественной оценки экспрессии гена маркера можно также применять другие способы, известные в данной области. Например, экспрессию продукта маркерного гена можно регистрировать при помощи антител, специфических к продуктам гена интересующего исследователя маркера. В некоторых способах определяют как экспрессию маркерных генов,характерных для дефинитивной энтодермы, так и отсутствие значительной экспрессии генов маркеров,характерных для ЭСКч и других типов клеток. Как описано в приведенных ниже примерах, надежным маркером дефинитивной энтодермы является ген SOX17. Поэтому клетки дефинитивной энтодермы, полученные описанными здесь способами,экспрессируют маркерный ген SOX17, продуцируя продукт гена SOX17. Другие маркеры дефинитивной энтодермы: MIXL1, GATA4, HNF3b, GSC, FGF17, VWF, CALCR, CMKOR1 и CRIP1. Поскольку клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют маркерный ген SOX17 на более высоком уровне, чем маркерный ген SOX7, который характерен для примитивной и висцеральной энтодермы (см. табл. 1), в некоторых способах отслеживают экспрессию обоих маркеров: SOX17 и SOX7. В других способах отслежива- 16011953 ют экспрессию маркерного гена SOX17 и маркерного гена ОСТ 4, который является характеристикой ЭСКч. Кроме того, поскольку клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют маркерный ген SOX17 на более высоком уровне, чем маркерные гены AFP, SPARC и ген тромбомодулина (ТМ), можно также отслеживать экспрессию этих генов. Ген CXCR4 кодирует поверхностный рецептор хемокинов, лигандом которого является хемоаттрактант SDF-1. Считают, что несущие рецептор CXCR4 клетки во взрослом организме играют решающую роль в миграции гематопоэтических клеток в костный мозг, в направленной миграции лимфоцитов и в дифференцировке различных линий В-клеток и макрофагов крови [Kim., С, Broxmeyer, H. J. Leukocyte Biol. 65,6-15 (1999)]. Рецептор CXCR4 также функционирует как корецептор для проникновения ВИЧ-1 в Т-лимфоциты [Feng, Y., et al. Science, 272, 872-877 (1996)]. В результате обширной серии исследований, проведенной [McGrath, K.Е. et al. Dev. Biology 213, 442-456 (1999)], проследили экспрессию рецептора хемокинов - CXCR4 и его единственного лиганда SDF-1 [Kim, С., Broxmyer, Н., J. LeukocyteBiol. 65,6-15 (1999)], на протяжении раннего развития и взрослой жизни мыши. ВзаимодействиеCXR4/SDF1 в процессе развития стало очевидным после того, как продемонстрировали, что разрушение любого из соответствующих этим белкам генов у трансгенных мышей [Nagasawa et al. Nature, 382, 35-638(1996)], Ma, Q., et al. Immunity, 10, 463-471 (1999)] приводило к смерти эмбрионов на поздних стадиях развития. McGrath et al. с использованием защиты от рибонуклеаз и методик гибридизации in situ продемонстрировали, что CXCR4 представляет собой наиболее распространенную мРНК рецепторов хемокинов, обнаруживаемую на ранних стадиях гаструляции зародыша (Е 7.5). В эмбрионе на стадии гаструляции передача сигнала комплексами CXR4/SDF1, видимо, играет роль главным образом в миграции клеток первичной полоски зародышевого листка и имеет место в дефинитивной энтодерме, мезодерме и внезародышевой мезодерме, существующих на этом этапе. В эмбрионах мыши Е 7.2-7.8 присутствиеCXCR4 и альфа-фетопротеина являются взаимоисключающим, указывая на отсутствие экспрессии в висцеральной энтодерме [McGrath, K. Е. et al. Dev. Biology 213, 442-456 (1999)]. Поскольку клетки дефинитивной энтодермы, полученные посредством дифференцировки плюрипотентных клеток, экспрессируют маркерный ген CXCR4, можно измерять экспрессию CXCR4, чтобы прослеживать образование клеток дефинитивной энтодермы. Дополнительно полученные описанными здесь способами клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют другие маркеры дефинитивной энтодермы,включая, без ограничения, SOX17, MIXL1, GATA4, HNF3b, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1,CMKOR1 и CRIP1. Поскольку клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют маркерный ген CXCR4 на более высоком уровне, чем маркерный ген SOX7, можно исследовать экспрессию обоих маркерных генов СХСР 4 и SOX7. В других способах одновременно отслеживают экспрессию маркерного генаCXCR4 и маркерного гена ОСТ 4. Кроме того, поскольку клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют маркерный ген CXCR4 на более высоком уровне, чем маркерные гены AFP, SPARC и ген тромбомодулина (ТМ), также можно отслеживать экспрессию этих маркерных генов. Очевидно, что экспрессия CXCR4 в клетках энтодермы не исключает экспрессии SOX17. Поэтому полученные описанными здесь способами клетки дефинитивной энтодермы будут экспрессироватьSOX17 и CXCR4 на значительном уровне, но не будут экспрессировать на значительном уровне AFP,TM, SPARC и PDX1. Обогащение, выделение и/или очистка дефинитивной энтодермы Полученные любым из описанных выше способом клетки дефинитивной энтодермы можно обогащать, выделять и/или очищать, используя аффинные метки, специфичные к таким клеткам. Примерами аффинных меток, специфичных к дефинитивной энтодерме, являются антитела, лиганды или другие связывающие агенты, специфичные к молекуле-маркеру, например к полипептиду, присутствующему на поверхности клеток дефинитивной энтодермы, причем молекула-маркер лишь в незначительных количествах представлена на клетках других типов, которые можно обнаружить в полученных описанными здесь способами культурах. В некоторых способах для обогащения, выделения или очистки клеток дефинитивной энтодермы в качестве аффинной метки используют антитело, которое связывается с рецептором CXRC4. В других способах реализации в качестве аффинных меток можно также использовать хемокин SDF-1 или другие молекулы на основе SDF-1. Такие молекулы включают, без ограничения,фрагменты SDF-1, конструкты слияния SDF-1 и его миметики. Способы получения антител и применения их для выделения клеток известны в данной области. Такие способы можно применять с использованием антител и описанных здесь клеток дефинитивной энтодермы. В одном из способов реализации антитело, которое связывается с CXCR4, присоединяют к магнитной частице и затем позволяют ему связываться с клетками дефинитивной энтодермы в культуре клеток, которую предварительно обработали ферментами, чтобы уменьшить силу сцепления клеток между собой и с субстратом. Затем комплексы клетка/антитело/магнитная частица подвергают воздействию переменного магнитного поля. Магнитное поле используют для отделения связанных с магнитными частицами клеток дефинитивной энтодермы от не связанных с магнитными частицами клеток. После физического отделения клеток дефинитивной энтодермы от других клеток культуры, связь с антителом нарушают, а клетки пересевают на подходящую среду для культивирования тканей. Можно также применять дополнительные способы получения обогащенных, выделенных или очи- 17011953 щенных культур или популяций клеток дефинитивной энтодермы. Например, в некоторых способах реализации антитела к CXCR4 инкубируют с культурой клеток, содержащей клетки дефинитивной энтодермы, которую предварительно обработали, чтобы уменьшить силу сцепления клеток между собой и с субстратом. Затем клетки промывают, центрифугируют и ресуспендируют. Затем суспензию клеток инкубируют со вторым антителом, таким как антитело, конъюгированное с флуоресцентной меткой FITC, которое способно к связыванию с первым антителом. Затем клетки промывают, центрифугируют и ресуспендируют в буфере. Затем суспензию клеток анализируют и сортируют на анализаторе, использующем способ активированной флуоресценции сортировки клеток в потоке (FACS). СХС 114-положительные клетки собирают отдельно от СХС 114-отрицательных клеток, выделяя, таким образом, эти клетки. Если это желательно, композиции из выделенных клеток можно дополнительно очистить, используя способ,основанный на разнице в аффинности, или проводя дополнительные процедуры сортировки с использованием тех же или других маркеров, специфичных к дефинитивной энтодерме. В других способах клетки дефинитивной энтодермы обогащают, выделяют и/или очищают при помощи лиганда CXCR4 или другой молекулы, связывающейся с этим рецептором. В некоторых способах такая молекула представляет собой SDF-1, его фрагмент, слитый конструкт или миметик. В предпочтительных способах клетки дефинитивной энтодермы обогащают, выделяют и/или очищают от других клеток, не относящихся к дефинитивной энтодерме, после того как культуры стволовых клеток стимулируют к дифференцировке по линии клеток дефинитивной энтодермы. Очевидно, что описанные выше процедуры обогащения, выделения и очистки можно применять к такой культуре на любой стадии дифференцировки. В дополнение к описанным выше процедурам, клетки дефинитивной энтодермы можно также выделять при помощи других способов выделения клеток. Дополнительно клетки дефинитивной энтодермы можно обогащать или выделять способом серийного субкультивирования, культивируя их в условиях,которые стимулируют селективное выживание или селективный рост указанных клеток дефинитивной энтодермы. При использовании описанных здесь способов обогащенные, выделенные и/или очищенные популяции клеток дефинитивной энтодермы или тканей можно получать in vitro из культур или популяций плюрипотентных клеток, таких как культуры или популяции стволовых клеток, которые претерпели хотя бы некоторую дифференцировку. В некоторых способах клетки претерпевают случайную дифференцировку. Однако в предпочтительном способе дифференцировку клеток направляют так, чтобы они дифференцировались главным образом в клетки дефинитивной энтодермы. Некоторые предпочтительные способы обогащения, выделения и/или очистки относятся к получению in vitro дефинитивной энтодермы из эмбриональных стволовых клеток человека. Применяя описанные здесь способы, можно обогащать культуры клеток по содержанию дефинитивной энтодермы, повышая его в по меньшей мере приблизительно от 2 раз до 1000 раз по сравнению с популяциями клеток или культурами клеток, не подвергавшимся обработке. Композиции, содержащие PDX1-отрицательную дефинитивную энтодерму(дефинитивную энтодерму) Композиции клеток, полученные описанными выше способами, включают культуры клеток, которые содержат дефинитивную энтодерму, и популяции клеток, обогащенные дефинитивной энтодермой. Например, можно получить культуры клеток, которые содержат клетки дефинитивной энтодермы, в которых по меньшей мере приблизительно 50-80% клеток в культуре представляют собой клетки дефинитивной энтодермы. Поскольку эффективность способа дифференцировки можно регулировать, изменяя определенные параметры, которые включают, без ограничения, условия выращивания клеток, концентрации факторов роста и продолжительность этапов культивирования, описанные здесь процедуры дифференцировки могут обеспечивать приблизительно 5%, приблизительно 10%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 25%, приблизительно 30%, приблизительно 35%, приблизительно 40%, приблизительно 45%, приблизительно 50%, приблизительно 55%, приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%,приблизительно 90%, приблизительно 95% или более чем приблизительно 95% превращение плюрипотентных клеток в дефинитивную энтодерму. Способы, в которых применяют выделение клеток дефинитивной энтодермы, например, при помощи аффинного реагента, который связывает рецептор CXCR4,позволяют получать практически чистые популяции клеток дефинитивной энтодермы. Получение PDX1-положительной энтодермы передней кишки изPDX1-отрицательной дефинитивной энтодермы Описанные здесь культуры PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки и популяции,содержащие PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки, получают из PDX1 отрицательной энтодермы, которую получают из плюрипотентных клеток описанными выше способами. В предпочтительном способе в качестве исходного материала применяют эмбриональные стволовые клетки человека. В одном примере реализации ЭСКч вначале превращают в PDX1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы, которые затем превращают в PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки. Однако очевидно, что исходным материалом для получения PDX1-положительной энтодер- 18011953 мы передней кишки могут служить не только клетки дефинитивной энтодермы, полученные при использовании способов дифференцировки плюрипотентных клеток. Точнее, PDX1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы можно применять в описанных здесь способах вне зависимости от их происхождения. В некоторых примерах реализации настоящего изобретения культуры клеток или популяции клеток, содержащие PDX1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы, можно использовать для дальнейшей дифференцировки в культуры клеток и/или обогащенные популяции клеток, содержащие PDX1 положительные клетки энтодермы передней кишки. Например, можно применять культуры клеток или популяции клеток, содержащие PDX1-отрицательные, SOX17-положительные клетки дефинитивной энтодермы человека. В некоторых примерах реализации культура клеток или популяция клеток может содержать также факторы дифференцировки, такие как активины, белки Nodal и/или белки морфогенеза костей (BMP), оставшиеся от предыдущих этапов дифференцировки (т.е. этапа дифференцировки плюрипотентных клеток в клетки дефинитивной энтодермы). В других примерах реализации факторы, которые применяли на предыдущем этапе дифференцировки, удаляют из культуры клеток или популяции клеток перед тем, как добавить факторы, применяемые для дифференцировки PDX1-отрицательных,SOX17-положительных клеток дефинитивной энтодермы в PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки. В других примерах реализации популяции клеток, обогащенные PDX1-отрицательными,SOX17-положительными клетками дефинитивной энтодермы, используют в качестве источника получения PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки.PDX1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы в культуре подвергают дифференцировке вPDX1-положительные клетки энтодермы посредством добавления в культуру клеток, содержащуюPDX1-отрицательные, SOX17-пололижительные клетки дефинитивной энтодермы, фактора дифференцировки, который стимулирует дифференцировку этих клеток в PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки (фактор дифференцировки передней кишки). В некоторых способах реализации настоящего изобретения факторы дифференцировки передней кишки представляют собой ретиноид, такой как ретиноевая кислота (RA). В некоторых примерах реализации ретиноид применяют в комбинации с фактором роста фибробластов, таким как FGF-4 или FGF-10. В других примерах реализации ретиноид применяют в комбинации с надсемейством фактором роста TGF/или кондиционированной средой. Под "кондиционированной средой" понимают среду, которая была модифицирована по сравнению с базовой средой. Например, кондиционирование среды может означать увеличение или снижение уровня молекул, таких как питательные вещества и/или факторы роста, по сравнению с исходными уровнями в базовой среде. В некоторых примерах реализации среду кондиционируют, выращивая или поддерживая в этой вреде клетки определенных типов в определенных условиях в течение определенных периодов времени. Например, среду можно кондиционировать, выращивая, поддерживая или проводя дифференцировку ЭСКч в среде определенного состава при определенной температуре в течение определенного количества часов. Для специалиста в данной области очевидно, что многочисленные комбинации клеток,типов сред, продолжительностей и условий позволяют получить практически бесконечный набор кондиционированных сред. В некоторых способах реализации настоящего изобретения кондиционированную среду получают, выращивая или поддерживая дифференцированные плюрипотентные клетки в среде,содержащей приблизительно от 1 до 20% сыворотки. В других способах реализации кондиционированную среду получают, выращивая или поддерживая дифференцированные плюрипотентные клетки в среде, содержащей от приблизительно 1 до приблизительно 1000 нг/мл активина А. В других способах реализации кондиционированную среду получают, выращивая или поддерживая дифференцированные плюрипотентные клетки в среде, содержащей приблизительно от 1 до 1000 нг/мл ВМР 4. В предпочтительном способе реализации кондиционированную среду готовят, выращивая или поддерживая ЭСКч в среде, такой как RPMI, содержащей приблизительно 25 нг/мл активина А и приблизительно 2 мкМ ретиноевой кислоты, в течение 24 ч. В некоторых способах реализации настоящего изобретения клетки, которые применяют для кондиционирования среды для повышения дифференцировки PDX1-отрицательной дефинитивной энтодермы в PDX1-положительную энтодерму передней кишки, представляют собой клетки, полученные в результате дифференцировки плюрипотентных клеток, таких как ЭСКч, в течение периода продолжительностью приблизительно 5 дней в среде, такой как RPMI, содержащей приблизительно от 0 до 20% сыворотки и/или один или более факторов роста/дифференцировки из надсемейства TGF. Факторы дифференцировки, такие как активин А и ВМР 4, добавляют в концентрациях, лежащих в пределах приблизительно от 1 до 1000 нг/мл. В определенных способах реализации настоящего изобретения клетки, которые применяют для кондиционирования среды, получают в результате дифференцировки ЭСКч в течение периода продолжительностью приблизительно 5 дней в среде RPMI с низким содержанием сыворотки. Согласно некоторым примерам реализации настоящего изобретения, RPMI с низким содержанием сыворотки называют среду с низким содержанием сыворотки, причем концентрацию сыворотки постепенно увеличивают на протяжении определенного периода времени. Например, в одном примере реализации, концентрация фетальной сыворотки крупного рогатого скота (фетальной сыворотки) в RPMI с низким со- 19011953 держанием сыворотки составляет приблизительно 0,2% фетальной сыворотки в первый день выращивания клеток, приблизительно 0,5% фетальной сыворотки во второй день выращивания клеток и 2% фетальной сыворотки с третьего по пятый дни выращивания клеток. В другом способе реализации концентрация фетальной сыворотки крупного рогатого скота в RPMI с низким содержанием сыворотки составляет приблизительно 0% в первый день, приблизительно 0,2% во второй день и приблизительно 2% в дни 3-6. В определенных предпочтительных способах реализации RPMI с низким содержанием сыворотки дополняют одним или более фактором дифференцировки, такими как активин А и ВМР 4. Кроме применения в получении клеток, применяемых для кондиционирования среды, RPMI с низким содержанием сыворотки можно также применять в качестве среды для получения путем дифференцировки PDX1 полжительных клеток энтодермы передней кишки из PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы. Для среднего специалиста в данной области очевидно, что кондиционированную среду можно приготовить не из RPMI, а из другой среды, при условии, что такая среда не мешает росту или поддержаниюPDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки. Также очевидно, что для кондиционирования среды можно применять клетки различных типов. В тех способах реализации, где для кондиционирования среды применяют недавно дифференцированные клетки, дифференцировка таких клеток может проходить в среде, отличной от RPMI, при условии, что такая среда не подавляет рост или поддержание таких клеток. Кроме того, для специалиста в данной области, очевидно, что ни продолжительность кондиционирования, ни продолжительность приготовления клеток, применяемых для кондиционирования, не должны обязательно составлять 24 ч и 5 дней соответственно, поскольку для достижения описанных здесь эффектов может быть достаточно других промежутков времени. В целом, применение ретиноида в комбинации с фактором роста фибробластов, членом надсемейства факторов роста TGF, кондиционированной средой или комбинации любых из этих факторов дифференцировки передней кишки обеспечивает более значительную дифференцировку PDX1 отрицательной дефинитивной энтодермы в PDX1-положительную энтодерму передней кишки, чем применение только ретиноида. В предпочтительных способах реализации в культуру PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы добавляют и ретиноевую кислоту и FGF-10. В другом предпочтительном способе реализации PDX1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы подвергают дифференцировке в культуре, содержащей кондиционированную среду, активин А, активин В и ретиноевую кислоту. Что касается примеров реализации некоторых описанных здесь способов дифференцировки, то вышеупомянутые факторы дифференцировки передней кишки добавляют к клеткам таким образом, чтобы эти факторы присутствовали в культуре клеток или популяции клеток в концентрациях, достаточных для того, чтобы стимулировать дифференцировку по меньшей мере части культуры PDX-1 отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки. При использовании применительно к культурам клеток и/или популяциям клеток термин "часть" обозначает любое ненулевое количество клеток культуры клеток или популяции клеток, лежащее в пределах от одной клетки до полной культуры клеток или популяции клеток. В некоторых способах реализации настоящего изобретения ретиноид добавляют к клеткам в культуре клеток таким образом, чтобы он присутствовал в концентрации, равной по меньшей мере приблизительно 0,01 мкМ, по меньшей мере приблизительно 0,02 мкМ, по меньшей мере приблизительно 0,04 мкМ, по меньшей мере приблизительно 0,08 мкМ, по меньшей мере приблизительно 0,1 мкМ, по меньшей мере приблизительно 0,2 мкМ, по меньшей мере приблизительно 0,3 мкМ, по меньшей мере приблизительно 0,4 мкМ, по меньшей мере приблизительно 0,5 мкМ, по меньшей мере приблизительно 0,6 мкМ, по меньшей мере приблизительно 0,7 мкМ, по меньшей мере приблизительно 0,8 мкМ, по меньшей мере приблизительно 0,9 мкМ, по меньшей мере приблизительно 1 мкМ, по меньшей мере приблизительно 1,1 мкМ, по меньшей мере приблизительно 1,2 мкМ, по меньшей мере приблизительно 1,3 мкМ,по меньшей мере приблизительно 1,4 мкМ, по меньшей мере приблизительно 1,5 мкМ, по меньшей мере приблизительно 1,6 мкМ, по меньшей мере приблизительно 1,7 мкМ, по меньшей мере приблизительно 1,8 мкМ, по меньшей мере приблизительно 1,9 мкМ, по меньшей мере приблизительно 2 мкМ, по меньшей мере приблизительно 2,1 мкМ, по меньшей мере приблизительно 2,2 мкМ, по меньшей мере приблизительно 2,3 мкМ, по меньшей мере приблизительно 2,4 мкМ, по меньшей мере приблизительно 2,5 мкМ, по меньшей мере приблизительно 2,6 мкМ, по меньшей мере приблизительно 2,7 мкМ, по меньшей мере приблизительно 2,8 мкМ, по меньшей мере приблизительно 2,9 мкМ, по меньшей мере приблизительно 3 мкМ, по меньшей мере приблизительно 3,5 мкМ, по меньшей мере приблизительно 4 мкМ, по меньшей мере приблизительно 4,5 мкМ, по меньшей мере приблизительно 5 мкМ, по меньшей мере приблизительно 10 мкМ, по меньшей мере приблизительно 20 мкМ, по меньшей мере приблизительно 30 мкМ, по меньшей мере приблизительно 40 мкМ или по меньшей мере приблизительно 50 мкМ. В настоящей заявке термин "ретиноид" относится к ретинолу, ретиналю или ретиноевой кислоте, а также к производным любого из этих соединений. В предпочтительном способе реализации ретиноид представляет собой ретиноевую кислоту. В других способах реализации настоящего изобретения в культуре клеток присутствуют один или- 20011953 более факторов роста фибробластов. Например, в некоторых примерах реализации в культуре клеток может присутствовать FGF-4 в концентрации, равной по меньшей мере приблизительно 10 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 25 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 50 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 75 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 100 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 200 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 300 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 400 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 500 нг/мл или по меньшей мере приблизительно 1000 нг/мл. В дальнейших способах реализации настоящего изобретения FGF-10 присутствует в культуре клеток в концентрации, равной по меньшей мере приблизительно 10 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 25 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 50 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 75 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 100 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 200 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 300 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 400 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 500 нг/мл или по меньшей мере приблизительно 1000 нг/мл. В некоторых примерах реализации в культуру клеток добавляют, помимо ретиноевой кислоты, либо FGF-4, либо FGF-10, но не оба эти фактора одновременно. В предпочтительном способе реализации в культуре клеток присутствуют ретиноевая кислота в количестве 1 мкМ и FGF-10 в концентрации 50 нг/мл. В некоторых способах реализации настоящего изобретения в культуре клеток присутствуют факторы роста надсемейства TGFP и/или кондиционированная среда. Эту факторы дифференцировки можно применять в комбинации с ретиноевой кислотой и/или другими факторами дифференцировки передней кишки, включая, без ограничения, FGF-4 и FGF-10. Например, в некоторых примерах реализации в культуре клеток могут присутствовать активин А и/или активин В в концентрации, равной по меньшей мере приблизительно 5 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 10 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 25 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 50 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 75 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 100 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 200 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 300 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 400 нг/мл, по меньшей мере приблизительно 500 нг/мл или по меньшей мере приблизительно 1000 нг/мл. В дальнейших способах реализации настоящего изобретения в культуре клеток присутствует кондиционированная среда в концентрации, равной по меньшей мере приблизительно 1%, по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, или по меньшей мере приблизительно 100% от всей среды. В некоторых примерах реализации в культуру клеток помимо ретиноевой кислоты добавляют активин А, активин В и кондиционированную среду. В предпочтительном способе реализации PDX1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы подвергают дифференцировке в PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки в культурах, содержащих приблизительно 1 мкМ ретиноевой кислоты, приблизительно 25 нг/мл активина А и среду RPMI с низким содержанием сыворотки, которую кондиционировали в течение приблизительно 24 ч при помощи дифференцированных ЭСКч, причем дифференцированные ЭСКч предварительно подвергали дифференцировке в течение приблизительно 5 дней в среде RPMI с низким содержанием сыворотки, содержащей приблизительно 100 нг/мл активина А. В другом предпочтительном способе реализации в культуре присутствуют также активин В и/или FGF-10 в концентрации 25 и 50 нг/мл соответственно. В определенных способах реализации настоящего изобретения вышеупомянутые факторы дифференцировки передней кишки после добавления удаляют из культуры клеток. Например, факторы дифференцировки передней кишки можно удалять в пределах приблизительно одного дня, приблизительно двух дней, приблизительно трех дней, приблизительно четырех дней, приблизительно пяти дней, приблизительно шести дней, приблизительно семи дней, приблизительно восьми дней, приблизительно девяти дней или приблизительно десяти дней после добавления. Культуры PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки можно выращивать в среде,содержащей разбавленную сыворотку. Концентрации сыворотки могут лежать в пределах приблизительно от 0,05% (об./об.) до 20% (об./об.). В некоторых примерах реализации PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки выращивают с заменителем сыворотки. Например, в определенных примерах реализации концентрация сыворотки в среде может быть меньше приблизительно 0,05% (об./об.), меньше приблизительно 0,1% (об./об.), меньше приблизительно 0,2% (об./об.), меньше приблизительно 0,3%(об./об.), меньше приблизительно 15% (об./об.) или меньше приблизительно 20% (об./об.). В некоторых примерах реализации PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки выращивают без сыворотки. В других примерах реализации PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки выра- 21011953 щивают с заменителем сыворотки. В других способах реализации PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки выращивают в присутствии В 27. В таких способах реализации В 27 можно добавлять в культуру в концентрациях, лежащих в пределах от приблизительно 0,1% (об./об.) до приблизительно 20% (об./об.) или в концентрациях больше приблизительно 20% (об./об.). В определенных примерах реализации концентрация В 27 в среде составляет приблизительно 0,1% (об./об.), приблизительно 0,2% (об./об.), приблизительно 0,3%(об./об.), приблизительно 5% (об./об.), приблизительно 6% (об./об.), приблизительно 7% (об./об.), приблизительно 8% (об./об.), приблизительно 9% (об./об.), приблизительно 10% (об./об.), приблизительно 15% (об./об.) или приблизительно 20% (об./об.). В качестве альтернативы концентрацию добавки В 27 можно измерять в терминах множителей (кратности) концентрации коммерчески доступного маточного раствора В 27. Например, В 27 можно приобрести в Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, США) в виде 50 Х маточного раствора. Добавление определенного количества этого маточного раствора к определенному объему среды для выращивания дает среду, дополненную желаемым количеством В 27. Например, добавление 10 мл 50 Х маточного раствора к В 27 90 мл среды для выращивания дает среду для выращивания, дополненную 5 Х В 27. Концентрация добавки В 27 в среде может составлять приблизительно 0,1 Х,приблизительно 0,2 Х, приблизительно 0,3 Х, приблизительно 0,4 Х, приблизительно 0,5 Х, приблизительно 0,6 Х, приблизительно 0,7 Х, приблизительно 0,8 Х, приблизительно 0,9 Х, приблизительно 1X, приблизительно 1,1 Х, приблизительно 1,2 Х, приблизительно 1,3 Х, приблизительно 1,4 Х, приблизительно 1,5 Х,приблизительно 1,6 Х, приблизительно 1,7 Х, приблизительно 1,8 Х, приблизительно 1,9 Х, приблизительно 2 Х, приблизительно 2,5 Х, приблизительно 3 Х, приблизительно 3,5 Х, приблизительно 4 Х, приблизительно 4,5 Х, приблизительно 5 Х, приблизительно 6 Х, приблизительно 7 Х, приблизительно 8 Х, приблизительно 9 Х, приблизительно 10 Х, приблизительно 11 Х, приблизительно 12 Х, приблизительно 13 Х,приблизительно 14 Х, приблизительно 15 Х, приблизительно 16 Х, приблизительно 17 Х, приблизительно 18 Х, приблизительно 19 Х, приблизительно 20 Х или быть больше приблизительно 20 Х. Мониторинг дифференцировки PDX1-отрицательной дефинитивной энтодермы в PDX1-положительную энтодерму Так же как и в случае дифференцировки плюрипотентных клеток в клетки дефинитивной энтодермы, за ходом дифференцировки PDX1-отрицательной, SOX17-положительной дефинитивной энтодермы в PDX1-положительную энтодерму передней кишки можно следить посредством определения экспрессии маркеров, характерных для этих типов клеток. Такой мониторинг позволяет определить количество времени, необходимое для получения желаемого количества PDX1-положительной энтодермы передней кишки в разнообразных условиях, например для одной или более концентраций фактора дифференцировки, и для различных внешних условий. В предпочтительных способах реализации время, достаточное для получения желаемого количества PDX1-положительной энтодермы передней кишки, определяют посредством определения экспрессии PDX1. В некоторых способах реализации настоящего изобретения экспрессию конкретных маркеров определяют посредством регистрации присутствия или отсутствия этого маркера. В некоторых способах реализации настоящего изобретения экспрессию конкретных маркеров можно определять посредством измерения количества (уровня), в котором этот маркер присутствует в клетках культуры клеток или популяции клеток, в таких способах реализации измерение экспрессии маркера может быть качественным или количественным. Как описано выше, предпочтительным способом количественного определения маркеров экспрессии, продуцируемых маркерными генами, является применение количественной ПЦР. В конкретных способах реализации ПЦР применяют для того, чтобы следить за ходом дифференцировки культуры PDX1-отрицательной, SOX17-положительной дефинитивной энтодермы в PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки, посредством количественного определения экспрессии маркерных генов, характерных для PDX1-положительной энтодермы передней кишки, и отсутствие экспрессии маркерных генов, характеризующих другие типы клеток. Для измерения экспрессии маркерных генов можно также применять другие известные в данной области способы. Например, экспрессию продукта маркерного гена можно определять при помощи антител, специфичных к продукту интересующего исследователя маркерного гена. В некоторых способах реализации настоящего изобретения определяют экспрессию маркерных генов, характерных для PDX1 положительной энтодермы передней кишки, а также отсутствие значительного уровня экспрессии маркерных генов, характерных для PDX1-отрицательной дефинитивной энтодермы, ЭСКч и других типов клеток. Как описано в приведенных ниже примерах, PDX1 представляет собой маркерный ген, ассоциированный с PDX1-положительной энтодермой передней кишки. Поэтому в некоторых способах реализации настоящего изобретения определяют экспрессию PDX1. В других примерах реализации определяют также экспрессию других маркеров, которые экспрессирует PDX1-положительная энтодерма передней кишки, включая, без ограничения, SOX17, НОХА 13 и/или НОХС 6. Поскольку другие типы клеток (например, висцеральная энтодерма и нервная эктодерма) также могут экспрессировать PDX1, некоторые при- 22011953 меры реализации настоящего изобретения относятся к демонстрации отсутствия или отсутствия значительного уровня экспрессии маркерного гена, который ассоциирован с висцеральной энтодермой и/или нервной эктодермой. Например, в некоторых примерах реализации определяют экспрессию маркеров,включая, без ограничения, SOX7, AFP, SOX1, ZICl и/или NFM, которые экспрессируются висцеральной энтодермой и/или нервной эктодермой. В некоторых примерах реализации полученные описанными здесь способами культуры PDX1 положительных клеток энтодермы передней кишки практически свободны от клеток, которые экспрессируют маркерные гены SOX7, AFP, SOX1, ZICl или NFM. В определенных примерах реализации полученные описанными здесь способами культуры PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки практически свободны от клеток висцеральной энтодермы, париетальной энтодермы и/или нервных клеток. Обогащение, выделение и/или очистка PDX1-положительной энтодермы Что касается дополнительных аспектов настоящего изобретения, PDX1-положительные клетки дефинитивной энтодермы можно обогащать, выделять и/или очищать. В некоторых способах реализации настоящего изобретения популяции клеток, обогащенные PDX1-положительными клетками энтодермы передней кишки, получают посредством выделения таких клеток из культур клеток. В некоторых способах реализации настоящего изобретения PDX1-положительные клетки дефинитивной энтодермы метят флуоресцентной меткой, а затем отделяют от немеченых клеток на анализаторе,использующем способ активированной флуоресценции сортировки клеток в потоке (FACS). В таких способах реализации для того, чтобы метить PDX1-положительные клетки, применяют нуклеиновую кислоту, кодирующую зеленый флуоресцирующий белок (GFP), или другую нуклеиновую кислоту, кодирующую экспрессируемый ген флуоресцирующего маркера. Например, в некоторых примерах реализации в плюрипотентную клетку, предпочтительно эмбриональную стволовую клетку человека, вводят по меньшей мере одну копию нуклеиновой кислоты, кодирующей GFP или его биологически активный фрагмент, причем располагают его в 3'-5' направлении от промотора PDX1, чтобы экспрессия продукта GFP или его биологически активного фрагмента находилась под контролем промотора PDX1. В некоторых примерах реализации целую кодирующую область, которая кодирует PDX1, заменяют на нуклеиновую кислоту, кодирующую GFP или его биологически активный фрагмент. В других примерах реализации нуклеиновую кислоту, кодирующую GFP или его биологически активный фрагмент, лигируют с сохранением рамки считывания с по меньшей мере одной частью нуклеиновой кислоты, кодирующей PDX1,формируя, таким образом, гибридный белок. В таких способах реализации гибридный белок сохраняет флуоресцентную активность, аналогичную активности GFP. Клетки с флуоресцентной меткой, такие как описанные выше клетки, дифференцируются в клетки дефинитивной энтодермы, а затем в PDX1-положительную энтодерму передней кишки, как было описано выше. Благодаря тому, что PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки экспрессируют ген флуоресцентного маркера, a PDX1-отрицательные клетки - нет, эти два типа клеток можно разделить. В некоторых примерах реализации суспензии клеток, содержащие смесь PDX1-положительных клеток,меченых флуоресцентной меткой, и немеченых PDX1-отрицательных клеток, сортируют способом активированной флуоресценцией сортировки клеток в потоке (FACS). PDX1-положительные клетки собирают отдельно от PDX1-отрицательных клеток, что обеспечивает отделение таких типов клеток. Если это желательно, композиции выделенных клеток можно очищать дальше посредством дополнительных циклов сортировки с использованием тех же или других маркеров, специфичных к PDX1-положительной энтодерме передней кишки. В дополнение к описанным выше процедурам PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки можно также выделять при помощи других методик выделения клеток. Дополнительно PDX1 положительные клетки энтодермы передней кишки также можно обогащать или выделять способом серийного субкультивирования в условиях, которые стимулируют селективное выживание или селективный рост указанных PDX1-положительных клеток дефинитивной энтодермы. Очевидно, что описанные выше процедуры обогащения, выделения и очистки можно применять для культур на любой стадии дифференцировки. При использовании описанных здесь способов обогащенные, выделенные и/или очищенные популяции PDX1-положительных клеток дефинитивной энтодермы и/или тканей можно получать in vitro из культур или популяций PDX1-отрицательных, SOX17-положительных клеток дефинитивной энтодермы,которые претерпели хотя бы некоторую дифференцировку. В некоторых примерах реализации эти клетки претерпевают случайную дифференцировку. В предпочтительном способе реализации, однако, дифференцировку клеток направляют так, чтобы они дифференцировались главным образом в PDX1 положительные клетки энтодермы передней кишки. Некоторые предпочтительные способы обогащения,выделения и/или очистки относятся к получению in vitro PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки из эмбриональных стволовых клеток человека. Применяя описанные здесь способы, можно обогащать популяции клеток или культуры клеток по содержанию PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки по меньшей мере приблизительно от 2 раз до приблизительно 1000 раз по сравнению с популяциями клеток или культурами клеток, не под- 23011953 вергавшимся обработке. В некоторых примерах реализации можно произвести приблизительно 5-500 кратное обогащение PDX1-положительными клетками энтодермы передней кишки по сравнению с культурами клеток и популяциями клеток, не подвергавшимися обработке. В других примерах реализации можно произвести по меньшей мере приблизительно 10-200-кратное обогащение по PDX1 положительным клеткам энтодермы передней кишки по сравнению с популяциями клеток или культурами клеток, не подвергавшимися обработке. В других способах реализации можно произвести по меньшей мере приблизительно 20-100-кратное обогащение по PDX1-положительным клеткам энтодермы передней кишки по сравнению с популяциями клеток или культурами клеток, не подвергавшимися обработке. В других способах реализации можно произвести приблизительно по меньшей мере приблизительно 40-80-кратное обогащение по PDX1-положительным клеткам энтодермы передней кишки по сравнению с популяциями клеток или культурами клеток, не подвергавшимися обработке. В определенных примерах реализации можно произвести по меньшей мере приблизительно 2-20-кратное обогащение по PDX1-положительным клеткам энтодермы передней кишки по сравнению с популяциями клеток или культурами клеток, не подвергавшимися обработке. Композиции, содержащие PDX1-положительную энтодерму передней кишки Некоторые примеры реализации настоящего изобретения относятся к композициям, таким как культуры клеток или популяции клеток, содержащим PDX1-положительные клетки дефинитивной энтодермы, в которых PDX1-положительные клетки дефинитивной энтодермы представляют собой мультипотентные клетки, которые могут дифференцироваться в клетки, ткани или органы, образующиеся из передней части кишечной трубки (PDX1-положительной энтодермы передней кишки). Согласно определенным способам реализации PDX1-положительная энтодерма представляет собой клетки млекопитающих, а в предпочтительном способе реализации клетки дефинитивной энтодермы представляют собой клетки человека. Другие примеры реализации настоящего изобретения относятся к композициям, таким как культуры клеток или популяции клеток, содержащим клетки одного или более типов, выбранных из группы,состоящей из ЭСКч, PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы, PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки и клеток мезодермы. В некоторых примерах реализации ЭСКч составляют меньше приблизительно 5%, меньше приблизительно 4%, меньше приблизительно 3%, меньше приблизительно 2% или меньше приблизительно 1% всех клеток в культуре. В других примерах реализацииPDX1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы составляют меньше приблизительно 90%, меньше приблизительно 85%, меньше приблизительно 80%, меньше приблизительно 75%, меньше приблизительно 70%, меньше приблизительно 65%, меньше приблизительно 60%, меньше приблизительно 55%,меньше приблизительно 50%, меньше приблизительно 45%, меньше приблизительно 40%, меньше приблизительно 35%, меньше приблизительно 30%, меньше приблизительно 25%, меньше приблизительно 20%, меньше приблизительно 15%, меньше приблизительно 12%, меньше приблизительно 10%, меньше приблизительно 8%, меньше приблизительно 6%, меньше приблизительно 5%, меньше приблизительно 4%, меньше приблизительно 3%, меньше приблизительно 2% или меньше приблизительно 1% всех клеток в культуре. В других примерах реализации клетки мезодермы составляют меньше приблизительно 90%, меньше приблизительно 85%, меньше приблизительно 80%, меньше приблизительно 75%, меньше приблизительно 70%, меньше приблизительно 65%, меньше приблизительно 60%, меньше приблизительно 55%, меньше приблизительно 50%, меньше приблизительно 45%, меньше приблизительно 40%,меньше приблизительно 35%, меньше приблизительно 30%, меньше приблизительно 25%, меньше приблизительно 20%, меньше приблизительно 15%, меньше приблизительно 12%, меньше приблизительно 10%, меньше приблизительно 8%, меньше приблизительно 6%, меньше приблизительно 5%, меньше приблизительно 4%, меньше приблизительно 3%, меньше приблизительно 2% или меньше приблизительно 1% всех клеток в культуре. Дополнительные примеры реализации настоящего изобретения относятся к композициям, таким как культуры клеток или популяции клеток, полученным описанными здесь способами, в которых PDX1 положительная энтодерма составляет основной тип клеток. В некоторых примерах реализации описанные в настоящей заявке способы позволяют получать культуры клеток и/или популяции клеток, содержащие по меньшей мере приблизительно 99%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 54%, по меньшей мере приблизительно 53%, по меньшей мере приблизительно 52% или по меньшей мере приблизительно 51% PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки. В предпочтительных способах реализации клетки культуры клеток или популяции клеток представляют собой клетки человека. В других примерах реализации описанные здесь способы позволяют получать культуры клеток или популяции клеток, содержащие по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно- 24011953 45%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 35%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 24%, по меньшей мере приблизительно 23%, по меньшей мере приблизительно 22%, по меньшей мере приблизительно 21%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 19%, по меньшей мере приблизительно 18%, по меньшей мере приблизительно 17%, по меньшей мере приблизительно 16%, по меньшей мере приблизительно 15%, по меньшей мере приблизительно 14%, по меньшей мере приблизительно 13%, по меньшей мере приблизительно 12%, по меньшей мере приблизительно 11%, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 9%, по меньшей мере приблизительно 8%, по меньшей мере приблизительно 7%, по меньшей мере приблизительно 6%, по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 4%, по меньшей мере приблизительно 3%, по меньшей мере приблизительно 2% или по меньшей мере приблизительно 1% PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки. В предпочтительных способах реализации клетки культур клеток или популяций клеток представляют собой клетки человека. В некоторых примерах реализации процентную долю PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки в культуре клеток или популяции клеток рассчитывают без учета оставшихся в культуре фидерных клеток. Другие примеры реализации настоящего изобретения относятся к композициям, таким как культуры клеток или популяции клеток, которые содержат смеси PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки и PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы. Например, можно получить культуру клеток или популяцию клеток, содержащую по меньшей мере приблизительно 5 PDX1 положительных клеток энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 95 PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы. В других примерах реализации можно получить культуры клеток или популяции клеток, содержащие по меньшей мере приблизительно 95 PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 5 PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы. Кроме того, предусмотрены популяции, содержащие PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки и PDX1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы в других соотношениях. Например, предусмотрены композиции, содержащие по меньшей мере приблизительно 1 PDX1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждый 1000000 PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 1 PDX1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 100000 PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 1 PDX1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 10000 PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 1 PDX1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 1000 PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 1PDX1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 500 PDX1 отрицательных клеток дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 1 PDX1 положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 100 PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 1 PDX1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 10 PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 1 PDX1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 5 PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 1 PDX1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 4 PDX1-отрицательных клетки дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 1 PDX1-положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждые 2 PDX1 отрицательных клетки дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 1 PDX1 положительную клетку энтодермы передней кишки на приблизительно каждую 1 PDX1-отрицательную клетку дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 2 PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки на приблизительно каждую 1 PDX1-отрицательную клетку дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 4 PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки на приблизительно каждую 1 PDX1-отрицательную клетку дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 5 PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки на приблизительно каждую 1 PDX1-отрицательную клетку дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 10 PDX1 положительных клеток энтодермы передней кишки на приблизительно каждую 1 PDX1-отрицательную клетку дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 20 PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки на приблизительно каждую 1 PDX1-отрицательную клетку дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 50 PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки на приблизительно каждую 1 PDX1-отрицателную клетку дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 100 PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки на приблизительно каждую 1 PDX1-отрицательную клетку дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 1000 PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки на приблизительно каждую 1 PDX1 отрицательную клетку дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 10000 PDX1 положительных клеток энтодермы передней кишки на приблизительно каждую 1 PDX1-отрицательную клетку дефинитивной энтодермы, по меньшей мере приблизительно 100000 PDX1-положительных кле- 25011953 ток энтодермы передней кишки на приблизительно каждую 1 PDX1-отрицательную клетку дефинитивной энтодермы и по меньшей мере приблизительно 1000000 PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки на приблизительно каждую 1 PDX1-отрицательную клетку дефинитивной энтодермы. В некоторых способах реализации настоящего изобретения PDX1-отрицательные клетки дефинитивной энтодермы, из которых получают PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки, образуются из плюрипотентных клеток человека, таких как плюрипотентные стволовые клетки человека. В определенных примерах реализации плюрипотентные стволовые клетки человека получают из морулы,внутренней клеточной массы эмбриона или из гонадных валиков эмбриона. В определенных примерах реализации плюрипотентные стволовые клетки человека получают из гонадной или зародышевой тканей многоклеточной структуры, которая развивается после стадии эмбриона. Другие способы реализации настоящего изобретения относятся к композициям, таким как культуры клеток или популяции клеток, содержащим клетки человека, включая PDX1-положительную энтодерму передней кишки человека, в которой уровень экспрессии маркера PDX1 выше уровней экспрессии маркеров AFP, SOX7, SOX1, ZICl и/или NFM по меньшей мере приблизительно в 2% клеток человека. В других примерах реализации уровень экспрессии маркера PDX1 выше уровня экспрессии маркера AFP,SOX7, SOX1, ZICl и/или NFM по меньшей мере приблизительно в 5% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 10% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 15% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 20% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 25% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 30% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 35% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 40% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 45% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 50% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 55% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 60% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 65% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 70% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 75% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 80% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 85% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 90% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 95% клеток человека или по меньшей мере приблизительно в 98% клеток человека. В некоторых примерах реализации процентную долю клеток человека в культурах клеток или популяциях клеток, в которых уровень экспрессии PDX1 выше уровня экспрессии маркера AFP, SOX7, SOX1, ZICl и/или NFM, рассчитывают без учета фидерных клеток. Очевидно, что некоторые примеры реализации настоящего изобретения относятся к композициям,таким как культуры клеток или популяции клеток, содержащим PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки человека, в которых уровень экспрессии одного или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из SOX17, НОХА 13 и НОХС 6, выше уровня экспрессии маркера AFP, SOX7, SOX1,ZICl и/или NFM в от по меньшей мере приблизительно 2 до более чем по меньшей мере приблизительно 98% клеток человека. В некоторых примерах реализации уровень экспрессии одного или более маркеров,выбранных из группы, состоящей из SOX17, НОХА 13 и НОХС 6, выше уровня экспрессии маркера AFP,SOX7, SOX1, ZICl и/или NFM по меньшей мере приблизительно в 5% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 10% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 15% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 20% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 25% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 30% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 35% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 40% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 45% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 50% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 55% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 60% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 65% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 70% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 75% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 80% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 85% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 90% клеток человека, по меньшей мере приблизительно в 95% клеток человека или по меньшей мере приблизительно в 98% клеток человека. В некоторых примерах реализации процентную долю клеток человека, в которых уровень экспрессии одного или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из SOX17, НОХА 13 и НОХС 6, выше уровня экспрессии маркера AFP, SOX7, SOX1,ZICl и/или NFM, в популяциях или культурах клеток рассчитывают без учета фидерных клеток. Дополнительные примеры реализации настоящего изобретения относятся к композициям, таким как культуры клеток или популяции клеток, содержащим клетки энтодермы млекопитающих, такие как клетки энтодермы человека, в которых уровень экспрессии маркера PDX1 выше уровня экспрессии маркера AFP, SOX7, SOX1, ZICl и/или NFM по меньшей мере приблизительно в 2% клеток энтодермы. В других примерах реализации уровень экспрессии маркера PDX1 выше уровня экспрессии маркера AFP,SOX7, SOX1, ZICl и/или NFM по меньшей мере приблизительно в 5% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 10% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 15% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 20% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 25% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 30% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 35% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 40% клеток энтодермы, по мень- 26011953 шей мере приблизительно в 45% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 50% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 55% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 60% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 65% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 70% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 75% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 80% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 85% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 90% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 95% клеток энтодермы или по меньшей мере приблизительно в 98% клеток энтодермы. Другие примеры реализации настоящего изобретения относятся к композициям, таким как культуры клеток или популяции клеток, содержащим клетки энтодермы млекопитающих, таким как клетки энтодермы млекопитающих, в которых уровень экспрессии одного или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из SOX17, HOXA13 и НОХС 6, выше, чем уровень экспрессии маркера AFP, SOX7,SOX1, ZICl и/или NFM по меньшей мере приблизительно в 2% клеток энтодермы. В других примерах реализации уровень экспрессии одного или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из SOX17,Н 0 ХА 13 и НОХС 6, выше, чем уровень экспрессии AFP, SOX7, SOX1, ZICl и/или NFM по меньшей мере приблизительно в 5% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 10% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 15% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 20% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 25% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 30% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 35% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 40% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 45% клеток энтодермы,по меньшей мере приблизительно в 50% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 55% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 60% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 65% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 70% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 75% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 80% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 85% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 90% клеток энтодермы, по меньшей мере приблизительно в 95% клеток энтодермы или по меньшей мере приблизительно в 98% клеток энтодермы. Применяя описанные здесь способы, можно получить композиции, содержащие PDX1 положительные клетки энтодермы передней кишки, практически свободные от других типов клеток. В отношении клеток в культурах клеток или популяциях клеток термин "практически свободный от" означает, что конкретный тип клеток, от которого свободна популяция клеток или культура клеток, присутствует в количестве меньше приблизительно 5% общего числа клеток, присутствующих в культуре клеток или популяции клеток. В некоторых способах реализации настоящего изобретения популяции или культуры PDX1-положительных клеток передней кишки, полученные описанными здесь способами,практически свободны от клеток, в которых значительны уровни экспрессии маркерных генов AFP,SOX7, SOX1, ZICl и/или NFM. В одном из способов реализации настоящего изобретения PDX1-положительные клетки передней кишки описаны на основании экспрессии маркерных генов следующим образом: PDX1 high (высокий уровень), AFP low (низкий уровень), SOX7 low, SOX1 low, ZICl low и NFM low. Увеличение экспрессии PDX1 в SOX17-положительной клетке дефинитивной энтодермы Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к способу повышения уровня экспрессии продукта гена PDX1 в культурах клеток или популяциях клеток, содержащих SOX17-положительные клетки дефинитивной энтодермы. В таких способах реализации SOX17-положительные клетки дефинитивной энтодермы приводят в контакт с фактором дифференцировки в количестве, достаточном для того,чтобы повысить уровень экспрессии продукта гена PDX1. SOX17-положительные клетки дефинитивной энтодермы, которые приводят в контакт с фактором дифференцировки, могут быть PDX1 отрицательными или PDX1-положительными. В некоторых примерах реализации фактор дифференцировки может представлять собой ретиноид. В определенных примерах реализации SOX17 положительные клетки дефинитивной энтодермы приводят в контакт с ретиноидом в концентрации приблизительно от 0,01 до 50 мкМ. В предпочтительном способе реализации ретиноид представляет собой ретиноевую кислоту. В других способах реализации настоящего изобретения уровень экспрессии продукта гена PDX1 в культурах клеток или популяциях клеток, содержащих SOX17-положительные клетки дефинитивной энтодермы, повышают посредством приведения в контакт SOX17-положительных клеток с фактором дифференцировки из семейства факторов роста фибробластов. Такие факторы дифференцировки можно применять либо отдельно, либо в комбинации с ретиноевой кислотой. В некоторых примерах реализацииSOX17-положительные клетки дефинитивной энтодермы приводят в контакт с фактором роста фибробластов в концентрации приблизительно от 10 до 1000 нг/мл. В предпочтительном способе реализации фактор роста фибробластов представляет собой FGF-10. В некоторых способах реализации настоящего изобретения уровень экспрессии продукта генаPDX1 в культурах клеток или популяциях клеток, содержащих SOX17-положительные клетки дефинитивной энтодермы, повышают посредством приведения в контакт SOX17-положительных клеток с В 27. Этот фактор дифференцировки можно применять либо самостоятельно, либо в комбинации с ретинои- 27011953 дом и факторами дифференцировки семейства FGF (т.е. в комбинации с одним из этих компонентов или обоими). В некоторых примерах реализации SOX17-положительные клетки дефинитивной энтодермы приводят в контакт с В 27 в количестве, составляющем приблизительно от 0,1 до 20% (об./об.). В предпочтительном способе реализации SOX17-положительные клетки дефинитивной энтодермы приводят в контакт с ретиноевой кислотой, FGF-10 и В 27. Способы повышения уровня экспрессии продукта гена PDX1 в культурах клеток или популяциях клеток, содержащих SOX17-положительные клетки дефинитивной энтодермы, можно осуществить в среде для выращивания, содержащей пониженное количество сыворотки или в среде без сыворотки. В некоторых примерах реализации концентрации сыворотки лежат в пределах приблизительно от 0,05 до 20% (об./об.). В некоторых примерах реализации SOX17-положительные клетки выращивают с заменителем сыворотки. Идентификация факторов, способных стимулировать дифференцировку PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки Дополнительные аспекты настоящего изобретения относятся к способам идентификации одного или более факторов дифференцировки, способных стимулировать дифференцировку PDX1 отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки. В таких способах получают культуру клеток или популяцию клеток, содержащую PDX1 отрицательные клетки дефинитивной энтодермы, и определяют экспрессию PDX1 в этой культуре клеток или популяции клеток. После определения экспрессии PDX1 клетки культуры клеток или популяции клеток приводят в контакт с потенциальным фактором дифференцировки. В некоторых примерах реализации экспрессию PDX1 определяют во время контактирования или через небольшой промежуток времени после приведения в контакт с потенциальным фактором дифференцировки. Затем экспрессиюPDX1 определяют после контакта с потенциальным фактором дифференцировки один или более раз. Если после контактирования с потенциальным фактором дифференцировки уровень экспрессии PDX1 увеличился по сравнению с уровнем экспрессии до контакта с потенциальным фактором дифференцировки, этот потенциальный фактор дифференцировки идентифицируют как способный стимулировать дифференцировку PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в PDX1-положительные клетки дефинитивной энтодермы. В некоторых примерах реализации описанные выше способы идентификации факторов, способных стимулировать дифференцировку PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в PDX1 положительные клетки энтодермы передней кишки, включают также определение экспрессии гена НОХА 13 и/или гена НОХС 6 в культуре клеток или популяции клеток. В таких примерах реализации экспрессию НОХА 13 и/или НОХС 6 определяют как до, так и после контакта с потенциальным фактором дифференцировки. Если уровень экспрессии PDX1 и НОХА 13 после контакта с потенциальным фактором дифференцировки повышается по сравнению с уровнем экспрессии PDX1 и НОХА 13 до контакта с потенциальным фактором дифференцировки, этот потенциальный фактор дифференцировки идентифицируют как способный стимулировать дифференцировку PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки. Аналогично, если уровень экспрессии PDX1 и НОХС 6 после контакта с потенциальным фактором дифференцировки увеличивается по сравнению с уровнем экспрессии PDX1 и НОХС 6 до контакта с потенциальным фактором, данный потенциальный фактор дифференцировки идентифицируют как способный стимулировать дифференцировку PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки. В предпочтительном способе реализации потенциальный фактор дифференцировки идентифицируют как способный стимулировать дифференцировку PDX1-отрицательных клеток дефинитивной энтодермы в PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки посредством определения экспрессии PDX1, HOXA13 и НОХС 6 как до, так и после контакта клеток культуры клеток или популяции клеток с потенциальным фактором дифференцировки. В предпочтительных способах реализации экспрессию PDX1, НОХА 13 и/или НОХС 6 определяют способом количественной ПЦР. Очевидно, что в некоторых примерах реализации экспрессию одного или более генов из PDX1,НОХА 13 и НОХС 6 можно определять во время контактирования или через небольшой промежуток времени после контакта клеток культуры клеток или популяции клеток с потенциальным фактором дифференцировки, а не до приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки. В таких примерах реализации экспрессию одного или более генов из PDX1, НОХА 13 и HOXC6 во время контактирования клеток с потенциальным фактором дифференцировки или через небольшой промежуток времени после него сравнивают с уровнями экспрессии одного или более из генов PDX1, НОХА 13 и НОХС 6, определенными один или более раз после контакта клеток с потенциальными факторами дифференцировки. В некоторых примерах реализации описанных выше способов продолжительность одного или более промежутков времени после приведения в контакт с потенциальным фактором дифференцировки, через которые определяют экспрессию PDX1, может лежать в пределах приблизительно от 1 ч до 10 дней. Например, экспрессию PDX1 приблизительно через 1 ч после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 2 ч после приведения в контакт клеток с потен- 28011953 циальным фактором дифференцировки, приблизительно через 4 ч после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 6 ч после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 8 ч после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 10 ч после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 12 ч после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 16 ч после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 24 ч после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 2 дня после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 3 дня после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 4 дня после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки,приблизительно через 5 дней после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 6 дней после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 7 дней после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 8 дней после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 9 дней после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 10 дней после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки или более чем через 10 дней после приведения в контакт клеток с потенциальным фактором дифференцировки. Потенциальные факторы дифференцировки для применения в описанных здесь способах можно выбрать из соединений, таких как полипептиды и малые молекулы. Например, потенциальные полипептиды могут включать, без ограничения, факторы роста, цитокины, хемокины, белки внеклеточного матрикса и синтетические пептиды. В предпочтительном способе реализации фактор роста принадлежит к семейству FGF (факторов роста фибробластов), например FGF-10. Потенциальные малые молекулы включают, без ограничения, соединения, полученные путем комбинаторного химического синтеза, и природные продукты, такие как стероиды, изопреноиды, терпеноиды, фенилпропаноиды, алкалоиды и флавиноиды. Для среднего специалиста в данной области очевидно, что для применения в описанных здесь способах подходят тысячи классов природных и синтетических малых молекул, не ограниченных приведенными выше примерами. Обычно, молекулы небольшого размера будут иметь молекулярную массу менее 10,000 а.е.м. В предпочтительном способе реализации молекула небольшого размера представляет собой ретиноид, например ретиноевую кислоту. Идентификация факторов, способных стимулировать дифференцировку PDX1-положительных клеток дефинитивной энтодермы Другие аспекты настоящего изобретения относятся к способам идентификации одного или более факторов дифференцировки, способным стимулировать дифференцировку PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки. В таких способах получают культуру клеток или популяцию клеток, содержащую PDX1-положительные клетки энтодермы передней кишки, и определяют экспрессию какоголибо маркера в такой популяции клеток или колонии клеток. После определения экспрессии маркера культуру клеток или популяцию клеток приводят в контакт с потенциальным фактором дифференцировки. В некоторых примерах реализации экспрессию маркера определяют во время контактирования или через небольшой промежуток времени после контакта с потенциальным фактором дифференцировки. Затем экспрессию того же маркера определяют один или более раз после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки. Если уровень экспрессии маркера увеличивается или уменьшается после контакта с потенциальным фактором дифференцировки, по сравнению с уровнем экспрессии этого маркера до контакта с потенциальным фактором дифференцировки, этот потенциальный фактор дифференцировки идентифицируют как способный стимулировать дифференцировку PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки. В предпочтительных способах реализации экспрессию маркеров определяют способом количественной ПЦР. В некоторых примерах реализации описанных выше способов продолжительность одного или более промежутков времени, через которые определяют экспрессию маркера после приведения клеток в контакт с потенциальным фактором дифференцировки, может лежать в пределах приблизительно от 1 ч до 10 дней. Например, экспрессию маркера можно определять через 1 ч после приведения клеток в контакт с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 2 ч после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 4 ч после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 6 ч после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 8 ч после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 10 ч после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 12 ч после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 16 ч после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 24 ч после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки,приблизительно через 2 дня после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 3 дня после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизи- 29011953 тельно через 4 дня после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 5 дней после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 6 дней после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 7 дней после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 8 дней после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 9 дней после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки, приблизительно через 10 дней после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки или более чем через 10 дней после контакта клеток с потенциальным фактором дифференцировки. Как было описано ранее, потенциальные факторы дифференцировки для применения в описанных здесь способах можно выбрать из соединений, таких как полипептиды и молекулы небольшого размера. Хотя каждый из описанных здесь способов был описан для PDX1-положительных клеток энтодермы передней кишки, очевидно, что в определенных примерах реализации эти способы можно применять для получения композиций, содержащих PDX1-положительные клетки передней кишки/средней кишки,которые описаны здесь, и/или PDX1-положительных клеток энтодермы задней части передней кишки,которые описаны здесь. Более того, любые типы PDX1-положительных клеток эктодермы, раскрытые в этом описании, можно применять для описанных здесь способов скрининга. Ознакомившись с общим описанием этого изобретения, более полное понимание можно получить,обратившись к нескольким конкретным примерам, которые включены в настоящее описание только в качестве иллюстраций и не призваны ограничивать объем изобретения. Примеры Многие из приведенных ниже примеров описывают применение плюрипотентных клеток человека. Способы получения плюрипотентных клеток хорошо известны в данной области и были описаны во многих научных публикациях, включая патенты США 5453357, 5670372, 5690926, 6090622, 6200806 и 6251671 а также заявку на патент США 2004/0229350. Пример 1. ЭС клетки человека. Для исследований развития энтодермы использовали эмбриональные стволовые клетки человека,которые являются плюрипотентными и обладают, по-видимому, способностью неограниченно делиться в культуре, сохраняя нормальный кариотип. ЭС клетки получили из внутренней клеточной массы эмбриона возрастом 5 дней при использовании иммунологических или механических методов выделения. В частности, линию эмбриональных стволовых клеток человека hESCyt-25 получили из лишнего замороженного эмбриона, полученного в цикле оплодотворения in vitro после получения информированного согласия пациента. После размораживания вылупившуюся бластоцисту помещали в чашку на эмбриональные фибробласты мыши в среде для ЭС клеток (среда DMEM, 20% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, незаменимые аминокислоты, бета-меркаптоэтанол, добавка ITS). Эмбрион адгезировался на чашке для культивирования, и через приблизительно две недели области недифференцированных ЭСКч переносили на новые чашки с мышиными эмбриональными фибробластами. Перенос выполняли при помощи механического отрезания и кратковременного расщепления диспазой с последующим механическим отделением кластеров клеток, промывкой и переносом на другую чашку. В качестве исходного материала для получения дефинитивной энтодермы применяли линию эмбриональных стволовых клеток человека hESCyt-25. Для специалиста в данной области очевидно, что в качестве исходного материала для описанных здесь процедур дифференцировки можно также использовать стволовые клетки или другие плюрипотентные клетки. Например, в качестве исходного плюрипотентного клеточного материала можно использовать клетки, полученные из гонадных валиков эмбриона, которые можно выделять известными в данной области способами. Пример 2. Описание hESCyt-25. Линия эмбриональных стволовых клеток человека hESCyt-25 сохраняла нормальные морфологию,кариотип, свойства роста и самообновление на протяжении 18 месяцев в культуре. Эта линия клеток демонстрирует мощную иммунореактивность к антигенам ОСТ 4, SSEA-4 и TRA-1-60, каждый из которых является характеристическим для недифференцированных ЭСКч, а также демонстрирует алкалинфосфатазную активность и морфологию, идентичные активности и морфологии других устойчивых линий ЭСКч. Кроме того, эта линия эмбриональных стволовых клеток человека, hESCyt-25, также легко образует эмбриоидные тельца. Плюрипотентную природу линии hESCyt-25 демонстрирует то, что она дифференцируется в клетки разных типов, присутствующих в трех основных зародышевых листках. Получение эктодермы демонстрировали при помощи количественной ПЦР на ZICl, а также иммунохимического анализа на нестин и маркеры более зрелых нейронов. Иммуноцитохимическое окрашивание на III тубулин наблюдали в кластерах удлиненных клеток, отличающих ранние нейроны. Ранее мы обработали эмбриоидные тельца в суспензии ретиноевой кислотой, чтобы стимулировать дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в висцеральную энтодерму (ВЭ) - внезародышевую линию. Обработанные клетки экспрессировали высокие уровни альфа-фетопротеина (AFP) и SOX7 - двух маркеров висцеральной энтодермы к 54 ч после обработки. Как показало иммуноцитохимическое окрашивание, отдельные участки клеток, дифференцировавшихся в монослое, экспрессировали альфа-фетопротеин. Как