Flp-опосредованная рекомбинация
Формула / Реферат
1. Кассета рекомбинации, включающая участок промотора/энхансера; интересующий полинуклеотид; домен полиА-сигнала; домен FRT рекомбинации и полинуклеотид dhfr, где указанный участок промотора/энхансера, интересующий полинуклеотид и домен полиА-сигнала связаны операбельно.
2. Кассета рекомбинации по п.1, отличающаяся тем, что указанный участок промотора/энхансера включает очень ранний участок 1 из CMV (hCMV IE1).
3. Кассета рекомбинации по п.2, отличающаяся тем, что указанный участок промотора/энхансера hCMV IE1 включает последовательность, соответствующую участку от примерно x1 до примерно x2 в SEQ ID NO: 1 или 2, где x1 обозначает нуклеотид, локализованный от положения 1 до положения 70, и x2 обозначает нуклеотид, локализованный от положения 770 до положения 780.
4. Кассета рекомбинации по п.1, дополнительно включающая вставочную последовательность варьирующей длины (VLIVS), которая включает сайт донора сплайсинга и сайт акцептора сплайсинга.
5. Кассета рекомбинации по п.4, отличающаяся тем, что VLIVS включает интрон А из гена hCMV IE1.
6. Кассета рекомбинации по п.4, отличающаяся тем, что VLIVS включает интрон А из гена hCMV IE1, который имеет делецию между сайтом донора сплайсинга и сайтом акцептора сплайсинга.
7. Кассета рекомбинации по п.6, отличающаяся тем, что VLIVS включает последовательность от примерно x3 до примерно x4 в SEQ ID NO: 1, где x3 обозначает нуклеотид на участке 770-780 и x4 обозначает нуклеотид на участке 1300-1310 в SEQ ID NO: 1; или от примерно x5 до примерно x6 в SEQ ID NO: 2, где x5 обозначает нуклеотид на участке 770-780 и x6 обозначает нуклеотид на участке 1300-1310 в SEQ ID NO: 2.
8. Кассета рекомбинации по п.1, отличающаяся тем, что указанный интересующий полинуклеотид кодирует терапевтический агент.
9. Кассета рекомбинации по п.1, отличающаяся тем, что указанный домен полиА-сигнала включает по меньшей мере 100 соприкасающихся нуклеотидов в SEQ ID NO: 3.
10. Кассета рекомбинации по п.9, отличающаяся тем, что указанный домен полиА-сигнала включает SEQ ID NO: 3.
11. Вектор рекомбинации, включающий кассету рекомбинации по п.1.
12. Вектор рекомбинации по п.11, дополнительно включающий второй участок промотора/энхансера; второй интересующий полинуклеотид и второй домен полиА-сигнала, где второй участок промотора/энхансера, второй интересующий полинуклеотид и второй домен полиА-сигнала связаны операбельно.
13. Вектор рекомбинации по п.12, дополнительно включающий вставочный домен между вторым участком промотора/энхансера и вторым интересующим полинуклеотидом.
14. Клетка-хозяин, включающая вектор рекомбинации по п.11.
15. Клетка-хозяин по п.14, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в суспензии.
16. Клетка-хозяин по п.14, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в бессывороточной среде.
17. Клетка-хозяин по п.15, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в бессывороточной среде.
18. Клетка-хозяин, включающая кассету рекомбинации по п.1.
19. Клетка-хозяин по п.18, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в суспензии.
20. Клетка-хозяин по п.18, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в бессывороточной среде.
21. Клетка-хозяин по п.19, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в бессывороточной среде.
22. Система рекомбинации, включающая кассету рекомбинации по п.1 и клетку-хозяина, включающую сайт FRT.
23. Система рекомбинации по п.22, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой клетку CHO.
24. Система рекомбинации по п.23, отличающаяся тем, что указанная клетка CHO представляет собой клетку CHO-DG44.
25. Система рекомбинации по п.22, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в суспензии.
26. Система рекомбинации по п.22, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в бессывороточной среде.
27. Система рекомбинации по п.22, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин получена из клетки CHO-DG44.
28. Система рекомбинации по п.22, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой dhfr-.
29. Набор, включающий вектор по п.11 и клетку-хозяина, включающую сайт FRT.
30. Набор по п.29, отличающийся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой клетку dhfr- CHO, геном которой включает сайт FRT.
Текст
010059 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к рекомбинантным векторам и рекомбинантным кассетам и, более конкретно, к способам, композициям и системам, применяемым для экспрессии экзогенной молекулы в организме или клетке хозяина. Предпосылки создания изобретения Введение молекул нуклеиновой кислоты, полипептидов и пептидов в клетки и ткани-мишени используют в настоящее время как в качестве системы доставки терапевтических веществ, так и для получения in vitro молекул терапевтического действия. Возможности применения данной стратегии повышаются по мере приобретения новых знаний по хозяйским клеткам и молекулярной биологии клеточного деления, дифференциации и механизмов экспрессии. Воздействие на гены-мишени с помощью методов гомологической рекомбинации, осуществляемой между гомологичной эндогенной ДНК и эндогенными хромосомными последовательностями, является,как уже доказано, чрезвычайно ценным инструментом для создания делеций или вставок, заданных мутаций, корректирующих генных мутаций, для введения трансгенов или для осуществления других видов генетических модификаций. Краткое описание сущности изобретения Настоящее изобретение относится к рекомбинантной кассете, включающей участок промотора/энхансера; интересующий полинуклеотид, домен полиА-сигнала; домен рекомбинантного FRT; и полинуклеотид dhfr, где указанный участок промотора/энхансера, интересующий полинуклеотид и домен полиА-сигнала связаны операбельно. Настоящее изобретение также относится к вектору рекомбинации, включающему кассету рекомбинации, в состав которой входит участок промотора/энхансера; интересующий полинуклеотид; домен полиА-сигнала; домен рекомбинантного FRT; и полинуклеотид dhfr, где указанный участок промотора/энхансера, интересующий полинуклеотид и домен полиА-сигнала связаны операбельно. В одном варианте указанный вектор включает последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1 или 2. В еще одном варианте рекомбинантный вектор также включает второй участок промотора/энхансера, второй интересующий полинуклеотид и второй домен полиА-сигнала, где второй участок промотора/энхансера,второй интересующий полинуклеотид и второй полиА-сигнал связаны операбельно. Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей одну или несколько копий стабильно интегрированной кассеты рекомбинации по настоящему изобретению. В одном варианте указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в суспензии и/или бессывороточной среде. Настоящее изобретение также относится к системе рекомбинации. Система рекомбинаций включает плазмиду экспрессии, содержащую один или несколько доменов рекомбинантной FRT, и клеткухозяина, содержащую один или несколько сайтов FRT. В одном варианте клетка-хозяин представляет собой CHO клетку, которая включает, например, клетку CHO-DG44. В некоторых вариантах клеткахозяин адаптирована для роста в суспензии и/или в бессывороточной среде. Настоящее изобретение также относится к набору, включающему вектор и/или кассету рекомбинации по настоящему изобретению и клетку-хозяина, включающую сайт FRT. Детали одного или нескольких вариантов осуществления настоящего изобретения приведены в прилагаемых фигурах и в описании настоящего патента. Другие особенности, объекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из приведенного ниже описания фигур и из прилагаемой формулы изобретения. Описание фигур На фиг. 1 показан сайт FLP рекомбинантной мишени (FRT) и способ введения в геном клетокхозяев CHO. Вектор экспрессии, содержащий интересующий полинуклеотид, может быть трансфицирован (стабильно интегрирован) в геном посредством рекомбинации ДНК с участием FLP-рекомбиназы в сайте FRT. На фиг. 2 показана генная карта рекомбинантного вектора по настоящему изобретению (соответствует SEQ ID NO: 1) На фиг. 3 показана генная карта рекомбинантного вектора по настоящему изобретению (соответствует SEQ ID NO: 2), включающего вектор, который имеет два сайта для введения вставок (например,сайты множественного клонирования, начинающиеся в положениях 1309 и 6370). На фиг. 4 показана карта плазмиды pFRTlacZeo, которую используют для получения клеточной линии CHO-DG44 Flp-In. На фиг. 5 показана карта плазмиды pFRTlacZeo, на которой указан зонд, используемый для идентификации наличия FRT в трансфицированных хозяйских клетках. На фиг. 6 показана репрезентативная фотография 17 из 100 клеточных линий, исследованных с помощью саузерн-блоттинга. Каждая полоса содержит 10 мкг геномной ДНК из трансфицированной клеточной линии. Как следует из разного размера полос, большое число потенциальных линий клетокхозяев содержит последовательность FRT в состоянии интегрированности в CHO-DG44 по различным сайтам. Кроме того, на полосе 11 можно видеть, в качестве примера, факт множественности сайтов интеграции FRT, что следует из множественности полосок.-1 010059 На фиг. 7 показаны возможные варианты, которые также использовались для подтверждения того,что кассета FRT представлена в виде единственной копии. Полоса 1 включает 1 нг pFRT/lacZeo, который выполняет функцию позитивного контроля. Показаны результаты 9 из 35 взятых в качестве возможных вариантов клеточных линий. Каждая полоса содержит 10 мкг геномной ДНК из трансфицированной клеточной линии. Видны только единичные полосы, что подтверждает наличие единственной интеграции. Кроме того, различные размеры полос поддерживают тот факт, что имеются различные места локализации сайтов FRT. Полосы, соответствующие гибридизации, очень слабые, что является следствием наличия лишь одной копии последовательности FRT, присутствующей в геноме CHO-DG44. На фиг. 8 А и 8 В показана нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 1. На фиг. 9 А и 9 В показана нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 2. Подробное описание Настоящее изобретение относится к кассетам рекомбинации и к векторам рекомбинации, которые используются для гомологичной рекомбинации и стабильной интеграции желательного полинуклеотида(например, интересующего полинуклеотида) в клетке-хозяине. Настоящее изобретение относится к полинуклеотидной конструкции, которая включает последовательности, гомологичные эндогенной нуклеотидной последовательности хромосомы, что открывает возможность осуществления гомологичной рекомбинации в сайте хромосомной ДНК клетки-хозяина, где указанный полинуклеотид кодирует селектируемый маркер и сайт клонирования, и может также включать регуляторные элементы. Способы, системы и композиции по настоящему изобретению представляют собой мощный инструмент для создания определенных количеств белка с минимальными затратами на получение стабильной клеточной линии. В одном своем аспекте настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, включающему кассету рекомбинации, в которую входит регуляторный участок транскрипции цитомегаловирусов (CMV), вставочная последовательность варьирующей длины (например, из интрона А от CMV), интересующий полинуклеотид, рекомбинантный домен и домен сигнала полиаденилирования. Настоящее изобретение также относится к способам и векторам экспрессии, позволяющим осуществить продукцию и восстановление гетерологичных полинуклеотидов из клеток-хозяев. В другом аспекте рекомбинантная кассета по настоящему изобретению включает оперативно связанные (i) крупный очень ранний участок промотора/энхансера CMV (IE1) и вставочную последовательность варьирующей длины (например, производное интрона А), (ii) интересующий полинуклеотид, (iii) домен первого сигнала полиаденилирования (например, BHG или hGH полиА), (iv) рекомбинантный домен (например, сайт FRT), (v) селектируемый маркер (например, dhfr) и (vi) второй сигнал полиаденилирования (например, полиА из SV40 E). Термины "оперативно связанный", "связанный операбельно" относится к такому близкому расположению, при котором компоненты находятся в связи, позволяющей им функционировать нужным образом (например, в функциональной связи). Таким образом, например,промотор/энхансер, оперативно связанные с интересующим полинуклеотидом, ассоциированны с последним таким образом, что достигается экспрессия интересующего полинуклеотида в условиях, которые совместимы с активацией экспрессии данным промотором/энхансером. В одном варианте настоящего изобретения кассета рекомбинации включает последовательность,указанную в SEQ ID NO: 1, простирающуюся от примерно нуклеотида 1 до примерно нуклеотида 2704(например, от 1 до 2700, до 2701, до 2702, до 2703, до 2705, до 2706, до 2707 или до 2708). Другой пример относится к кассете рекомбинации, которая включает последовательность от примерно нуклеотида 1 до 2635 (например, от 1 до 2633, до 2634, до 2636 или 2637) в SEQ ID NO: 2. Кассета рекомбинации, показанная на участке от 1 до 2704 или от 1 до 2635 в SEQ ID NO: 1 или 2, соответственно, включает множество отдельных доменов, таких как участок промотора/энхансера CMV IE1, имеющий последовательность, указанную далее, от примерно х 1 до примерно х 2 в SEQ ID NO: 1 или 2, где х 1 обозначает нуклеотид от положения 1 до положения 70 и х 2 обозначает нуклеотид от положения 770 до положения 780 (например, от примерно положения 63 до примерно положения 776 в SEQ ID NO: 1 или 2). Другой домен в кассете рекомбинации включает вставочную последовательность варьирующей длины (VLIVS), содержащую сайт донора сплайсинга и сайт акцептора сплайсинга. VLIVS может содержать по меньшей мере 50 п.н. в длину (например, по меньшей мере 100, 150, 200 или 250 п.н.) и может включать доноры и акцепторы сплайсинга из любого известного источника (см., например, Varani et al., Annu Rev BiophysBiomol Struct 27:407-45 (1998) и Koning, Eur. J Biochem 219:25-42 (1994. Подходящий вставочный домен может включать полностью весь интрон А из генома CMV любого штамма или может включать более мелкий фрагмент, содержащий 5'-последовательность, в которую входит сайт донора сплайсинга,лигированный с 3'-последовательностью, содержащей сайт акцептора сплайсинга. Например, VLIVS включает нуклеотиды от примерно х 3 до примерно х 4 из SEQ ID NO: 1, где x3 обозначает нуклеотид в положении 770-780 и х 4 обозначает нуклеотид в положении 1300-1310 (например, 776-1304 в SEQ IDNO: 1). В другом примере VLIVS включает нуклеотиды от примерно х 3 до примерно х 4 в SEQ ID NO: 2,где х 3 обозначает нуклеотид в положении 770-780 и х 4 обозначает нуклеотид в положении 1300-1310(например, 776-1309 в SEQ ID NO: 2). Вставочная последовательность, идущая за промотором/энхансером CMV IE1, может варьировать по размеру и включать до 317 нуклеотидов из числа присутствующих в SEQ ID NO: 1 или 2. Сайт множественного клонирования может присутствовать после(т.е. по ходу считывания информации) участка VLIVS (например, на участке нуклеотидов 1310-1418 вSEQ ID NO: 1, который включает сайты NH3I, BamHI, KpnI, EcoRI, PmeI, PstI, EcoRV, NotI, XhoI, ApaI иPmeI; на участке нуклеотидов 1309-1332 в SEQ ID NO: 2, который включает сайты EcoRV, NotI, XhoI). B кассете рекомбинации могут быть созданы с использованием известных в данной области методик другие или дополнительные сайты рестрикции. Например, на фиг. 3 показаны два множественных сайта клонирования (см., например, сайты клонирования, начинающиеся на участке примерно 1309 и 6370),которые способствуют множественному клонированию родственных или неродственных полинуклеотидов. Данный вектор, включающий двойные кассеты, как показано на фиг. 3, также содержит терминатор между двумя кассетами. Кроме того, любой специалист в данной области понимает, что можно заменять, добавлять или делетировать один или несколько нуклеотидов на концах конкретных доменов, без изменения функциональности домена, и/или кассеты, и/или вектора в целом. Например, вариация от 1 до 10 нуклеотидов на любом конце любого из идентифицированных в описании доменов будет, по всей вероятности, включать функциональный домен для предполагаемой цели использования данного домена, кассеты и/или вектора по настоящему изобретению. Кассета рекомбинации также включает домен полиА-сигнала. Домен полиА-сигнала может быть получен из источников, взятых от человека (например, человеческого гормона роста (hGH полиА, или от быка (например, бычьего гормона роста (BGH полиА, или других источников животного происхождения. Домен полиА-сигнала может быть получен из гена hGH, который может варьировать по своей 3'UTR последовательности, например, от одной аллели к другой. Одна аллель гена hGHv описана в GenBank, No. доступа K00470 (SEQ ID NO: 3). Пример домена полиА-сигнала для BGH включает указанную ниже последовательность, которая содержит участок от примерно 1143 до примерно 1668 нуклеотидов вSEQ ID NO: 1 и участок от примерно 1375 до примерно 1600 нуклеотидов в SEQ ID NO: 2. Неприродные варианты доменов полиА-сигнала могут быть получены путем мутагенеза, включая методики, разработанные применительно к полинуклеотидам, клеткам или организмам. Вариант домена полиА-сигнала из гена hGH включает домен полиА-сигнала, который представляет собой вариации домена полиА-сигнала для hGH дикого типа, в которых все еще сохраняется способность воспринимать сигнал терминации транскрипции и/или стабилизации мРНК. Например, домен сигнала полиаденилирования может включать последовательность домена сигнала полиаденилирования для hGHv. Рассматривается любой домен полиА-сигнала, который включает непрерывную нуклеотидную последовательность с длиной по меньшей мере 100 нукл. (например, по меньшей мере 200, 300, 400, 500 или 600 нукл.), включая канонический сайт AATAAA, из гена hGHv. Дополнительно, настоящее изобретение относится к последовательностям, которые включают вариации относительно предшествующих последовательностей до 8% (например, имеющие 92% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 3 или ее заданным доменом). Например, в настоящее изобретение включен полинуклеотид, обладающий 95% идентичностью к нуклеотидам 1-2704 в SEQ ID NO: 1 или 1-2635 в SEQ ID NO: 2. В другом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, включающему кассету рекомбинации. В контексте настоящего описания термин "вектор" обозначает молекулу нуклеиновой кислоты(ДНК или РНК), способную к автономной репликации при введении в клетку-реципиент (например, в бактериальную клетку или клетку млекопитающего, такую как клетка CHO). Примерами векторов являются плазмиды и вирусы. Способ "экспрессии" на основе вектора экспрессии хорошо известен и включает использование клеточных ферментов и способы создания продуктов экспрессии на основе интересующих полинуклеотидов. Векторы экспрессии представляют собой векторы, которые способны вовлекаться в экспрессию клонированного полинуклеотида в клетке-хозяине, который может быть того же самого или иного типа относительно клетки, используемой для репликации или размножения вектора. Многие векторы экспрессии млекопитающих могут множиться в обычных бактериях (клеткахреципиентах), но экспрессия интересующего полинуклеотида осуществляется в клетках млекопитающих(клетках-хозяевах), но не в бактериях. Векторы по настоящему изобретению включают вектор клонирования для получения интересующего полинуклеотида; регуляторные элементы транскрипции (например, участки промотора/энхансераCMV IE1), достаточные для осуществления транскрипции полинуклеотида, встроенного в сайт клонирования в клетке-хозяине; элементы трансляции, достаточные для осуществления трансляции транскрипта РНК указанного полинуклеотида в клетке-хозяине и (при желании) элементы репликации, необходимые для осуществления репликации указанного вектора в клетке-хозяине или другой клетке-реципиенте, использованной для размножения вектора. Векторы по настоящему изобретению способны вовлекаться в такую экспрессию временно или стабильно в клетках-хозяевах (например, за счет гомологичной рекомбинации в геноме клетки-хозяина). В конкретном варианте вектор по настоящему изобретению включает (1) последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 или 2; (2) последовательность, которая является комплементарной к последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1 или 2; (3) последовательность, которая по меньшей мере на 80%(или по меньшей мере на 90, 95, 98 или 99%) идентична SEQ ID NO: 1 или 2 или их комплементам; или(4) последовательность, включающую SEQ ID NO: 1 или 2, на участке примерно от 1 до 2704 или 2635 нуклеотида, соответственно, и включающую также интересующий полинуклеотид и/или селектируемый маркер. Вектор по настоящему изобретению включает SEQ ID NO: 1 или 2, или один или несколько следующих доменов, если они содержат сайт для FRT. Например, в векторе присутствует участок промотора/энхансера CMV IE1, имеющий последовательность, показанную от примерно x1 до примерно x2 в SEQID NO: 1, где х 1 обозначает нуклеотид в положении от 1 до 70, и х 2 обозначает нуклеотид в положении от 770 до 780 (т.е. примерно от 1 до 776 в SEQ ID NO: 1). В другом аспекте изобретения в векторе присутствует участок промотора/энхансера CMV IE1, имеющий последовательность, показанную от примерноx1 до примерно х 2 в SEQ ID NO: 2, где x1 обозначает нуклеотид от 1 до 60 и х 2 обозначает нуклеотид от 770 до 780 (т.е. примерно от 1 до 776 в SEQ ID NO: 1). Другой домен вектора экспрессии по настоящему изобретению включает вставочную последовательность варьирующей длины (VLIVS), содержащую сайт донора сплайсинга и сайт акцептора сплайсинга. Например, VLIVS включает нуклеотиды от примерно х 3 до примерно х 4 в SEQ ID NO: 1, где х 3 обозначает нуклеотид от 770 до 780 и х 4 обозначает нуклеотид от 1300 до 1310 нуклеотидов (например, 776-1304 в SEQ ID NO: 1). В другом примере VLIVS включает нуклеотиды от примерно х 3 до примерно x4 в SEQ ID NO: 2, где x3 обозначает нуклеотид от 770 до 780 и x4 обозначает нуклеотид от 1300 до 1310 (например, 776-1309 в SEQ ID NO: 2). Сайт множественного клонирования может присутствовать после (т.е. по ходу считывания информации) участка VLIVS (участок нуклеотидов 1310-1418 в SEQ ID NO: 1 включает сайты NH3I, BamHI, KpnI, EcoRI, PmeI, PstI, EcoRV,NotI, XhoI, ApaI и PmeI; участок нуклеотидов 1309-1332 в SEQ ID NO: 2 включает сайты EcoRV, NotI,XhoI). B векторе экспрессии могут быть созданы разные или дополнительные сайты рестрикции с использованием методик, известных специалистам в данной области. Вектор экспрессии также включает домен полиА-сигнала. Домен полиА-сигнала может быть получен из источников человеческого происхождения (например, из человеческого гормона роста (hGH полиА, или от быка (например, бычьего гормона роста (BGH полиА, или других источников животного происхождения. Домен полиА-сигнала может быть получен из гена hGH, который может варьировать по своей 3'-UTR последовательности, например, от одной аллели к другой. Одна аллель гена hGHv описана в GenBank,доступа K00470 (SEQ ID NO: 3). Пример домена полиА-сигнала для BGH включает последовательность, содержащую участок от 1143 до 1668 нуклеотида в SEQ ID NO: 1 и участок от 1375 до 1600 нуклеотида в SEQ ID NO: 2. В векторе по настоящему изобретению может также присутствовать один или несколько селектируемых маркеров. Кассеты и векторы рекомбинации по настоящему изобретению имеют явное преимущество в сравнении с кассетами и векторами рекомбинации, известными в настоящее время. Например, кассеты и векторы по настоящему изобретению позволяют осуществлять стабильную интеграцию интересующего полинуклеотида в клетку-хозяина, включающую один или несколько сайтов для FRT, с использованием селектируемого маркера dhfr, который является ауксотрофным по своей природе и позволяет осуществлять простую и эффективную селекцию трансформированных клеток-хозяев. Отбор успешно трансфицированных клеточных линий обычно основан на использовании интегрированного селектируемого маркера, который придает устойчивость к цитотоксическим средствам (например, резистентность к антибиотикам). Неауксотрофные селектируемые маркеры придают устойчивость к веществам, которые в норме способны уничтожить организм (например, клетку). Когда такое цитотоксическое вещество вводят в организм, выживают только те варианты, в которых содержится данный селектируемый маркер. Таким образом, в случае типичных селектируемых маркеров, требуется, чтобы было добавлено экзогенное вещество для отбора клеток, которые являются устойчивыми. При этом должны добавляться соответствующие концентрации цитотоксического вещества, что требует дополнительных усилий со стороны технического специалиста или исследователя. Например, если добавляется слишком много цитотоксического вещества, то организм, который включает данный селектируемый маркер, может быть уничтожен за счет снижения эффективности трансфекции/трансформации с соответствующими последствиями такого процесса. Тогда как настоящее изобретение, наоборот, относится к ситуации, при которой селектируемый маркер не добавляют, но сами клетки имеют селектируемый маркер (например, dhfr), и в этой связи, способны расти в определенной среде без специфических добавок, что необходимо для организмов, не содержащих селектируемый маркер для роста. Дигидрофолятредуктаза (ДГФР) представляет собой НАДФ-зависимый фермент (ЕС 1.5.1.3), который катализирует синтез тетрагидрофолята, метаболита, необходимого для синтеза дТМФ, глицина и пуринов. В отсутствие полинуклеотида, кодирующего DHFR, клетка должна расти на среде, содержащей дТМФ, глицин и/или пурины. В том случае, когда селектируемый маркер DHFR присутствует в клетке,экзогенные пурины могут быть удалены, и те клетки, которые содержат маркер DHFR, продолжают расти и пролиферировать, тогда как и клетки без DHFR погибают. Соответственно, настоящее изобретение позволяет тратить меньшие усилий на отбор организмов (например, клеток), которые были трансфицированы/трансформированы. Система FLP по настоящему изобретению позволяет осуществлять стабильную интеграцию и экспрессию интересующего полинуклеотида в любой желательной клетке-хозяине млекопитающего в кон-4 010059 кретном положении генома. Клеточная линия клеток-хозяев FLP устанавливается путем трансфекции единичного целевого домена рекомбинации FLP (FRT) в геном выбранной линии клеток-хозяев; при этом создается вариант линии клеток-хозяев, которую затем используют для последующих FLP трансфекций/рекомбинаций. Как только получают такую линию клеток-хозяев, в геном клетки-хозяина можно осуществить стабильное интегрирование любого интересующего полинуклеотида путем рекомбинации ДНК с участием FLP-рекомбиназы в сайте FRT (см. фиг. 1). Интересующий полинуклеотид может эффективно "обмениваться с" геномом хозяина, причем всегда в идентичных положении и ориентации. Поскольку все трансфицированные клетки содержат интересующий полинуклеотид, интегрированный в одно и то же положение генома, выделения клональных клеточных линий не требуется, поскольку все трансфицированные клетки генетически одинаковы. Настоящее изобретение также относится к линии клеток-хозяев, которую получают путем трансфекции клеток яичника китайского хомяка (CHO)-DG44 сайтом мишени рекомбинации (например, сайтом рекомбинации FRT). Такая клеточная линия CHO-DG44 не содержит функционального гена дигидрофолятредуктазы (dhfr) и в этой связи требуется добавление экзогенного глицина, пуринов и тимидина(пиримидина) для роста. Такая клеточная линия должна поддерживаться в культуральной среде с добавлением нуклеозидов. При трансфекции кассетой/вектором рекомбинации по настоящему изобретению,которые содержат функциональный ген dhfr, селекцию проводят при культивировании клеток в среде, не содержащей пуринов и тимидина. При восстановлении такой линии клеток-хозяев могут быть очень быстро получены стабильные клеточные линии, экспрессирующие интересующий(ие) полинуклеотид(ы). Настоящее изобретение также относится к системе рекомбинации, включающей кассету и/или вектор рекомбинации по настоящему изобретению и клетку-хозяина, включающую сайт FRT. В одном аспекте настоящего изобретении клетка-хозяин представляет собой клетку CHO или клетку, полученную из CHO, которая включает сайт FRT, рекомбинантно встроенный в геном клетки-хозяина. Данная система (например, CHO клетка или полученная из CHO клетка и кассета/вектор рекомбинации) представляет собой мощный инструмент для получения от 10 до 40 мг/л рекомбинантного белка в клетке-хозяине CHO менее чем за 6 недель (например, со значением ICA 15107 (клеточных дней)/мл в ходе 10-дневного роста в биореакторе). Кроме того, требуется минимальная работа для установления таких стабильных клеточных линий. Способы и композиции по настоящему изобретению позволяют легко осуществлять интеграцию интересующего полинуклеотида в заданном сайте-мишени эндогенного полинуклеотида в клеткехозяине. Сайт-мишень эндогенного полинуклеотида может относиться к природному полинуклеотиду(например, к полинуклеотиду, который имеется в геноме клетки-хозяина и не был встроен по рекомбинантной методике), или он может представлять собой полинуклеотид, который был ранее сконструирован и введен в организм хозяина для облегчения селекции, экспрессии или рекомбинации в организме хозяина. В контексте настоящего описания термины "заданная мишень эндогенного полинуклеотида" и"заданная мишень" относятся к полинуклеотидным последовательностям, содержащимся в клеткемишени. Такая заданная мишень включает, например, хромосомные последовательности (например,структурные гены, интронные последовательности, 5'- или 3'-некодирующие последовательности, регуляторные последовательности, включающие промоторы и энхансеры, рекомбинаторные горячие точки,повторы, интегрированные последовательности провируса, шпилечные последовательности, палиндромы) и эписомные или внехромосомные последовательности (например, реплицирующиеся плазмиды или интермедиаты вирусной или паразитарной репликации), которые включают последовательности хлоропластной и митохондриальной ДНК. Термины "заданный" или "заранее отобранный" означают, что последовательность-мишень может быть выбрана на основе предсказанной последовательности и не ограничивается определенными сайтами, распознаваемыми некоторыми сайт-специфичными рекомбиназами(например, FLP-рекомбиназой или CRT-рекомбиназой). В некоторых вариантах заданная эндогенная полинуклеотидная мишень отличается от природного терминального полинуклеотида (например, экзогенный полинуклеотид, паразитарная, микоплазменная или вирусная последовательность). Экзогенный полинуклеотид представляет собой полинуклеотид, который был перенесен (например, с помощью рекомбинантных методик молекулярной биологии) в клетку-хозяина. Например, экзогенные полинуклеотиды, которые были перенесены путем микроинъекции или трансфекции в клетку, являются экзогенными полинуклеотидами. Термин "природный" в контексте настоящего описания применительно к объекту означает, что данный объект может быть обнаружен в природе. Например, полинуклеотид, который присутствует в организме (включая вирус), может быть выделен из природного источника, который не был модифицирован человеком и является природным. Рекомбинантный домен в кассете/векторе рекомбинации по настоящему изобретению направляет кассету/вектор в специфическое положение на хромосоме внутри генома организма-хозяина благодаря гомологии, которая существует между доменом рекомбинации и соответствующей заданной мишенью эндогенного полинуклеотида, и вводит желательную генетическую модификацию посредством способа,известного под названием "гомологичная рекомбинация". Термины "гомологичный" или "гомология" относятся к двум или более последовательностям нуклеиновых кислот, которые являются идентичными или достаточно близкими (например, идентичными на-5 010059 97% или более) и которые способны гибридизироваться друг с другом или подвергаться межмолекулярному обмену. Процент идентичности последовательностей вычисляют, исключая небольшие делеции или добавки, которые составляют менее 25% относительно эталонной последовательности. Эталонная последовательность может представлять собой подмножество более крупных последовательностей, таких как часть гена, или фланкирующая последовательность, или повторяющаяся часть хромосомы. Однако эталонная последовательность включает по меньшей мере 12-18 нуклеотидов в длину, по меньшей мере примерно 30 нуклеотидов в длину и может составлять по меньшей мере примерно 50-100 нуклеотидов в длину. В целом, эффективность рекомбинации повышается по мере увеличения длины и/или процента гомологии между доменом рекомбинации и заданной мишенью эндогенного полинуклеотида. Термины "идентичный" или процент "идентичности" в контексте двух или более молекул нуклеиновой кислоты относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые одинаковы или имеют заданный процент одинаковых нуклеотидов, при сравнении и выравнивании с целью выявления максимального соответствия в данном окне сравнения, при измерении с использованием алгоритма сравнения или при ручном сопоставлении и визуальном осмотре. Данное определение также относится к комплементу последовательности (например, к комплементу последовательности, указанной в SEQ ID NO: 1, или ее фрагменту, включающему кассету рекомбинации). Например, кассета рекомбинации и ее фрагменты включают такие варианты с показателями идентичности на уровне нуклеотидной последовательности, которые по меньшей мере примерно на 80%, примерно на 90%, примерно на 95%,примерно на 97%, примерно на 98% или примерно на 99% идентичны заданной части в SEQ ID NO: 1(например, нуклеотидам 1-719, 1-1254 и т.п., в последовательности SEQ ID NO: 1). Таким образом, если последовательность имеет требуемую идентичность на уровне последовательности к полной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее домену, то она может функционировать как кассета или домен рекомбинации по настоящему изобретению, соответственно. Для сравнения на уровне последовательности обычно используют одну последовательность, которая выполняет функцию эталонной последовательности и с которой проводят сравнение исследуемой последовательности. В случае использования алгоритма для сравнения последовательностей, в компьютер вводят информацию об исследуемой и эталонной последовательностях, разрабатывают координаты подпоследовательности, при необходимости, и определяют программные параметры алгоритма последовательности. Могут быть использованы заданные по умолчанию параметры программы или могут быть разработаны альтернативные параметры. Далее алгоритм сравнения последовательностей вычисляет процент идентичности на уровне последовательности данной(ых) последовательности(ей) относительно эталонной последовательности, на основании разработанных или заданных по умолчанию параметров программы. Термин "окно сравнения" в контексте настоящего описания означает соотнесение с сегментом любого из множества соприкасающихся положений, выбранных из группы, состоящей из 25-600,обычно примерно 50-200, чаще примерно 100-150 положений, по которым может проводиться сравнение данной последовательности с эталонной последовательностью по одному и тому же набору соприкасающихся положений после оптимального выравнивания двух последовательностей. Способы выравнивания последовательностей для сравнения известны в данной области. Известны также разные алгоритмы, которые включают, например, алгоритм локальной гомологии Смита и Ватермана (SmithWaterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981, алгоритм сопоставления по гомологии (NeedlemanWunsch, J. Mol.Biol. 48:443 (1970, поиск сходства по методу Пирсона и Липмана (PearsonLipman, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 85:2444 (1988, а также различные компьютеризированные варианты данных алгоритмов (GAP,PILEUP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в программном обеспечении Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) или с помощью ручного выравнивания и визуального осмотра. Для целей определения процента идентичности на уровне последовательности по данному изобретению (например, существенного сходства или идентичности) используют алгоритм BLAST, который описан Альтшулем (Altschul, J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990). Программное обеспечение для проведения анализа в рамках BLAST доступно для общественного пользования через Национальный Центр Биотехнологической Информации (на web-странице Национального Центра Биотехнологической Информации(National Center for Biotechnology Information) ncbi.nlm.nih.gov/). Данный алгоритм включает вначале идентификацию пар последовательностей с высоким баллом (HSP) путем идентификации коротких слов длиной W в запрашиваемой последовательности, которые либо полностью соответствуют, либо удовлетворяют некоторым положительным пороговым значениям в баллах пороговому значению T при сопоставлении со словом той же длины в базе данных последовательностей. Параметр "T" означает пороговую величину, используемую для оценки порогового значения соседства слов. Указанная исходная величина степени соседства слов действует как затравка для первоначальных поисков с целью нахождения более длинных HSP, содержащих их. Указанные высокие значения по соседству слова затем расширяют в обоих направлениях вдоль каждой последовательности, настолько, насколько может быть повышено кумулятивное сопоставление по баллам. Кумулятивные баллы вычисляют с использованием, в случае нуклеотидных последовательностей, параметров M (присваиваемые баллы для случая пары спаривающихся остатков; всегда 0) и N (штрафные очки, присваиваемые в случае неспаривающихся остатков, всегда 0).-6 010059 Расширение попаданий при соответствии слов в каждом направлении обрывается в том случае, когда кумулятивный балльный показатель, определяемый при выравнивании, падает на значение X от его максимально достижимого значения; кумулятивный показатель баллов опускается до 0 или ниже из-за накопления одного или более результатов сопоставления в виде остатков с негативным показателем; или при достижении конца любой последовательности. Параметры W, T или X в алгоритме BLAST определяют чувствительность и скорость сопоставления и включают следующие параметры для проведения сравнительного анализа нуклеотидов: длина слова (W) 11, ожидание (E) 10, М=5, N=4. В случае аминокислотных последовательностей программа BLASTP использует значение длины слова (W) 3, параметр ожидания (E) 10 и балльную матрицу BLOSUM62 (см., например, Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915,1989). Алгоритм BLAST также выполняет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Karlin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993). Одним из критериев сходства последовательностей, оцениваемых в рамках алгоритма BLAST, является наименьшая сумма вероятностей (P(N, которая дает указание на вероятность спаривания между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями, осуществляемыми случайным образом. Нуклеиновая кислота считается сходной с эталонной последовательностью, если наименьшая сумма вероятностей меньше чем 0,1. Например, она может быть меньше чем примерно 0,01 или меньше чем примерно 0,001. В настоящее изобретение также включаются полинуклеотиды, которые специфически гибридизуются с полинуклеотидной последовательностью, показанной в виде SEQ ID NO: 1 или 2, или их доменом. Фраза "селективно (или специфически) гибридизуется с" относится к связыванию, образованию дуплекса или гибридизации молекулы с конкретным эталонным полинуклеотидом в строгих условиях гибридизации. Фраза "строгие условия гибридизации" относится к условиям, при которых зонд преимущественно гибридизуется с подпоследовательностью-мишенью в сложной смеси нуклеиновых кислот, но не с другими последовательностями. Строгие условия зависят от последовательности и различаются в разных случаях, например, зависят от длины зонда. Более длинные последовательности гибридизуются специфически при высоких температурах. Обширный обзор по вопросу гибридизации нуклеиновых кислот приведен в соответствующем руководстве (Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacids assays" (1993. В основном, строгие условия выбираются так, чтобы они были на 5-10C ниже, чем температура точки плавления (Tm) для конкретной последовательности при заданных значениях ионной силы и pH. Tm представляет собой температуру (в определенных условиях ионной силы, pH и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных к мишени, гибридизуется с целевой последовательностью в равновесном соотношении (поскольку целевые последовательности присутствуют в избытке, при Tm 50% зондов находятся в равновесном состоянии). Строгие условия будут такими, при которых концентрация соли составляет менее чем примерно 1,0 M ионов натрия, в типичном случае примерно от 0,01 до 1,0 M концентрации ионов натрия (или других солей) при pH 7,0-8,3 и при температуре, которая по меньшей мере составляет 30C для коротких зондов (например, длиной примерно 10-50 нуклеотидов) и, по меньшей мере, при температуре 60 С для длинных зондов (например, крупнее, чем примерно 50 нуклеотидов). Строгие условия могут быть достигнуты при добавлении дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Для проведения селективной или специфической гибридизации позитивный сигнал (т.е. идентификация нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению) превышает примерно в 2 раза фоновый уровень гибридизации. Для целей настоящего изобретения понятие умеренно строгих условий гибридизации означает, что гибридизация проводится при температуре примерно 42C в растворе для гибридизации, содержащем 25 мМ KPO4 (pH 7,4), 5 Х SSC, 5 Х раствор Денхарта, 50 мкг/мл денатурированной, обработанной ультразвуком ДНК спермы лосося, 50% формамида, 10% сульфата декстрана и 1-15 нг/мл зонда, а промывку осуществляют при температуре 50C промывным раствором,содержащим 2 Х SSC и 0,1% додецилсульфата натрия. Условия гибридизации высокой строгости означают, что гибридизацию проводят при температуре 42 С в растворе для гибридизации, содержащем 25 мМ KPO4 (pH 7,4), 5 Х SSC, 5 Х раствор Денхарта, 50 мкг/мл денатурированной, обработанной ультразвуком ДНК спермы лосося, 50% формамида, 10% сульфата декстрана и 1-15 нг/мл зонда, а промывку осуществляют при температуре 65 С промывным раствором, содержащим 0,2 Х SSC и 0,1% додецилсульфата натрия. Способы и композиции по настоящему изобретению находят применение при модификации клеткихозяина посредством введения в нее, делеции или замещения эндогенного полинуклеотида путем гомологичной рекомбинации с использованием кассеты/вектора по настоящему изобретению. Кассета/вектор рекомбинации по настоящему изобретению может включать селектируемый маркер. Термин "маркер" или "селектируемый маркер" обозначает маркер, используемые для селекции, который позволяет выделять редко трансфицируемые клетки, экспрессирующие маркер, из множества обработанных клеток в популяции. Конкретные примеры селектируемых маркеров включают такие маркеры, которые кодируют белки, придающие резистентность к цитостатическим или цитоцидным лекарственным препаратам, таким как белок DHFR, который придает резистентность к метотрексату (Wigler et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 77:3567, (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 78:1527, (1981; белок GPF,-7 010059 который придает резистентность к микофенольной кислоте (MulliganBerg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981; маркер резистентности к неомицину, который придает резистентность к аминогликозидуG-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981; белок Hygro, который придает устойчивость к гигромицину (Santerre et al., Gene 30:147 (1984; и маркер резистентности к зеоцину (Zeocin) (коммерчески доступный от компании Invitrogen). Дополнительно, тимидинкиназа из вируса простого герпеса(1980 могут использоваться на tk-, hgprt- или aprt-клетках, соответственно. Другие селектируемые маркеры включают N-ацетилтрансферазу пуромицина или аденозиндезаминазу. Особое преимущество дает маркер dhfr. DHFR представляет собой фермент, который требуется для синтеза пиримидинов. Клетки, в которых отсутствует функциональный DHFR или которые не экспрессируют DHFR, нуждаются в пиримидинах для роста. Клетка-хозяин, которая является dhfr-, может быть трансфицирована вектором dhfr, что приводит к восстановлению ее способности синтезировать пиримидины. При удалении среды, содержащей экзогенные пиримидины, выживают только те клетки, которые включают экзогенно введенный ген dhfr. И наоборот, при использовании маркеров, которые позволяют проводить селекцию на основе способности клеток расти в присутствии цитотоксических средств, вести отбор труднее всего. Например, в том случае, когда клетку трансфицируют "геном резистентности", добавляют различные концентрации цитотоксических средств для отбора клеток, которые включают ген резистентности. В некоторых случаях может быть добавлено или слишком много цитотоксического средства или недостаточно, и в этих случаях селекция будет неэффективной и/или ненадежной. Последовательности SEQ ID NO: 1 и 2 включают ген дигидрофолятредуктазы (dhfr) (например,включают последовательность с участком от примерно 2007 нуклеотида до примерно 2567 нуклеотида вSEQ ID NO: 1; и с участком от примерно 1939 нуклеотида до примерно 2499 нуклеотида в SEQ ID NO: 2). Кассета/вектор рекомбинации по настоящему изобретению может включать дополнительные элементы промотора/энхансера и регуляторные участки (например домены полиаденилирования). Такие дополнительные регуляторные элементы и домены полиаденилирования могут фланкировать (например, могут непосредственно примыкать к 5'- и 3'-концам) селектируемый маркер интересующего полинуклеотида. Ген dhfr в таких векторах фланкирован участком полиаденилирования из SV40 (например, представляет собой участок от примерно 2568 нуклеотида до примерно 2704 нуклеотидов и от примерно 2500 нуклеотида до примерно 2635 нуклеотида в SEQ ID NO: 2, соответственно). Кассета и/или вектор рекомбинации по настоящему изобретению включает рекомбинантный домен,состоящий по меньшей мере примерно из 10-100 нуклеотидов, в типичном случае по меньшей мере примерно 20-100 нуклеотидов в длину, но может быть длиннее (например, составляет в длину по меньшей мере примерно 250-500 нуклеотидов или примерно 500-2000 нуклеотидов в длину или больше). Длина рекомбинантного домена может частично определяться наличием гомологии с заданным эндогенным полинуклеотидом-мишенью. Соответственно, длина гомологии может быть отобрана по усмотрения практикующего специалиста на основе состава последовательности и сложности заданной(ых) последовательности(ей) эндогенного полинуклеотида-мишени и имеющегося в данной области соответствующего руководства. Рекомбинантный домен включает по меньшей мере одну последовательность, которая,по существу, соответствует или, по существу, является комплементарной к заданному эндогенному полинуклеотиду (например, последовательности ДНК полинуклеотида, расположенного в целевой клеткехозяине, такой как хромосомный, митохондриальный, хлоропластный, вирусный, эписомный или микоплазменный полинуклеотид). Такие нуклеотидные последовательности рекомбинантного домена служат в качестве матриц для гомологичного спаривания с заданным эндогенным полинуклеотидом-мишенью. При нацеливании интересующего полинуклеотида в составе вектора на геном клетки-хозяина участки гомологии обычно располагаются непосредственно или в окрестности 5'- или 3'-конца(ов) интересующего полинуклеотида (Berinstein et al., (1992) Molec. Cell. Biol. 12:360, указанная работа включена в настоящее описание в качестве ссылки). Не связывая себя приверженностью к какой-либо теории, следует отметить, что добавление рекомбиназ позволяет осуществлять более эффективное нацеливание с использованием нуклеотидной последовательности рекомбинантного домена, имеющей короткие (например,примерно 10-1000 пар нуклеотидов в длину) сегменты гомологии. В соответствии с настоящим изобретением рекомбинантный домен расположен в сайте FRT. В типичном случае рекомбинантный домен включает последовательность, которая имеет высокую степень гомологии с заданным эндогенным полинуклеотидом-мишенью, и обычно идентичен. В типичном случае нуклеотидная последовательность рекомбинантного домена по настоящему изобретению составляет примерно от 10 до 35 нуклеотидов в длину, но может достигать примерно 20-100 нуклеотидов в длину или примерно 100-500 нуклеотидов в длину, хотя степень гомологии последовательностей между рекомбинантным доменом и заданным эндогенным полинуклеотидом-мишенью будет определять оптимальную и минимальную длину (например, G-C обогащенные последовательности обычно термодинамически более стабильны и в основном требуют более коротких рекомбинантных доменов). В этой связи, и длина рекомбинантного домена, и степень гомологии на уровне последовательности определяются относительно конкретной заданной последовательности.-8 010059 Кассету рекомбинации по настоящему изобретению и/или вектор по настоящему изобретению вводят в клетку-хозяина, содержащую заданный эндогенный полинуклеотид-мишень, в основном с использованием по меньшей мере одного белка рекомбиназы (например, рекомбиназы Flp). В некоторых случаях кассету или вектор рекомбинации инкубируют с Flp или другой рекомбиназой до введения в клеткухозяина, так чтобы белок(ки) рекомбиназы мог/могли быть "погружен(ы)" в кассету рекомбинации или вектор рекомбинации. Рекомбиназы представляют собой белки, которые при включении в интересующий полинуклеотид,содержащий домен рекомбинации, приводят к измеряемому повышению частоты рекомбинации и/или частоты локализации между интересующим полинуклеотидом и заданным эндогенным полинуклеотидом-мишенью. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения может быть достигнуто повышение частоты рекомбинации от 10 до 1000 раз. Рекомбиназа относится к семейству RecA-подобных белков рекомбинации, которые имеют, по существу, все или большую часть одних и тех же функций, в частности: (i) способность белка рекомбиназы соответствующим образом связываться и располагать интересующий полинуклеотид, включающий домен рекомбинации, на гомологичной мишени и (ii) способность комплексов белок рекомбиназы/полинуклеотид-мишень эффективно находить и связываться с комплементарными эндогенными последовательностями. Лучше всего среди них охарактеризован recA белок из E. coli. Дополнительно к белку E. coli дикого типа было идентифицировано множество мутантных recA-подобных белков (например, recA803; см. Madiraju et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(18):6592 (1988); Madiraju et al., Biochem. 31:10529 (1992); Lavery et al., J. Biol. Chem. 267:20648 (1992. Кроме того, многие организмы имеютrecA-подобную рекомбиназу с активностью по переносу цепей (например, Fugisawa et al., Nucl. Acid. Res. 13:7473 (1985); Hsieh et al., Cell 44:885 (1986); Hsieh et al., J. Biol. Chem. 264:5089 (1989); Fishel et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3683 (1988); Cassuto et al., Mol. Gen. Genet. 208:10 (1987); Ganea et al., Mol.Natl. Acad. Sci. USA 84:5560 (1987); Sugino et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3683 (1985); Halbrook et al.,J. Biol. Chem. 264:21403 (1989); Eisen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7481 (1988); McCarthy et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5854 (1988); Lowenhaupt et al., J. Biol. Chem. 264:20568 (1989), которые включены в настоящее описание в качестве ссылок). Примеры таких белков рекомбиназы включают, без ограничения: recA, recA803, uvsX и другие мутанты recA, а также recA-подобные рекомбиназы (Roca, A.Cell. Biol. 11:2576 (1991), HPP-1 (Moore et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9067 (1991; и другие целевые рекомбиназы (Bishop et al., Cell 69:439 (1992); Shinohara et al., Cell 69:457 (1992), которые включены в настоящее описание в качестве ссылок). RecA может быть также очищен из E. coli, таких штаммов E.coli, как JC12772 и JC15369 (которые доступны коммерчески). Данные штаммы содержат последовательности, кодирующие recA, на плазмидном векторе с очень высоким репликативным потенциалом, присутствующем в виде большого числа копий в клетке. Белок recA803 представляет собой высокоактивный мутант recA дикого типа. Описано несколько примеров белков рекомбиназы, например, из Drosophila,дрожжей, растений, организма человека и клеток млекопитающих, отличных от человека, биологические свойства которых аналогичны recA (например, recA-подобная рекомбиназа), такие как Rad51 из клеток млекопитающих и дрожжей и Pk-rec из гипертермофильных архебактерий Pyrococcussp (см., Rashid et al.,Nucleic Acid Res. 25(4):719 (1997), которые включены в настоящее описание в качестве ссылки). Рекомбиназа фактически может представлять собой комплекс белков. В определение рекомбиназы включаются также части или фрагменты рекомбиназ, которые сохраняют биологическую активность рекомбиназы, а также варианты или мутанты рекомбиназ дикого типа, которые сохраняют биологическую активность,такие как мутант E. coli recA803 с повышенной рекомбиназной активностью.RecA образует гомологичные связи между гомологичными последовательностями и включается в качестве посредника в процесс поиска гомологии между экзогенной полинуклеотидной цепью (например, интересующим полинуклеотидом, включающим домен рекомбинации) и эндогенной полинуклеотидной цепью (например, заданной полинуклеотидной мишенью), с образованием относительно стабильных гетеродуплексов на участках с высокой степенью гомологии. Соответственно, рекомбиназы могут направлять гомологичную реакцию рекомбинации между цепями, которые являются в существенной мере, но не полностью гомологичными. Таким образом, кассета/вектор рекомбинации могут использоваться для введения нуклеотидных замещений, вставок и делеций в эндогенную последовательность ДНК и, таким образом, соответствующих аминокислотных замещений, вставок и делеций в белках, экспрессированных на основе эндогенной последовательности ДНК. В одном варианте в качестве рекомбиназы используют recA или rad51. Например, recA белок получают в типичном случае из бактериальных штаммов, которые осуществляют суперпродукцию recA белка из E. coli дикого типа или мутантного белка recA803. Альтернативно, recA белок может быть приобретен, например, у компании Pharmacia (Piscataway, N.J.).USA 80:4223-4227, 1983) и затем был очищен почти до гомогенного состояния (см., например, MeyerLeon et al., Nucl. Acids Res. 15:6469-6488, 1987). FLP-рекомбиназа коммерчески доступна или может быть получена специалистами в данной области из источников, относящихся, например, к родуSaccharomyces. Сайт FRT был идентифицирован как участок, включающий два повтора из 13 пар нуклеотидов, разделенных спейсером из 8 нуклеотидных пар: например, это может быть последовательность, включающая 5'-GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC-3' (SEQ ID NO: 1 на участке от 1966 до 1999 нуклеотида и SEQ ID NO: 2 на участке от 1882 до участка 1937; обозначенная курсивом последовательность относится к спейсеру). Нуклеотиды, входящие в состав спейсерного участка, могут быть замещены другим сочетанием нуклеотидов, так что два повтора по 13 пар нуклеотидов разделяются по меньшей мере 8 нуклеотидами. Фактически, нуклеотидная последовательность спейсера не является решающим фактором, хотя для специалистов понятно, что в некоторых приложениях желательно, чтобы спейсер был ассиметричным, тогда как для других приложений может использоваться палиндромный спейсер. В основном, спейсеры, присутствующие в домене рекомбинации и в сайте FRT, присутствующем в клеткехозяине, идентичны друг другу. Домен рекомбинации по настоящему изобретению и сайт FRT в клеткехозяине могут включать последовательность, соответствующую участку от 1966 до 1999 нуклеотида вWO 00/63365, WO 99/60108, WO 00/56872, WO 99/37755, патенты США 5948653, 6074853, 5763240,5929043 и 5989879, которые полностью включены в настоящее описание в качестве ссылок. Следует понимать, что в композиции и способы по настоящему изобретению включают использование рекомбиназ,соответствующих тем, которые были описаны здесь, а также других рекомбиназ, известных специалистам в данной области. Как указывалось выше, кассета и вектор рекомбинации включают регуляторные элементы. В одном аспекте настоящего изобретения указанные промоторные и необязательно энхансерные элементы могут быть получены из любого штамма цитомегаловируса, такого как описано здесь, или соответствующего тем штаммам, которые приведены в цитированных публикациях, таких как патент США 5658795,описание которого приведено в настоящей работе в качестве ссылки. Например, в кассетах рекомбинации по настоящему изобретению применимы подходящие участки очень раннего промотора CMV, которые могут быть получены из вектора экспрессии -галактозидазы, функционирующего под действием промотора CMV, CMV (MacGregor et al., Nucl. Acids Res. 17:2365 (1989. Кассета рекомбинации может быть использована в виде голой конструкции нуклеиновой кислоты. Альтернативно, кассета рекомбинации может быть введена в виде части вектора на основе нуклеиновой кислоты (например, вектора рекомбинации, такого как было описано выше). Такие векторы включают плазмиды и вирусные векторы. Термин "интересующий полинуклеотид" относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые способны транскрибироваться. Молекула может иметь смысловую или антисмысловую ориентацию относительно промотора. Антисмысловые конструкции могут использоваться для ингибирования экспрессии гена в клетке, в соответствии с известными методиками. Интересующий полинуклеотид может включать гетерологичный полинуклеотид. Гетерологичный полинуклеотид в типичном случае получают из чужеродного организма, относительно регуляторного элемента, с которым он оперативно связан в кассете или векторе рекомбинации, или может быть получен из того же самого источника, и в этом случае, он будет модифицирован относительно исходной формы. В этой связи, гетерологичный полинуклеотид, оперативно связанный с промотором, происходит из источника, отличного от того источника, из которого был получен промотор или, если он был получен из того же самого источника, то содержит модификацию относительно своей первоначальной формы. Модификация гетерологичного полинуклеотида может происходить, например, путем обработки ДНК рестриктазой с образованием фрагмента ДНК,который способен к оперативному связыванию с промотором, что приводит к модификации полинуклеотида относительно его исходной формы. Может быть использован также сайт-направленный мутагенез для модификации гетерологичного полинуклеотида. Гетерологичные полинуклеотиды могут также включать маркерные гены (например, кодирующие -галактозидазу или зеленый флуоресцентный белок) или гены, продукты которых регулируют экспрессию других генов. Таким образом, полинуклеотиды,которые служат в качестве матриц для мРНК, тРНК и рРНК включаются в данное определение. Гетерологичный ген может быть любым аллельным вариантом гена дикого типа или может представлять собой мутантный ген. мРНК необязательно включает некоторые или все из 5'- и/или 3'-транскрибированных, но не транслированных фланкирующих природных участков или, в ином случае, ассоциированных с транслированной кодирующей последовательностью. Интересующий полинуклеотид может также необязательно включать ассоциированные управляющие элементы транскрипции, которые в норме ассоциируются с транскрибированными молекулами, на- 10010059 пример, со стоп-сигналами транскрипции, доменами полиаденилирования и энхансерными элементами,функционирующими по направлению считывания информации. Интересующий полинуклеотид может кодировать терапевтический продукт или служить в качестве матрицы для него, который может представлять, например, пептид, полипептид, белок или рибонуклеиновую кислоту. Интересующий полинуклеотид в типичном случае представляет собой последовательность ДНК (такую как кДНК или геномная ДНК), кодирующую полипептидный продукт, такой как ферменты (например, -галактозидазу); гормоны; цитокины; интерлейкины; интерфероны; TNF; факторы роста (например, IGF-1); молекулы растворимого рецептора (например, молекулы растворимого рецептора TNF); нейротрансмиттеры или их предшественники, тропные факторы, такие как BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3 и NT5; аполипопротеины, такие как ApoAI и ApoAIV; дистрофин или минидистрофин; белки, подавляющие развитие опухоли, такие как р 53, Rb, Rap1A, DCC и k-rev; факторы, участвующие в коагуляции, такие как факторы VII, VIII и IX; или, альтернативно, полностью или частично природные или искусственные иммуноглобулины (например, Fab и ScFv, или легкая или тяжелая цепь, клонированного IgG). Интересующий полинуклеотид может также включать матрицу для создания антисмысловых молекул, транскрипция которых в целевой клетке позволяет осуществлять экспрессию или транскрипцию гена, или транскрипцию клеточных мРНК, подлежащих контролю. Такие молекулы могут быть, например, транскрибированы в целевой клетке в РНК, комплементарную клеточным мРНК, и могут, таким образом, блокировать их трансляцию в белок, в соответствии с известными в данной области методиками. В частности, антисмысловые молекулы могут использоваться для блокирования трансляции воспалительных или катаболических цитокинов при лечении артрита и разрежении ткани, вызванной такими цитокинами. Интересующий полинуклеотид может в типичном случае включать полинуклеотид, применимый для диагностических или терапевтических целей. Данный полинуклеотид может быть получен в биореакторах in vitro с использованием различных клеток-хозяев (например, клеток COS или клеток CHO, или их производных), содержащих кассету рекомбинации по настоящему изобретению. Терапевтическое использование в настоящем контексте означает использование, которое может привести к ослаблению проявлений заболевания или расстройства, излечению от заболевания или расстройства и/или снижению тяжести заболевания или расстройства. Диагностическое использование включает использование молекул, способных выявлять или давать информацию относительно причины или связи молекулы с болезненным процессом, определять наличие или отсутствие заболевания или расстройства. Диагностический агент не вносит непосредственно вклада в облегчение заболевания или расстройства. Интересующий полинуклеотид может также кодировать генный полипептид, применяемый в качестве вакцины. Полинуклеотиды, которые кодируют антигенные белки, получают из патогенных организмов, таких как, например, бактерия или вирус. Например, антигенные полинуклеотиды включают антигенные детерминанты, присутствующие в полипептиде из патогенного организма. Соответственно,могут быть получены вакцины для применения в случае таких организмов, которые вызывают, например, вирусную геморрагическую септицемию, болезнь почек бактериальной природы, вибриоз и фурункулез. В контексте настоящего изобретения термин "выделенный" применительно к молекуле или композиции, таким как, например, вектор или кассета рекомбинации по настоящему изобретению или интересующий полинуклеотид, означает, что молекула или композиция была отделена по меньшей мере от одного другого соединения, такого как белок, ДНК, РНК или другие контаминанты, с которыми она ассоциирована in vivo, или находится в природном состоянии. Таким образом, интересующий полинуклеотид считается выделенным, если он был отделен от любого другого компонента, с которым он ассоциирован в естественном состоянии. Выделенная композиция может быть, по существу, чистой. Выделенная композиция может быть в гомогенном состоянии. Они может быть высушена, лиофилизирована или иметь вид водного раствора. Степень чистоты и гомогенности может быть определена, например, с использованием методов аналитической химии, таких как электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), электрофорез в агарозном геле или высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). В контексте настоящего описания термин "рекомбинантный" относится к полинуклеотиду, синтезированному или полученному иным образом in vitro (например, к "рекомбинантному полинуклеотиду"),к способам использования рекомбинантных полинуклеотидов для получения продуктов в клетках или других биологических системах, или к полипептиду ("рекомбинантному белку"), кодируемому рекомбинантным полинуклеотидом. Рекомбинантные полинуклеотиды включают молекулы нуклеиновой кислоты из разных источников, лигированные с образованием рекомбинантной кассеты или вектора для экспрессии, например, белка слияния или продуктов, получаемых путем индуцибельной или конститутивной экспрессии с образованием полипептида (например, на основе рекомбинантной кассеты или вектора по настоящему изобретению, оперативно связанных с гетерологичным полинуклеотидом, таким как последовательность, кодирующая полипептид). В типичной системе экспрессии продукция полипептида на основе гетерологичного полинуклеоти- 11010059 да либо не регулируется, либо регулируется путем модуляции транскрипции за счет оперативно связанного промотора транскрипции, расположенного против хода считывания информации в полинуклеотиде,который кодирует гетерологичный полипептид. Однако для того, чтобы обеспечить соответствующую терминацию транскрипции и стабильность мРНК, регуляция должна происходить соответствующим образом по ходу считывания информации. В одном аспекте настоящего изобретения домен сигнала полиаденилирования (полиА) расположен по ходу считывания информации (3') в интересующем полинуклеотиде, присутствующем в кассете или векторе рекомбинации по настоящему изобретению. В одном аспекте используют домен полиА-сигнала из hGHv, который включает последовательность, полученную из генетической последовательности гормона роста человека. Последовательность домена сигнала полиаденилирования из hGHv обеспечивает эффективную терминацию транскрипции и более высокую стабильность получаемой мРНК в эукариотических клетках. Домен сигнала полиаденилирования из hGHv обеспечивает явное преимущество в сравнении с кассетами или векторами рекомбинации, известными на достигнутом уровне техники, включающими элементы, которые могут использовать промотор/энхансер из CMV. Элементы трансляции также могут присутствовать и предназначены для взаимодействия со специализированными последовательностями (такими как сайты связывания рибосом и кодоны инициации),которые необходимы для осуществления трансляции транскриптов РНК в белок. Элементы трансляции могут также включать консенсусные последовательности, лидерные последовательности, сплайсингсигналы и другие, которые облегчают или усиливают трансляцию или повышают стабильность экспрессированного продукта. Векторы по настоящему изобретению могут содержать вспомогательные участки транскрипции, такие как интроны, сигналы полиаденилирования, сигналы трансляции Шайна-Дальгарно(Shine/Dalgarno) и консенсусные последовательности Козака (Shine et al., Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 71:1342-1346 (1974); Kozak, Cell 44:283-292 (1986. Термин "элементы репликации" относится к специализированным последовательностям (таким как ориджин репликации), которые необходимы для репликации вектора в клетке-реципиенте. В целом, такие векторы содержат по меньшей мере один ориджин репликации, достаточный для осуществления автономной стабильной репликации вектора в клетке-реципиенте. В другом варианте настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим указанные выше конструкции (например, кассету или вектор рекомбинации по настоящему изобретению). Кассета рекомбинации по настоящему изобретению может использоваться для рекомбинантной модификации клетки-хозяина путем трансфекции клетки-хозяина или трансформации клетки-хозяина для экспрессии желательного интересующего полинуклеотида. В контексте настоящего описания термин "рекомбинантно модифицированный" означает введение кассеты или вектора рекомбинации по настоящему изобретению в живую клетку или систему экспрессии. Обычно кассета рекомбинации, включающая интересующий полинуклеотид, присутствует в векторе (например, в плазмиде). Система экспрессии включает живую клетку-хозяина, в которую введен интересующий полинуклеотид, продукт которого экспрессируется, как описано здесь. Клетки-хозяева представляют собой клетки, в которых может быть размножена кассета рекомбинации (включающая вектор, содержащий кассету рекомбинации), и могут быть экспрессированы полинуклеотиды, кодирующие продукты. Клетка-хозяин также включает любое потомство такой клетки-хозяина или ее производных. Следует понимать, что все потомство может быть не полностью идентично родительской клетке, поскольку в процессе репликации могут происходить мутации. Однако такое потомство включается в понятие термина "клетка-хозяин". Клетки-хозяева, которые применимы в контексте настоящего изобретения, включают бактериальные клетки (например, E. coli), грибные клетки (например,клетки дрожжей), растительные клетки и клетки животных. Так, например, клетки-хозяева могут включать клетку высшего эукариота, такую как клетка млекопитающего, или клетку низшего эукариота, такую как дрожжевая клетка, или клетка-хозяин может представлять собой прокариотическую клетку, такую как бактериальная клетка. Введение конструкции в клетку-хозяина может быть осуществлено путем трансфекции с использованием фосфата кальция, путем трансфекции с использованием ДЭАЭ-декстрана или путем электропорации (Davis, L., Dibner, M., Battey, L., Basic Methods in Molecular Biology (1986. B качестве репрезентативных примеров соответствующих клеток-хозяев можно указать следующие: клетки грибов, такие как дрожжи; клетки насекомых, такие как клетки Drosophila S2 и Spodoptera Sf9; клетки животных, такие как клетки CHO, COS или меланомы (Bowes); растительные клетки и т.п. Выбор соответствующего хозяина может осуществить любой специалист со средним уровнем в данной области, на основе приведенного здесь описания. Клетки-хозяева, применимые в рамках настоящего изобретения, включают эукариотические клеткихозяева (например, клетки млекопитающих). В одном аспекте настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, представляющим собой продуцирующие клетки млекопитающих, адаптированные для роста в клеточной культуре. Примеры таких клеток, обычно используемых в данной области, включаютCHO, VERO, BHK, HeLa, CV1 (включая Cos; Cos-7), MDCK, 293, 3T3, С 127, клеточную линию миеломных клеток (в особенности мышиных), клетки PC12 и W138. Широко используются клетки яичника китайского хомяка (CHO) для получения некоторых сложных рекомбинантных белков, например, цитоки- 12010059 нов, факторов свертывания крови и антител (Brasel et al., Blood 88:2004-2012 (1996); Kaufman et al., J.Biol. Chem., 263:6352-6362 (1988); McKinnon et al., J. Mol. Endocrinol 6:231-239 (1991); Wood et al., J. Immunol 145:3011-3016 (1990. Линии мутантных клеток, дефицитных по дигидрофолятредуктазе (DHFR)(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 (1980, представляют собой линии клеток CHO,выбираемых в связи с возможностью проводить эффективную селекцию по маркеру DGFR и приемлемостью данной системы генной экспрессии для амплификации, что позволяет достигать высокого уровня экспрессии рекомбинантного белка в таких клетках (Kaufman et al., Meth Enzymol 185:527-566 (1990. Кроме того, данными клетками можно легко манипулировать, используя их в виде адгезионных или суспензионных культур, которые обладают относительно высокой генетической стабильностью. КлеткиCHO и экспрессируемые в них рекомбинантные белки были тщательно изучены и разрешены контрольными органами для использования в производстве клинических продуктов. Кроме того, как следует полагать, могут также использоваться клетки-хозяева, получаемые на основе любой из указанных выше клеточных линий, которые имеют желательный фенотип. Например, такие клеточные линии включают клетки CHO (например, клеточную линию DG44), которые в процессе селективного культивирования дают желательный фенотип (например, при культивировании с использованием методов позитивной и/или негативной селекции). В одном аспекте клетки CHO адаптированы для роста в бессывороточной среде и могут быть также, или независимо от этого, адаптированы для роста в суспензии (см., например,Sinacore et al., Biotechnol. Bioengin. 52:518-528 (1996); и Haldankar et al., Biotechnol. Prog. 15:336-346(1999. Суспензия адаптированных клеток легче поддается манипуляциям и позволяет достигать более высокой плотности культуры. Клетки, адаптированные к бессывороточной среде, обеспечивают преимущества, связанные с легкостью очистки рекомбинантного белка из культурального супернатанта этих клеток. В одном аспекте настоящее изобретение относится к системе экспрессии in vitro для продукции агента, кодируемого интересующим полинуклеотидом. Как показано в настоящем описании, интересующий полинуклеотид может кодировать полипептид, обладающий фармацевтической, медицинской,питательной и/или промышленной ценностью. Например, интересующий полинуклеотид может кодировать лекарственное вещество полипептидной природы. В типичном случае такой полипептид экспрессируется как внеклеточный продукт. Например, полипептиды, которые могут быть получены с использованием кассеты и/или вектора рекомбинации по настоящему изобретению, включают, без ограничения,лиганд Flt3, лиганд CD40, эритропоэтин, тромбопоэтин, кальцитонин, лиганд Fas, лиганд для рецептора активатора NF-каппа В (RANKL), TNF-связанный лиганд, индуцирующий апоптоз (TRAIL), ORK/Tek,лимфопоэтин, полученный из стромальных клеток вилочковой железы, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов, фактор роста тучных клеток, фактор роста стволовых клеток, эпидермальный фактор роста, RANTES, гормон роста, инсулин,инсулинотропин, инсулиноподобные факторы роста, паратиреоидный гормон, интерфероны (например,интерферон-бета), факторы роста нервных клеток, глюкагон, интерлейкины 1-18, колониестимулирующие факторы, лимфотоксин-, фактор некроза опухолевых клеток, факторы, ингибирующие лейкоз, онкостатин-М, различные лиганды для молекул клеточной поверхности Elk и Hek (такие как лиганды дляeph-связанных киназ или LERKS), и легкие или тяжелые цепи антитела. Рецепторы (или их растворимые фрагменты) для любого из указанных ниже белков могут быть экспрессированы с использованием методов и композиций по настоящему изобретению, которые включают обе формы рецептора фактора некроза опухолевых клеток (обозначенных как р 55 и р 75), рецепторы интерлейкина-1 (типа 1 и 2), рецепторы интерлейкина-4, рецепторы интерлейкина-15, рецепторы интерлейкина-17, рецепторы интерлейкина-18, рецептор гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, рецептор гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, рецепторы фактора,ингибирующего онкостатин-М и лейкоз, рецептор активатора NF-каппа, (RANK), рецептор TRAIL, рецептор BAFF, рецептор лимфотоксина-бета, рецептор TGF типа I и II и рецепторы, которые включают фатальные домены, такие как Fas или рецептор индукции апоптоза (AIR). Другие белки, которые могут быть экспрессированы с использованием кассеты и/или векторов рекомбинации по настоящему изобретению, включают кластер антигенов дифференциации (называемых как CD белки), например, описанные в литературе (Leukocyte Typing VI (Proceedings of the VIth International Workshop and Conference; Kishimoto, Kikutani et al., eds., Kobe, Japan, 1996, или CD молекулы,описанные в других работах. Примеры таких молекул включают CD27, CD30, CD39, CD40 и их лиганды(лиганд CD27, лиганд CD30 и лиганд CD40). Некоторых их этих молекул являются представителями семейства TNF рецепторов, которые включают 41BB и ОХ 40; указанные лиганды часто относятся к семейству TNF (как и лиганд 41BB и лиганд ОХ 40); соответственно, члены семейства TNF и TNFR могут быть также экспрессированы согласно настоящему изобретению. Полипептиды, которые обладают ферментативной активностью, могут быть также экспрессированы согласно настоящему изобретению. Примеры таких полипептидов включают представителей семейства металлопротеиназы-дезинтегрина, различные киназы, глюкоцереброзидазу, супероксиддисмутазу,тканевой активатор плазминогена, фактор VIII, фактор IX, аполипопротеин E, аполипопротеин A-I, гло- 13010059 бины, антагонист IL-2, альфа-1 антитрипсин, TNF-альфа превращающий фермент (TACE) и различные другие ферменты. Лиганды для белков, обладающих ферментативной активностью, могут быть также экспрессированы с использованием кассет и векторов по настоящему изобретению. Композиции и способы по настоящему изобретению также могут использоваться для экспрессии других типов рекомбинантных белков и полипептидов, включающих молекулы иммуноглобулина или их части и химерных антител (например, антител, имеющих константный участок человеческой молекулы,соединенный со связывающим участком мышиного антигена) или их фрагменты. Известны различные методики, с помощью которых можно манипулировать ДНК, кодирующими молекулы иммуноглобулина, получая ДНК, кодирующие рекомбинантные белки, такие как одноцепочечные антитела, антитела с повышенной аффинностью или другие полипептиды антительной природы (см., например, Larrick et al.,Biotechnology 7:934-938 (1989); Reichmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Roberts et al., Nature 328:731734 (1987); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); Chaudhary et al., Nature 339:394-397 (1989. Клонированные гуманизированные антитела включают антитела, которые специфически связываются с бета-рецептором лимфотоксина и интегринами, такими как VLA-1, VLA-4 и v6. Такие антитела могут быть агонистами или антагонистами. Различные белки слияния могут быть также экспрессированы с использованием способов и композиций по настоящему изобретению. Примеры таких белков слияния включают белки, экспрессируемые в виде слияния с частью молекулы иммуноглобулина, белки, экспрессируемые в виде белков слияния с зиппер-фрагментом, и новые полифункциональные белки, такие как белок слияния цитокина и фактора роста (см., например, GM-CSF и IL-3, MGF и IL-3). В WO 93/08207 и WO 96/40918 описано получение различных растворимых олигомерных форм молекулы, обозначаемой как CD40L, включающей иммуноглобулиновый гибридный белок и зиппер-белок слияния, соответственно. Методики, приведенные в данных документах, применимы также и к другим белкам. После экспрессии интересующего полинуклеотида продукт экспрессии (например, белок или полипептид) может быть очищен с использованием известных в данной области стандартных методик. Например, в том случае, когда интересующий полинуклеотид кодирует полипептид слияния, включающий метку, полезную для очистки, данный полипептид может быть очищен с использованием антител, которые специфически связываются с данной меткой. В одном аспекте олигонуклеотид, кодирующий молекулу метки, лигируют по 5'- или 3'-концу интересующего полинуклеотида, кодирующего желательный полипептид; олигонуклеотид может кодировать полиHis (такой как hexaHis) или другую "метку", такую как FLAG, HA (гемагглютинин вируса гриппа) или myc, для которых существуют коммерчески доступные антитела. Указанную метку обычно сливают с полипептидом при экспрессии полипептида, и она может служить в качестве полезного инструмента для аффинной очистки желательного полипептида при его выделении из клетки-хозяина. Аффинная очистка может быть осуществлена, например, путем колоночной хроматографии с использованием антител против метки в качестве аффинной матрицы. Необязательно метка может быть впоследствии удалена от очищенного полипептида с помощью различных способов, таких как протеолитическое расщепление. Кассета и векторы рекомбинации по настоящему изобретению могут использоваться для достижения стабильного переноса интересующего полинуклеотида в клетку-хозяина. Стабильный перенос означает, что интересующий полинуклеотид непрерывно поддерживается в организме хозяина. Векторы, содержащие интересующий полинуклеотид, могут быть перенесены в клетку-хозяина с использованием известных методик, выбор которых определяется типом клетки-хозяина. Например,обычно используют микроинъекцию в целевые клетки, хотя также могут быть применимы обработка фосфатом кальция, электропорация, использование липофектина, биолистиков или других способов трансфекции, основанных на вирусах. Другие способы, используемые для трансформации клеток млекопитающих, включают использование полибрена (Polybrene), метод слияния протопластов и другие (см., в основном, работу Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., 1989, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., которая включена в настоящее описание в качестве ссылки). В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору. Данный набор включает кассету и/или вектор рекомбинации по настоящему изобретению. Набор также включает клетку-хозяина, содержащую сайт мишени (например, сайт FRT). Такие клетки-хозяева обычно представляют в виде одного или нескольких укупоренных контейнеров (например, в пакете, ампуле, тубе или микротитрационном планшете), которые могут включать в ряде вариантов питательные среды. Обычно набор включает описание свойств данного организма-хозяина (например, его генотип) и/или инструкции по способу проведения трансформации. В некоторых вариантах набор включает один или несколько полинуклеотидов,включающих кассету и/или вектор рекомбинации по настоящему изобретению, и может также включать ферменты (например, Flp-рекомбиназу) в отдельных контейнерах. Примеры. Получение кассеты/вектора рекомбинации. Плазмиду pFRT/lacZeo (Invitrogen Inc., каталожный V6015-20; см. фиг. 4) линеаризуют рестрикционной эндонуклеазой SapI (1 единица эндонуклеазы SapI на 1 мкг плазмиды) и расщепляют при температуре 37 С в течение примерно 16 ч. Используемые для трансфекции организмы представляют собой де- 14010059 фицитную по дигидрофолятредуктазе (DHFR) линию клеток яичника китайского хомячка DG44 (Urlaubet al., Cell 33, 405-412, (1983. Для каждой трансфекции используют приблизительно 2106 жизнеспособных клеток CHO-DG44. Клетки-хозяева подвергают электропорации при 280 В, 960 мкФ с использованием 500 нг линеаризованной плазмиды pFRT/lacZeo для трансфекции. Варианты успешной трансфекции отбирают на средах, содержащих 200 мкг/мл антибиотика зеоцина (Zeocin) (Invitrogen Inc., каталожный R250-01). Колонии, успешно растущие на селективных средах, отбирают в 24-ячеечные планшеты для культивирования клеток. Указанные изоляты размножают в 6-ячеечных культуральных планшетах до достижения плотности, достаточной для переноса трансфицированных клеток в колбы Т 225. Из трансфицированных клеток (5106 клеток) выделяют геномную ДНК. Геномную ДНК из более чем 100 клеточных линий исследуют методом саузерн-блоттинга для подтверждения того, что имеется всего одна копия последовательности FRT. Последовательность зонда охватывает всю последовательность FRT и 5'-конец гена слияния бета-галактозидазы (см. фиг. 5). Из 100 клеточных линий, подвергнутых скринингу, были отобраны только 35 клеточных линий, содержащих единственный сайт интеграции FRT, для определения уровня экспрессии белка (см. фиг. 6 и 7). Клонирование репортерных генов. Кассету/вектор рекомбинации по настоящему изобретению, включающую CMV IE1, фрагмент интрона А и домен полиА-сигнала, сравнивают с коммерчески доступным вектором рекомбинации. Секретируемую щелочную фосфатазу (SEAP) используют в качестве модели секретируемых белков для определения уровня экспрессии с использованием CHO-DG44 Flp-In в качестве линии клеток-хозяев. Последовательность, кодирующую SEAP, получают из плазмиды экспрессии pSEAP2 (Clontech, PaloAlto, CA) путем амплификации в полимеразно-цепьевой реакции (ПЦР). 5'-праймер получают на основе сайта KpnI, и 3'-праймер создают с использованием сайта BglII. 5'-праймер:(терминирующий кодон обозначен жирным шрифтом)BglII ПЦР проводят следующим образом: 3 мкг плазмиды pSEAP (Clontech, Palo Alto, CA); 1 мкМ каждого из 5-' и 3'-праймеров (см. выше): 0,25 мМ дНТФ (Promega, Madison, WI); 2 единицы полимеразыVent (New England Biolabs, Beverly, MA); 1X буфер для полимеразной реакции Vent (New EnglandBiolabs, Beverly, MA). ПЦР проводят в 100 мкл реакционной смеси. ПЦР проводят в течение 30 циклов: при 95C в течение 30 с, 55 С в течение 45 с и при 75C в течение 2 мин и затем при 75C в течение 10 мин и выдерживают при температуре 4 С. Получают продукт ПЦР длиной примерно 1,6 кбайт, соответствующий участку, кодирующему SEAP. Продукт ПЦР выделяют из смеси и очищают для ПЦР с использованием набора для очистки Wizard PCR (Promega, Madison, WI) и разбавляют dH2O. Продукт ПЦР расщепляют вначале эндонуклеазой KpnI (New England Biolabs, Beverly, MA) и затем BglII (NewEngland Biolabs, Beverly, MA). 10 нг плазмиды pFRT/dhfr-1, которая была ранее расщеплена KpnI и BamHI, лигируют с расщепленным SEAP продуктом ПЦР. Секвенируют участок, кодирующий SEAP, и точки сочленения. Как и ожидалось, результаты соответствуют гипотетической последовательности. Плазмида была обозначена как pFRT/SEAP. Трансфекцию репортерного гена SEAP в хозяйскую клеточную линию Flp-In проводят путем электропорации. 10 мкг pFRT/SEAP объединяют с 90 мкг pOG44 (Invitrogen, Carlsbad, CA), как плазмиды,экспрессирующей Flp-рекомбиназу. ДНК осаждают этанолом, промывают в 70% этаноле и высушивают. Для трансфекции используют 2106 жизнеспособных клеток из клеточной линии. Клетки и ДНК объединяют асептически в 800 мкл стерильного HeBS (20 мМ HEPES pH 7,05, 137 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 0,7 мМNa2HPO4, 6 мМ декстрозы) и переносят в кювету с длиной 0,4 см (BioRad, Hercules, CA). Электропорацию проводят с использование устройства GenePulser (BioRad, Hercules, CA), установленном на режим работы при 0,28 кВ и 950 мкФ. После импульсной электропорации клетки инкубируют в кювете в течение 5-10 мин при комнатной температуре. Затем их переносят в центрифужную пробирку, содержащую 10 мл альфа MEM и нуклеозиды (Gibco, Gaithersburg, MD) с 10% диализованной фетальной сыворотки теленка (дФСТ) (Hyclone, Logan, UT) и осаждают при центрифугировании в режиме 1000 об/мин в течение 5 мин. Ресуспендированный осадок высевают в 6-ячеечные планшеты на среду альфа-MEM без нуклеозидов с добавкой 10% дФСТ и инкубируют при 36C в присутствии 5% CO2 в увлажненном инкубаторе в течение примерно 2 недель, с получением колоний. Стабильные трансфицированные варианты анализируют в виде изолятов. Изоляты получают путем"отбора" колоний из вариантов, полученных после трансфекции. "Отбор" проводят аспирацией непосредственно колонии с использованием Pipetman P200, установленного на 50 мкл. Аспирированные колонии переносят вначале на 24-ячеечный планшет. Как только в ячейке достигается 50% слияния,- 15010059 среды заменяют на химически чистые среды ProCHO4 (Cambrex, Walkersville, MD), содержащие 4 мМ Lглютамина (Cambrex, Walkersville, MD), после чего клетки переносят в 6-ячеечные планшеты. Удельную продуктивность оценивают в 6-ячеечных планшетах в точке слияния или близко к ней. Удельную продуктивность оценивают в тесте SEAP при замене среды свежей средой с проведением отбора образцов среды и подсчета числа клеток, выросших через 4 дня. Титр продукта нормализуют относительно количества клеток по истечении 4 дней и продуктивность выражают в виде активности SEAP на клетку. Кондиционированную среду анализируют с использованием репортерной системы Great EscAPeSEAP Reporter System 3 (Clontech, Palo Alto, CA). В указанном тесте используют флуоресцентный субстрат для выявления активности SEAP в кондиционированной среде. Набор используют в 96-ячеечном формате, в соответствии с инструкциями производителя. Все стандарты и образцы разбавляют прилагаемой свежей средой, а не буфером для разведения. Вместо одного измерения через 60 мин, измерения проводят через 10 мин и через 40 мин, и на основе полученных данных выражают активность SEAP в относительных единицах флуоресценции в минуту (RFU/мин). Используют эмиссионный фильтр в сочетании с прибором для анализа планшетов Cytofluor II (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA), который устанавливают на работу при длине волны 460 нм вместо рекомендованной длины 449 нм. Значение RFU/мин нормализуют по стандартной кривой относительно стандарта, прилагаемого к набору. Поскольку прилагаемый стандарт не охарактеризован количественно, все значения являются относительными. Указанные относительные значения нормализуют применительно к числу клеток и времени инкубации, получая значения относительной удельной продуктивности (активность SEAP на клетку в расчете на один день). Экспрессия SEAP в хозяйских клетках A1 Flp-In CHO-DG44 Среднее значение показателя RFU/мин = 0,740,01 Среднее значение активности SEAP/клетку/день 1 Е 6 = 0,50,1 В данном описании было приведено множество вариантов осуществления настоящего изобретения. Тем не менее, следует понимать, что возможны различные модификации, без отхода от принципов и объема настоящего изобретения. Соответственно, возможны другие варианты его осуществления, определяемые объемом притязаний прилагаемой формулы изобретения.- 16010059 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Кассета рекомбинации, включающая участок промотора/энхансера; интересующий полинуклеотид; домен полиА-сигнала; домен FRT рекомбинации и полинуклеотид dhfr, где указанный участок промотора/энхансера, интересующий полинуклеотид и домен полиА-сигнала связаны операбельно. 2. Кассета рекомбинации по п.1, отличающаяся тем, что указанный участок промотора/энхансера включает очень ранний участок 1 из CMV (hCMV IE1). 3. Кассета рекомбинации по п.2, отличающаяся тем, что указанный участок промотора/энхансераhCMV IE1 включает последовательность, соответствующую участку от примерно x1 до примерно x2 вSEQ ID NO: 1 или 2, где x1 обозначает нуклеотид, локализованный от положения 1 до положения 70, и x2 обозначает нуклеотид, локализованный от положения 770 до положения 780. 4. Кассета рекомбинации по п.1, дополнительно включающая вставочную последовательность варьирующей длины (VLIVS), которая включает сайт донора сплайсинга и сайт акцептора сплайсинга. 5. Кассета рекомбинации по п.4, отличающаяся тем, что VLIVS включает интрон А из гена hCMVIE1. 6. Кассета рекомбинации по п.4, отличающаяся тем, что VLIVS включает интрон А из гена hCMVIE1, который имеет делецию между сайтом донора сплайсинга и сайтом акцептора сплайсинга. 7. Кассета рекомбинации по п.6, отличающаяся тем, что VLIVS включает последовательность от примерно x3 до примерно x4 в SEQ ID NO: 1, где x3 обозначает нуклеотид на участке 770-780 и x4 обозначает нуклеотид на участке 1300-1310 в SEQ ID NO: 1; или от примерно x5 до примерно x6 в SEQ ID NO: 2, где x5 обозначает нуклеотид на участке 770-780 и x6 обозначает нуклеотид на участке 1300-1310 в SEQID NO: 2. 8. Кассета рекомбинации по п.1, отличающаяся тем, что указанный интересующий полинуклеотид кодирует терапевтический агент. 9. Кассета рекомбинации по п.1, отличающаяся тем, что указанный домен полиА-сигнала включает по меньшей мере 100 соприкасающихся нуклеотидов в SEQ ID NO: 3. 10. Кассета рекомбинации по п.9, отличающаяся тем, что указанный домен полиА-сигнала включает SEQ ID NO: 3. 11. Вектор рекомбинации, включающий кассету рекомбинации по п.1. 12. Вектор рекомбинации по п.11, дополнительно включающий второй участок промотора/энхансера; второй интересующий полинуклеотид и второй домен полиА-сигнала, где второй участок промотора/энхансера, второй интересующий полинуклеотид и второй домен полиА-сигнала связаны операбельно. 13. Вектор рекомбинации по п.12, дополнительно включающий вставочный домен между вторым участком промотора/энхансера и вторым интересующим полинуклеотидом. 14. Клетка-хозяин, включающая вектор рекомбинации по п.11. 15. Клетка-хозяин по п.14, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в суспензии. 16. Клетка-хозяин по п.14, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в бессывороточной среде. 17. Клетка-хозяин по п.15, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в бессывороточной среде. 18. Клетка-хозяин, включающая кассету рекомбинации по п.1. 19. Клетка-хозяин по п.18, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в суспензии. 20. Клетка-хозяин по п.18, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в бессывороточной среде. 21. Клетка-хозяин по п.19, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в бессывороточной среде. 22. Система рекомбинации, включающая кассету рекомбинации по п.1 и клетку-хозяина, включающую сайт FRT. 23. Система рекомбинации по п.22, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой клетку CHO. 24. Система рекомбинации по п.23, отличающаяся тем, что указанная клетка CHO представляет собой клетку CHO-DG44. 25. Система рекомбинации по п.22, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в суспензии.- 17010059 26. Система рекомбинации по п.22, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин адаптирована для роста в бессывороточной среде. 27. Система рекомбинации по п.22, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин получена из клетки CHO-DG44. 28. Система рекомбинации по п.22, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой dhfr-. 29. Набор, включающий вектор по п.11 и клетку-хозяина, включающую сайт FRT. 30. Набор по п.29, отличающийся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой клетку dhfrCHO, геном которой включает сайт FRT.
МПК / Метки
МПК: C12N 15/87, C12N 15/85, C12N 5/10
Метки: flp-опосредованная, рекомбинация
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-10059-flp-oposredovannaya-rekombinaciya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Flp-опосредованная рекомбинация</a>
Предыдущий патент: Пептиды, модулирующие активацию каспазы
Следующий патент: Конъюгаты иммуногенных пептидных носителей и способы их получения
Случайный патент: Устройство и способ объединения компонентов для курительных изделий