Скоростной микроанализ стерильности

Настоящее изобретение относится к способу выявления жизнеспособных микроорганизмов в фармацевтической композиции, включающему этапы предоставления способной к фильтрации фармацевтической композиции; фильтрования фармацевтической композиции для обеспечения по меньшей мере трех мембранных фильтров, на которые нанесена фильтруемая фармацевтическая композиция, расположения трех мембранных фильтров на однородной среде для культивирования для произведения по меньшей мере трех фильтруемых культур в аэробных и анаэробных условиях и выявления жизнеспособных клеток микроорганизмов, микроколоний или колоний на мембране,где присутствие жизнеспособных клеток микроорганизмов, микроколоний или колоний указывает на наличие жизнеспособных микроорганизмов в фармацевтической композиции. Родственные заявки По заявке на данный патент испрашивается приоритет предварительной заявки США 61/175271,поданной 4 мая 2009 г. Полное раскрытие изобретения в вышеупомянутой заявке включено в настоящий документ ссылкой. Предшествующий уровень техники Федеральные инструкции в Соединенных Штатах Америки и подобные инструкции в других государствах предусматривают испытание на стерильность, гарантирующее, по существу, освобождение фармацевтических препаратов от микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Для проведения такого испытания на стерильность используют три основных способа: испытание на стерильность прямым переносом, испытание на стерильность мембранной фильтрацией и испытание на стерильность промыванием продукта. Проводят общепринятые тесты на стерильность с двумя жидкими питательными средами(триптический соевый бульон (ТСБ), инкубируемый при температуре 20-25 С, и тиогликолятная питательная среда (ТПС), инкубируемая при температуре 30-35 С) и смывающими жидкостями, для них необходима длительность инкубации 14 суток (см., например, USP 71 "Sterility Tests", Pharmacopeial Forum. USP 30-NF 25 through First Supplement The United States Pharmacopeial Convention, Inc.), EP 2.1.6"Sterility" (European Pharmacopoiea 2.1.6 "Sterility" EP 6th Edition (2007 и в других соответствующих фармакопеях. Тиогликолятная питательная среда (ТПС) содержит две части - нижняя часть жидкой среды представляет собой анаэробную часть, верхняя часть содержит кислород для аэробной инкубации. В основном для исследования фармацевтических препаратов на стерильность используют мембранно-фильтрационный способ, при этом эмульгированную или растворенную фармацевтически жидкость или медицинский препарат (например, активные компоненты, парентеральные составы, глазные капли, назальный спрей и т.п.) фильтруют через поры мембраны размером 0,45 мкм, а мембрану переносят в предназначенную испытательную среду (ТПС и ТСБ) и выдерживают в течение 14 суток. Если микробы растут в культуре, то образцы считают нестерильными и забирают для микробиологической идентификации. Большое количество времени, предусмотренное для инкубации, а также для микробиологической идентификации организмов, выращенных в культуре, является не выгодным и ограничивает доступность фармацевтических препаратов для пациентов, нуждающихся в них. Например, во время медицинского кризиса текущие испытания на стерильность, предусматривающие инкубационный период 14 суток, задерживают доступность препаратов или вакцин, сокращая или приводя к концу кризис. Таким образом, необходимо располагать способом скоростного испытания на стерильность. Сущность изобретения Изобретение относится к способу выявления жизнеспособных микроорганизмов в фармацевтической композиции, включающему стадии: а) предоставления способной к фильтрации фармацевтической композиции; b) фильтрования фармацевтической композиции для обеспечения по меньшей мере трех мембранных фильтров, на которых нанесена фильтруемая фармацевтическая композиция; с) расположения по меньшей мере трех мембранных фильтров на однородной среде для культивирования для произведения по меньшей мере трех фильтруемых культур; d) культивирования i) по меньшей мере одной фильтруемой культуры в аэробных условиях при температуре 20-25 С; ii) по меньшей мере одной фильтруемой культуры в аэробных условиях при температуре 30-35 С; и iii) по меньшей мере одной фильтруемой культуры в анаэробных условиях при температуре 30-35 С; при условии, что ни одну из фильтруемых культур не культивировали в течение периода более чем приблизительно 13 суток; е) выявления жизнеспособных клеток микроорганизмов, микроколоний или колоний на мембране, где присутствие жизнеспособных клеток микроорганизмов, микроколоний или колоний указывает на наличие жизнеспособных микроорганизмов в фармацевтической композиции. Способ дополнительно содержит стадию фильтрования смывочного раствора после фильтрования фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления мембрана представляет собой мембрану из поливинилиденфторида, мембрану из стекловолокна, поликарбонатную мембрану, мембрану из полиэтилентерефталата,смешанного целлюлозного эфира (целлюлоза ацетат и целлюлоза нитрат), мембрана из фосфоцеллюлозы, мембрана из диэтиламиноэтила, нейлоновая меш-мембрана или политетрафторэтиленовая мембрана. Предпочтительно размер пор мембраны приблизительно равен 0,45 мкм. Однородные среды для культивирования выбирают из группы, состоящей из ТПС-А (тиогликолятная питательная среда, содержащая 1,075% агар (конечная концентрация, СМВ (агар с сердечномозговой вытяжкой), дрожжевой анаэробный агар Difco, агар R2A, агар Шедлера с добавлением крови,Caso-агар ICR (триптический соевый агар), агар колумбийский с 5% кровью и агар анаэробный CDC с добавлением крови. В некоторых вариантах осуществления способ включает этап культивации фильтруемых культур в течение периода приблизительно от 2 до приблизительно 7 суток. В некоторых вариантах осуществления жизнеспособные клетки микроорганизмов, микроколонии и колонии выявляют, используя люминесцентный анализ, такой как биолюминесцентный анализ, способный выявлять аденозин трифосфат(АТФ), продуцируемый жизнеспособными клетками микроорганизмов, микроколониями или колониями на мембране. Люминесцентный анализ включает люциферазный анализ. В некоторых вариантах осуществления люминесцентный анализ выявляет продукт гибридизации нуклеиновой кислоты, образованный между образцом и нуклеиновой кислотой, эндогенной к микроорганизму. Люминесцентный анализ включает пероксидазную реакцию. В некоторых вариантах осуществления люминесценцию выявляют, используя камеру с полупроводниковой светочувствительной матрицей и программное обеспечение для анализа изображения. В некоторых вариантах осуществления количество жизнеспособных клеток микроорганизмов, микроколоний жизнеспособных микроорганизмов или колоний жизнеспособных микроорганизмов измеряют или подсчитывают. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция представляет собой жидкую композицию. Жидкая композиция является парентеральной композицией, пероральной композицией,назальной композицией, глазной композицией или вакциной. Изобретение также относится к способу выявления жизнеспособных микроорганизмов в фармацевтической композиции, включающему стадии а) предоставления способной к фильтрации фармацевтической композиции; b) фильтрования фармацевтической композиции для обеспечения по меньшей мере трех мембранных фильтров, на которые нанесена фильтруемая фармацевтическая композиция; с) расположения по меньшей мере трех мембранных фильтров на однородной среде для культивирования для произведения по меньшей мере трех фильтруемых культур; d) культивирования i) по меньшей мере одной фильтруемой культуры в аэробных условиях при температуре 20-25 С; ii) по меньшей мере одной фильтруемой культуры в аэробных условиях при температуре 30-35 С; iii) по меньшей мере одной фильтруемой культуры в анаэробных условиях при температуре 30-35 С; при условии, что ни одну из фильтруемых культур не культивировали в течение периода более чем приблизительно 13 суток и е) выявление аденозин трифосфата (АТФ) на мембране, где присутствие АТФ на мембране указывает на наличие жизнеспособных микроорганизмов в фармацевтической композиции. Краткое описание фигур Фиг. 1 представляет собой графическое изображение результатов УФ-обработки М. osloensis во времени при выдержке в пределах 10 мин. Представлено количество колониеобразующих единиц (КОЕ) через четверо суток инкубации. На графике представлено уменьшение КОЕ на 50% или более после 4 мин (3 серии опытов). Фиг. 2 представляет собой графическое изображение результатов термообработки Е.coli во времени при выдержке в пределах 10 мин. Представлено количество колониеобразующих единиц (КОЕ) через трое суток инкубации. На графике представлено уменьшение КОЕ на 50% или более после 3 мин (3 серии опытов). Фиг. 3 представляет собой графическое изображение результатов обработки продукта парентеральным лекарственным средством во времени при выдержке в пределах 10 мин. Представлено количество колониеобразующих единиц (КОЕ) через пять суток инкубации. На графике представлено уменьшение КОЕ на 50% или более после 2 мин (3 серии опытов). Фиг. 4 А представляет собой микрофотографию клетки М. luteus, обработанной при температуре 70 С в течение 3 мин. Фиг. 4 В представляет собой микрофотографию клетки М. luteus, высеянной на триптическом соевом агаре при 30-35 С. Фиг. 5 представляет собой графическое изображение данных оптической плотности необработанной культуры Е.coli, термически обработанной Е.coli, УФ-обработанной Е.coli и обработанной вольтареном Е.coli. Фиг. 6 представляет собой графическое изображение данных оптической плотности необработанной культуры Е.coli, термически обработанной Е.coli, УФ-обработанной Е.coli и обработанной вольтареном Е.coli. Фиг. 7 представляет собой графическое изображение сравнения кривой роста необработанной Е.coli и термически обработанной Е.coli. На протяжении 3 ч угловой коэффициент культуры Е.coli составлял 0,2313, затем возрастая до нормального углового коэффициента необработанной культуры. Фиг. 8 представляет собой графическое изображение сравнения кривой роста необработанного S.aureus и термически обработанного S. aureus. На протяжении 3 ч угловой коэффициент подвергнутой воздействию культуры S. aureus составлял 0,1070, затем возрастая до нормального углового коэффициента необработанной культуры (через 4 ч, 0,4034). Фиг. 9 представляет собой графическое изображение сравнения кривой роста необработанной С.Albicans и термически обработанной С. Albicans. Угловой коэффициент культуры С. Albicans, подвергнутой воздействию на протяжении более чем 8 ч, составляет 0,0419. Фиг. 10 представляет собой графическое изображение сравнения кривой роста необработанной В.pumilus и ослабленной В. pumilus. Клетки подвергали истощению питательных веществ на протяжении семи суток при температуре 2-8 С. На протяжении 5 ч угловой коэффициент подвергнутой воздействию культуры В. pumilus составлял -0,0056, затем возрастая до нормального углового коэффициента необработанной культуры. Фиг. 11 представляет собой микрофотографию, представляющую результаты основного испытания агара Шедлера с добавлением крови. Мембраны MILLIFLEX Rapid MXHVWP 124 инкубировали на агаре Шедлера с добавлением крови в кассетах MILLIFLEX в течение пяти суток при температуре 30-35 С. Фиг. 11 А представляет собой изображение MILLIFLEX Rapid, мембрану в этом случае промывают 100 мл жидкости А. На фиг. 11 В представлена мембрана, промытая 100 мл жидкости D. Подробное описание изобретения Изобретение относится к способу испытания на стерильность, более скоростному, чем общепринятые испытания, предусматривающие инкубационный период, составляющий 14 суток. Способ является наиболее подходящим для скоростного испытания на стерильность способных к фильтрации жидких композиций, таких как жидкие фармацевтические композиции (например, растворы, суспензии, эмульсии, парентеральные композиции, пероральные композиции, назальные композиции, глазные композиции, вакцины). В основном, способ включает фильтрование фармацевтической композиции через мембранные фильтры, перенос мембранных фильтров на однородную среду для культивирования и инкубацию в оптимальных условиях роста в течение периода времени, достаточного для обеспечения пролиферации жизнеспособных микроорганизмов на мембране или продукции достаточного для обеспечения выявления микроорганизмов количества биомолекул, таких как аденозин трифосфат (например, 6, 12 ч, 1 сутки, 2, 3, 4, 5, 6, 7 суток). В одном из аспектов изобретение представляет собой способ выявления жизнеспособных микроорганизмов в фармацевтической композиции. Способ включает фильтрование фармацевтической композиции (например, жидкой фармацевтической композиции) через мембранные фильтры для обеспечения более одного (например, по меньшей мере трех) мембранных фильтров, на которые нанесена фильтруемая фармацевтическая композиция и любые жизнеспособные микроорганизмы, включенные в фармацевтическую композицию. При желании затем фильтруют смывочный раствор с целью вымывания ингибиторов роста, метаболических ингибиторов или выявления ингибиторов мембраны и,таким образом, облегчения выявления микроорганизмов в фильтруемой жидкости. Мембранные фильтры, содержащие фильтрат, помещают на однородной среде для культивирования для произведения по меньшей мере трех фильтруемых культур. Затем фильтруемые культуры культивируют в трех различных условиях: аэробные условия при температуре 20-25 С, аэробные условия при температуре 30-35 С и анаэробные условия при температуре 30-35 С в течение периода культивации в оптимальных условиях роста в течение периода времени, достаточного для обеспечения пролиферации жизнеспособных микроорганизмов на мембране или продукции достаточного для обеспечения выявления микроорганизмов количества биомолекул, таких как аденозин трифосфат. В основном, фильтруемые культуры культивируют в течение периода не более чем приблизительно 13 суток и предпочтительно культивируют в течение периода, более короткого, по существу, чем 13 суток. Затем, фильтруемые культуры оценивают на наличие жизнеспособных клеток микроорганизмов, микроколоний или колоний на мембране, используя подходящий способ. Присутствие жизнеспособных клеток микроорганизмов, микроколоний или колоний указывает на наличие жизнеспособных микроорганизмов в фармацевтической композиции. В одном из аспектов изобретения предоставлен способ выявления жизнеспособных микроорганизмов в фармацевтической композиции, включающий стадии предоставления способной к фильтрации фармацевтической композиции, фильтрования фармацевтической композиции для обеспечения по меньшей мере трех мембранных фильтров, на которые нанесена фильтруемая фармацевтическая композиция, расположения по меньшей мере трех мембранных фильтров на однородной среде для культивирования для произведения по меньшей мере трех фильтруемых культур, культивирования первой фильтруемой культуры в аэробных условиях при температуре 20-25 С, культивирования второй фильтруемой культуры в аэробных условиях при температуре 30-35 С и культивирования третьей фильтруемой культуры в анаэробных условиях при температуре 30-35 С в течение периода культивации не более чем приблизительно 13 суток и выявление аденозин трифосфата (АТФ) на мембране. Присутствие АТФ на мембране указывает на наличие жизнеспособных микроорганизмов в фармацевтической композиции. Используя изобретение, выявляют широкий диапазон микроорганизмов (например, дрожжевые и плесневые грибы, грамположительные спорообразующие бактерии, грамотрицательные бактерии, грамположительные кокки и грамположительные палочки (как аэробные, так и анаэробные микроорганизмы). Способ можно использовать для выявления штаммов АТСС (American Type Culture Collection), а также для выявления окружающих микроорганизмов, способных загрязнять заводы. Например, как описано в настоящем документе, способ можно использовать для выявления Aspergillus brasiliensis ATCC 16404(ранее известный как Aspergillus niger), Bacillus subtilis ATCC 6633, Candida albicans ATCC 10231, Clostridium sporogenes ATCC 11437, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Staphylococcus aureus ATCC 6538,Escherichia coli ATCC 8739, Acinetobacter Iwoffi, Bacillus clausii, Bacillus idriensis, Bacillus licheniformis,Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Corynebacterium afermentans; Kocuria spez., Kocuria rhizophilia (ранее известный как Micrococcus luteus), Moraxella osloensis, Penicillium spez., Propionibacterium acnes, Staphyloccus capitis, Staphylococcus epidermidis и Staphylococcus warneri. В основном, фармацевтическую композицию (например, жидкую фармацевтическую композицию) фильтруют через стерильный мембранный фильтр, используя стерильное или асептическое оборудование под давлением, таким как вакуум или положительное давление. Используют любой подходящий мембранный фильтр и устройство для фильтрования. Примеры подходящего мембранного фильтра включают, например, мембрану из поливинилиденфторида, мембрану из стекловолокна, поликарбонатную мембрану, мембрану из полиэтилентерефталата, смешанного целлюлозного эфира (целлюлоза аце-3 021339 тат и целлюлоза нитрат), мембрану из фосфоцеллюлозы, мембрану из диэтиламиноэтила, нейлоновую меш-мембрану или политетрафторэтиленовую мембрану. Мембранный фильтр, пригодный для использования в описываемом изобретении, содержит поры, размер которых достаточно мал для удержания микроорганизмов, присутствующих в фармацевтической композиции, как, например, размер пор от 0,1 до приблизительно 20 мкм, приблизительно от 0,1 до приблизительно 15 мкм, от 0,1 до приблизительно 12 мкм, от 0,1 до приблизительно 10 мкм, от 0,1 до приблизительно 8 мкм, от 0,1 до приблизительно 6 мкм, от 0,1 до приблизительно 5 мкм, от 0,4 до 12 мкм, от 0,4 до 10 мкм, от 0,4 до 8 мкм, от 0,4 до 6 мкм,приблизительно 0,22 мкм или приблизительно 0,45 мкм. Предпочтительно размер пор мембранного фильтра приблизительно составляет 0,45 мкм. В основном, получают по меньшей мере три мембранных фильтра, содержащих фильтрат. Это совершают посредством фильтрования трех отдельных образцов фармацевтической композиции через три отдельных мембранных фильтра. Это также совершают посредством приготовления и разрезания или разделения одного мембранного фильтра, содержащего фильтрат, на три части, используя стерильное или асептическое оборудование (например, три части приблизительно одинакового размера). Затем,мембранные фильтры, содержащие фармацевтическую композицию, располагают на однородной среде для культивирования для произведения фильтруемых культур. Подходящую однородную среду для культивирования и условия культивирования выбирают таким образом, чтобы поддерживать рост и/или метаболизм необходимых для выявления микроорганизмов. Это совершают посредством скрининга среды для культивирования, как описано и подтверждено примерами в настоящем документе. Предпочтительно однородные среды для культивирования используют в способе, поддерживающем рост широкого спектра микроорганизмов в аэробных и анаэробных условиях культивирования. При желании можно использовать более чем одну среду для культивирования. Например, первой средой для культивирования используют среду, эквивалентную или лучше, чем жидкий триптический соевый бульон для роста дрожжевых грибов, плесневых грибов и аэробных бактерий; второй однородной средой для культивирования выбирают среду, эквивалентную или лучше, чем анаэробная часть тиогликолятной питательной среды для роста анаэробных микроорганизмов, и третьей однородной средой для культивирования выбирают среду, эквивалентную или лучше, чем аэробная часть тиогликолятной питательной среды для роста аэробных микроорганизмов. Предпочтительно простую однородную среду для культивирования применяют как в аэробных, так и анаэробных условиях. Подходящие однородные среды для культивирования, используемые в изобретении, включают, например, ТПС-А(тиогликолятная питательная среда, содержащая 1,075% агар (конечная концентрация, СМВ (агар с сердечно-мозговой вытяжкой), дрожжевой анаэробный агар Difco, агар R2A, агар Шедлера с добавлением крови, Caso-агар ICR (триптический соевый агар), агар колумбийский с 5% кровью и агар анаэробныйCDC с добавлением крови. Агар Шедлера с добавлением крови представляет собой особенно предпочтительную среду для культивирования для применения в способе. Предпочтительно использование однородной среды для культивирования, подходящей для поддержки и/или метаболизма "подвергшихся воздействию" и "не подвергшихся воздействию" микроорганизмов, как описано в настоящем документе. Это желательно, так как микроорганизмы подвергают воздействию, например, гипотоническому или гипертоническому воздействию, излучению (как, например,УФ-излучение, гамма-излучение, микроволны), ультразвуку, высокой, низкой температуре или химическому воздействию (вызываемому, например, посредством хлора или фармацевтических лекарственных средств) во время химического процесса, такого как производство фармацевтической композиции. Фильтруемые культуры инкубируют (т.е. культивируют) в оптимальных условиях роста в течение периода времени, достаточного для обеспечения пролиферации жизнеспособных микроорганизмов на мембране,продукции микроколоний или колоний или продукции достаточного для обеспечения выявления микроорганизмов количества биомолекул, таких как аденозин трифосфат. В основном, одну фильтруемую культуру инкубируют в аэробных условиях при температуре 30-35 С, вторую фильтруемую культуру инкубируют в анаэробных условиях при температуре 30-35 С, а третью фильтруемую культуру инкубируют в аэробных условиях при температуре 20-25 С. В некоторых вариантах осуществления фильтруемые культуры культивируют в течение периода времени, достаточного для обеспечения продукции жизнеспособными микроорганизмами выявляемого количества АТФ, такого как по меньшей мере приблизительно 200 аттомоль АТФ, по меньшей мере приблизительно 200 фетомоль АТФ, по меньшей мере приблизительно 200 пикомоль АТФ или по меньшей мере приблизительно 200 наномоль АТФ. Период культивации приблизительно составляет от 2 до приблизительно 7 суток, приблизительно от 2 до приблизительно 8 суток, приблизительно от 2 до приблизительно 9 суток, приблизительно от 2 до приблизительно 10 суток, приблизительно от 2 до приблизительно 11 суток, приблизительно от 2 до приблизительно 12 суток, приблизительно от 2 до приблизительно 13 суток, приблизительно 6 ч, приблизительно 12 ч, приблизительно 1 сутки, приблизительно 2 суток,приблизительно 3 суток, приблизительно 4 суток, приблизительно 5 суток или приблизительно 6 суток. Инкубационный период для каждой индивидуальной фильтруемой культуры при необходимости может варьировать, и не все фильтруемые культуры нуждаются в одинаковом времени культивирования. Предпочтительное время инкубации варьируется на основании выявляемого микроорганизма. Жизнеспособные клетки микроорганизмов, микроколонии или колонии, представленные на мембранном фильтре после инкубации, выявляют, используя любой подходящий способ, такой как визуальный осмотр, или предпочтительно использование подходящего анализа. Например, для выявления жизнеспособных клеток микроорганизмов, микроколоний или колоний используют люминесцентный анализ(например, люциферазный анализ). Для выявления люминесценции можно использовать любой подходящий способ или систему, такие как камера с полупроводниковой светочувствительной матрицей или программное обеспечение для анализа изображения. Предпочтительно программное обеспечение для анализа изображения используют для измерения или подсчета количества жизнеспособных клеток микроорганизмов, жизнеспособных микроколоний микроорганизмов или жизнеспособных колоний микроорганизмов. В некоторых вариантах осуществления люминесцентный анализ, такой как люциферазный анализ, применяют для выявления аденозин трифосфат (АТФ), продуцируемого жизнеспособными клетками микроорганизмов, микроколониями или колониями на мембранном фильтре. Например, высвобождающий реагент АТФ и биолюминесцентный агент (например, реагент, содержащий люциферазу и люциферин) наносят на мембранный фильтр, и если клетки продуцируют АТФ, то возникает люминесценция. Подходящие реагенты для выявления АТФ посредством люминесценции хорошо известны в данной области и коммерчески доступны (например, набор реагентов MILLIFLEX Rapid; Millipore Corporation,Billerica, Massachusetts). Жизнеспособные клетки микроорганизмов, микроколонии или колонии, представленные на мембранном фильтре после инкубации, выявляют, например, используя люминесцентный анализ для выявления гибридизации образца, подвергающегося гибридизации эндогенной нуклеиновой кислотой. Люминесцентный анализ включает пероксидазную реакцию или другую подходящую реакцию. Реагенты,подходящие для продукции люминесценции посредством активации пероксидазы или других ферментов,хорошо известны и коммерчески доступны. Систему анализа и выявления используют как позволяющую выявлять приблизительно 10-100 дрожжевых клеток или приблизительно 1000 бактериальных клеток. Предпочтительно систему анализа и выявления применяют как позволяющую выявлять единственную клетку или несколько, как, например,приблизительно 100 клеток. Это совершают, например, посредством выявления АТФ, продуцируемого микроорганизмами. Например, коммерчески доступный биолюминесцентный анализ АТФ при использовании в комбинации с коммерчески доступной камерой с полупроводниковой светочувствительной матрицей, устройством обработки изображений и программным обеспечением для анализа изображения (система микробиологического выявления и учета MILLIFLEX Rapid; Millipore Corporation, Billerica, Massachusetts) можно использовать для выявления приблизительно 200 аттомоль АТФ, эквивалентных приблизительно 1 дрожжевой или плесневой клетке или приблизительно 100 бактериальным клеткам. Способ выявления, описываемый в настоящем документе, хорошо подходит для испытания на стерильность фильтруемых композиций, таких как жидкие фармацевтические композиции. Жидкие композиции включают водные композиции, суспензии и эмульсии. Жидкая фармацевтическая композиция является любой жидкостью, подходящей для фармацевтического использования, например, парентеральной композицией, пероральной композицией, назальной композицией или глазной композицией. Вакцина является жидкой композицией. Подходящие вакцины включают, например, вакцину против сибирской язвы (ANT), туберкулезную вакцину из бациллы Кальмета-Герена (BCG), вакцину против белка А Боррелий внешней поверхности(BORospA), вакцину из дифтерийного анатоксина и столбнячного токсина (DT), вакцину из дифтерийного анатоксина и столбнячного токсина и коклюша (DTP), вакцину из дифтерийного анатоксина и столбнячного токсина и бесклеточного коклюша для использования в педиатрии (DTPa), вакцину из дифтерийного анатоксина и столбнячного токсина и бесклеточного коклюша для использования у взрослых(DrTPar), конъюгат вакцины из дифтерийного анатоксина и столбнячного токсина и бесклеточного коклюша и Haemophilus influenzae типа b (DTPa-HIB), конъюгат вакцины из дифтерийного анатоксина и столбнячного токсина и бесклеточного коклюша и Haemophilus influenzae типа b и инактивированного вируса полиомиелита (DTPa-HIB-IPV), вакцину против вируса гепатита A (HAV), вакцину против вируса гепатита А и вируса гепатита В (HAV-HBV), вакцину против вируса гепатита В (HBV), вакцину противHelicobacter pylori (HEL), вакцину против haemophilus influenzae типа b (HIB), конъюгат вакцины Haemophilus influenzae типа b (HIBcn), полисахарид вакцины Haemophilus influenzae типа b (HIBps), вакцину против Haemophilus influenzae типа b (белковый конъюгат дифтерии CRRM 197, олигосахариды, конъюгированные с белковым токсином дифтерии CRM 197; HIB-HbOC, вакцину против вируса гриппа(INF), включая вакцины против птичьего гриппа (например, H5N1, H1N3) и свиного гриппа (например,H1N1), ослабленную живую вакцину против вируса гриппа (INFa), интраназальную ослабленную живую вакцину против вируса гриппа (INF an), инактивированную вакцину против вируса гриппа (INFi), инактивированную вакцину против вируса гриппа с расщепленным вирионом (INFs), инактивированную вакцину против вируса гриппа с расщепленным вирионом типов А и В тривалентная (INFs-АВ 3), цельновирионную вакцину против вируса гриппа (INFw), вакцину против вируса полиомиелита (IPV), вакцину против менингококковой инфекции (neisseria meningitides)e (MEN), конъюгат вакцины против менингококковой инфекции (neisseria meningitides) (MENcn), конъюгат вакцины против менингококковой ин-5 021339 фекции серогрупп А, С(neisseria meningitides) (MENcn-AC), полисахарид вакцины против менингококковой инфекции (neisseria meningitides) серогрупп А, С, Y, W-135 (MENps-ASYW), вирус кори, вирус эпидемического паротита, вирус краснухи vaccine (MMR), вакцину против вируса кори, вируса эпидемического паротита, вируса краснухи и вируса ветряной оспы (MMR-VAR), ослабленную живую пероральную тривалентную вакцину против вируса полиомиелита (OPV), вакцину против пневмококка (Streptococcus pneumoniae) (PNU), конъюгат 7-валентной вакцины против пневмококка (Streptococcus pneumoniae) (PNUcn-7), полисахарид 23-валентной вакцины против пневмококка (Streptococcus pneumoniae)(PNUps-23), вакцину против полиомиелита (POL), антирабическую вакцину (RAB), антирабическую вакцину из культуры диплоидных клеток человека (RAB-HDCV), антирабическую вакцину из очищенной клеточной культуры куриного эмбриона (RAB-PCEC), вакцину против респираторно-синцитиального вируса (RSV), противооспенную вакцину (SMA), противооспенную вакцину (вирус осповакцины) (SMAvac), вакцину из столбнячного токсина и дифтерийного анатоксина (уменьшенное количество антигена для взрослых) (Td), вакцину против токсоплазмоза (toxoplasm gondii) (TOX), тифозную вакцину (Salmonella typhi) (TPD), тифозную вакцину (Salmonella typhi) с ослабленным пероральным штаммом Ту 21 а(TPD-Vi), вакцину против туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis), не BCG (TUB), вакцину против ветряной оспы (ветрянка, вирус varicella zoaster) (VAR). Подходящие парентеральные композиции включают, например, аденозин, алпростадил, амикацина сульфат, азитромицин, блеомицин, цефтриаксон, ципрофлоксацин, цисплатин, дакарбазин, даунорубицин HCl, дефероксамина мезилат, десмопрессина ацетат, дилтиазем, дипиридамол, доксорубицин, эналаприлат, эпирубицин, натрий эпоптостенол, флуконазол, флударабина фосфат, флударабина фосфат, флумазенил, гранистерона гидрохлорид, идарубицина гидрохлорид, изофосфамид, иринотекана гидрохлорид, лейковорин кальций, леупролида ацетат, левокарнитин, медроксипрогестерона ацетат, месна, метилпреднизолона ацетат, метоклопрамид, митоксантрон, налбуфина гидрохлорид, норадреналина кислая соль винной кислоты, остреотида ацетат, ондансетрон, оксалиплатин, окситоцин, паклитаксел, двунатриевый памидронат, панкурония бромид, фенилефрина бромид, фенилефрина гидрохлорид, прометазина гидрохлорид, пропофол, рокуронума бромид, сульфаметоксазол, суматриптана сукцинат, тебуталина сульфат, тестостерона ципионат, тобрамицин, векурония бромид, винкристина сульфат, винорелбина тартрат и стерильный порошок стрептоцизина. Подходящие пероральные композиции включают, например, таблетки ацетаминофена и кодеина фосфат, таблетки ацетаминофена ацетазоламида, капсулы ацикловира, амилорида гидрохлорид, амиодарона гидрохлорид, капсулы амлодипина безилата и беназеприла, таблетки амлодипина безилата, амоксициллин и клавуланат калий, амоксициллин, анагрелид, таблетки дезогестрел и этинил эстрадиола, аспирин, атенолол, таблетки левоноргестрел и этинил эстрадиола, азитромицин, баклофен, беназеприла гидрохлорид, бензонатат, бензатропин мезилат, бетаметазона валерат, бетаметазона дипропионат, бетанхола хлорид, бикалутамид, бисопролола фумарат, бупроприона гидрохлорид, лекарственная форма для ингаляции суспензии будезонида, буметанид, бупропиона гидрохлорид, каберголин, калькарб 600, кальцитраол, таблетки кальция цитрата, таблетки норетиндрона, таблетки каптоприла и гидрохлоротиазида, каптоприл, карбамазепин, карведилол, цефаклор, цефадроксил, цефдинир, цефтрипрозил, цефалексин, цертаген, цертрирезина гидрохлорид, хлоридазэпоксида гидрохлорид, хлорфенирамина малеат, хлорзоксазон, холиноид, цилостазол, циметидина гидрохлорид, циметин, ципрофлоксацин, циталопрам, изотретиноин, кларитромицин, клемастина фумарат, клиндамицин, кломифена цитрат, кломипрамина гидрохлорид, клоназепам, клотримазол, клозапин, кромолин натрий, циклобензаприна гидрохлорид, циклоспорин,циклофетадина гидрохлорид, даназол, деклоцилина гидрохлорид, десмопрессина ацетат, дексметилфенидата гидрохлорид, декстроамфетамина сульфат, диазепам, диклофенак калий, диклоксациллин, диданозин, дилтиазема гидрохлорид, дифенгидрамина гидрохлорид, дипиридамол, дизопирамид фосфат, дивалпроекс натрий, дорзоламида гидрохлорид, доксазозин мезилат, эналаприл малеат, карбамазепин, эстазолам, эстрадиол, эстопитат, этамбутола гидрохлорид, этосукцимид, этодолак, фамцикловир, фамотидин,железистая сера, железо сульфат, фексофенадина гидрохлорид, финастерид, флекаинида ацетат, флуконазол, флудрокортизона ацетат, флуцинонид, флуоксетин, флурбипрофен, флутамид, флувоксамин, фозиноприл натрий, фуросемид, габапентин, галантамина гидробромид, гемфиброзил, глимепирид, глипизид, глюкозамин сульфат, глибенкламид, галоперидол, гидралазина гидрохлорид, гидрохлоротиазид,гидрокодона битартрат, гидроксихлорхинина сульфат, гидроксикарбамид, гидроксизина гидрохлорид,гидроксизина памоат, индометацин, изониазид, кетоконазол, кетопрофен, кеторолак трометамин, лабеталола гидрохлорид, ламотригин, ланзопразол, лефлуномид, лейковорин кальций, леветирацетам, лидокаина гидрохлорид, лизиноприл, лоперамида гидрохлорид, лоразепам, лозартан калийловастатин, мебендазол, медроксипрогестерона ацетат, мегестрола ацетат, мелоксикам, меперидина гидрохлорид, меркаптопурин, месаламин, метформина гидрохлорид, метотрексат, метилдопа, метилпреднизолон, метоклопрамид, метопролола тартрат, метронидазол, метронидазол, мексилетин, миноциклина гидрохлорид, митразапин, мизопростол, моэприла гидрохлорид, мупироцин, микофенолата мофетил, набуметон, надолол,налтрексона гидрохлорид, напроксен, нефазона гидрохлорид, неомицина сульфат, ниацин, нифедипин,-6 021339 нимодипин, низатидин, норетиндрона ацетат, нортриптилина гидрокарбонат, нистатин, офлоксацин,омепразол, ондансетрона гидрохлорид, оксапрозин, оксазепам, оксибутинина хлорид, оксикодон, оксикодона хлорид, пантопразол натрий, пароксетин, пенициллин V калий, пентоксифиллин, фенилгесик,пироксикам, прамипексола дигидрохлорид, правастатин натрий, празозина гидрохлорид, преднизолон,прохлорпемазин малеат, пропафенона гидрохлорид, пропоксифена гидрохлорид, пропранолола гидрохлорид, протирптилина гидрохлорид, хинаприл, хинидина сульфат, рамиприл, ранитидина гидрохлорид,рибавирин, рисперидон, ропинирола гидрохлорид, сенна-S, сеннаген, нитрат серебра, симвастатин, соталола гидрохлорид, сукральфат, тамоксифена цитрат, тамсулозина гидрохлорид, терзозина гидрохлорид,тербинафина гидрохлорид, тетрациклина гидрохлорид, теофиллин, тиклопидина гидрохлорид, толметин натрий, топирамат, торсемид, трамадола гидрохлорид, трандолаприл, тразодона гидрохлорид, третиноин,урсодиол, вальпроевая кислота, венлафаксина гидрохлорид, верапамила гидрохлорид, варфарин натрий,залеплон и золпидема тартрат. Подходящие назальные композиции включают, например, назальные спреи, противомигренозные лекарственные средства, пептидные лекарственные средства (гормональная терапия), анастетики, противорвотные средства, седатики, азеластина гидрохлорид, оксиметазолина гидрохлорид, фенилэфрина гидрохлорид, физиологический раствор, мометазона фуроат, будезонид, ипратропий бромид и назальный спрей кромолин натрий. Подходящие глазные композиции включают, например, лидокаин, пропаракаин, тетракаин, глазной раствор кеторолака трометамина, кеторолак трометамин, глазной нафазолин, бримонидин, азитромицин,бепростатина безилат, безифлоксацин, бетаксон, косопт, дифлюпредат, лотемакс, ранибизумаб, биматопрост, пегаптаниб, офлоксацин, дезаметазон, левофлоксацин, глазной раствор унопростона изопропил,глазная эмульсия циклоспорин, салаген, глазной раствор тревопроста, валганцикловира гидрохлорид,вироптик, цидофовир, вертеформ, витрасерт, витрасен и глазной раствор кетотифена фумарат. Способ, описываемый в настоящем документе, проводят, используя любое подходящее оснащение или аппараты, - и вручную, и автоматически. В одном из предпочтительных аспектов способ проводят,используя коммерчески доступную скоростную микробиологическую систему выявления MILLIFLEX,содержащую образец изучаемой позиции, автоматическое распыление позиции, пункт выявления, анализатор изображения, камеру с полупроводниковой светочувствительной матрицей и компьютер с программным обеспечением (Millipore Corporation, Billerica, Massachusetts). В другом аспекте изобретение представляет собой стерильную фармацевтическую композицию(например, вакцину, глазную композицию, назальную композицию, пероральную композицию, парентеральную композицию), скринируемую на предмет наличия жизнеспособных микроорганизмов, используя способы, описываемые в настоящем документе. Примеры Создание cryo-коллекции штаммов АТСС и экзогенных штаммов от места производства (поверхность или контактные чашки Петри производственного персонала, загрязнение от микрофлоры и исследований на стерильность). Поступающие либо от лиофилизированной культуры (штамм АТСС), либо непосредственно от чашек Петри (экзогенный штамм) микроорганизмы культивировали либо в жидком триптическом соевом бульоне, либо на твердой среде (например, на декстрозном агаре Сабуро) на протяжении оптимального периода времени. Генотипическую идентификацию каждого штамма проводили с использованием системы MicroSeq, Applied Biosystems. Затем культуру центрифугировали при 800G в течение 20-30 мин и осадок ресуспендировали в защитную среду (Oxoid-CM67, содержащую 15% глицерин). Культуру разбавляли, КОЕ (колониеобразующие единицы) проверяли на твердых средах и заполняли 2 мл флаконыNunc CryotubeTM, которые хранили при температуре -80 С. В табл. 1 представлен полный перечень используемых микроорганизмов. А. Изучение факторов воздействия. Воздействие оказывали либо посредством применения УФ-излучения (240-250 мкВт/см 2), тепла(50-70 С на водяной бане) или посредством инкубации микроорганизмов в парентеральных лекарственных средствах в течение 1-10 мин в каждом, забирая аликвотные пробы каждую минуту. Воздействие производили непосредственно на жидкую суспензию исследуемых микроорганизмов в диапазоне до 100 КОЕ. Эффекты воздействия отслеживали посредством уменьшения КОЕ, отслеживали способом определения количества микроорганизмов посевом на чашках Петри и ОП-измерением. Определение количества микроорганизмов посевом на чашках Петри: подвергнутые воздействию микроорганизмы высевали на триптический соевый агар, отслеживая различные эффекты воздействия(воздействия производили в течение 1-10 мин, забирая аликвотные пробы каждую минуту) посредством осаждения аликвотных проб каждую минуту. Результаты окончательно подсчитывали через 2-7 суток (в зависимости от штамма, например, Е.coli и A. niger окончательно подсчитывали через двое суток, последние P. acnes окончательно подсчитывали не ранее, чем через 6 суток инкубации). Измеряли точное время, необходимое для приведения к снижению исходно засеянного количества КОЕ более чем на 50%. ОП-измерение (Х=600 нм): в течение ночи культуры исследуемых микроорганизмов впервые подвергали воздействию (применяли параметры воздействия, определяющие 50% снижение исследуемого предмета), исходно засеивали триптический соевый бульон или тиогликолятную питательную среду(приблизительно 3-4106 КОЕ/мл) и анализировали на протяжении интервала времени до 8 ч (забирая аликвотные пробы для измерения оптической плотности каждый час). Инкубация проходила на вибрационном столе (только для аэробных штаммов). Подвергнутые воздействию культуры сравнивали с неподвергнутыми воздействию культурами. Результаты изучения факторов воздействия с 50% уменьшением. Для каждого микроорганизма из 22 штаммов тестировали 3 параметра воздействия. Измеряли точный параметр (между 1 и 10 мин) каждого фактора воздействия, необходимый для приведения к сниже-8 021339 нию исходно засеянного количества КОЕ более чем на 50%. Исследовали три параметра воздействия: УФ-излучение, тепло и инкубацию микроорганизмов в парентеральных лекарственных средствах. Тепло,например, вызывает повреждение цитоплазматических мембран, денатурацию РНК и приводит к гибели некоторых клеток. УФ-излучение вызывает мутации и остановку репликации ДНК (М. Strus, Rocz PanstwZakl Hie. 48 (3):263-268 (1997. Применение парентеральных лекарственных средств ведет к химическому воздействию на микробные клетки - антимикробные свойства парентеральных лекарственных средств известны длительное время. Фиг. 1-3 представляют примеры, получаемые для Moraxella osloensis, Escherichia coli и AcinetobacterIwoffii. Для каждого из 22 штаммов микроорганизмов найден параметр воздействия, необходимый для снижения исходно засеянного количества 50%. В некоторых случаях наблюдали изменения морфологии колоний (рост колоний замедлен, но позднее наблюдается восстановление нормального размера колонии). Например, Micrococcus luteus демонстрирует уменьшение размера колонии (фиг. 4 а и 4b). Для оценки среды для культивирования скоростного испытания на стерильность важно не только использование широкого диапазона микроорганизмов, но также использование этих микроорганизмов в подвергнутом воздействию состоянии. Некоторые факторы воздействия, такие как химическое воздействие, вызванное парентеральным лекарственным средством, и воздействие радиации, вызванное применением УФ-излучения, уничтожают исходно засеянное количество микроорганизмов. В противоположность, тепловая обработка приводит к инициации уменьшения интенсивности роста некоторых из исследуемых микроорганизмов. Время восстановления поврежденных высокой температурой клеток, как уже докладывали, составляет от 3 до 4 ч, что подтверждено в этом исследовании (М. Warseck, Appl.Microbiol., 26:919-922 (1973. Тепловое воздействие не используют для спорообразующих бактерий,также другие параметры воздействия невозможны, так как спорообразующие бактерии показали широкую устойчивость по отношению к воздействиям (Р. Setlow, J. Appl. Microbiol. 101 (3):514-525 Review(2006. Например, В. pumilus применяют в качестве бактерии индикатора радиации (J. Wong, PDA J.Pharm. Sci. Technol., 58(1):6-14 (2004. В случае спорообразования бактерий применяли различные факторы "воздействия" - воздействовали посредством истощения питательных веществ и, таким образом,индуцировали повышение содержания спор. Последующая оценка питательной среды и статистический анализ выявили, что агар Шедлера с добавлением крови явился лучшей твердой средой для применения в испытании на стерильность. Т-тест для анализа различий между аэробной инкубацией при температуре 20-25 С и при 30-35 С показал значимое различие между температурами. Так как различие было значимым в 11 из 40 случаев, необходимо подтвердить обе инкубационные температуры при скоростном испытании на стерильность. ОП-измерение. Параметры воздействия, определяющие 50% снижение исследуемого предмета, применяли для исследования каждого штамма. Подвергнутые воздействию засеянные микроорганизмы всегда сравнивали с неподвергнутыми воздействию. Микроорганизмы инкубировали либо в триптическом соевом бульоне,либо в тиогликолятной питательной среде (приблизительно 3-4106 КОЕ/мл) и инкубировали на вибрационном столе при температуре 30-35 С (только для аэробных штаммов). Аликвотные пробы отбирали для измерения оптической плотности каждый час (=600 нм). Полученные данные для различной обработки посевного материала (необработанный, термически обработанный, обработанный УФ-излучением,разведенным парентеральным лекарственным средством, время/параметр, используемый при уменьшении 50% продолжительности эксперимента) показали незначительное различие роста кривых в нормальных графиках данных ОП-измерения [фиг. 5]. Графическое изображение данных посредством логарифмирования [фиг. 6] показывает влияние термической обработки на рост кривой Е.coli и образует данные, независимые от исходного количества посевного материала. Так как это нелегко контролировать точно, логарифмический график приобретает это в качестве преимущества. Не отмечено достоверной разницы в росте при обработке бактериальной культуры либо УФ-излучением, либо парентеральным лекарственным средством (с параметрами, используемыми при уменьшении 50% продолжительности эксперимента). Сравнение угловых коэффициентов показало, что только термическая обработка (параметры, используемые при уменьшении 50% продолжительности эксперимента) влияет на рост количества микроорганизмов, а микроорганизмы показывают реальное воздействие. УФ-излучение и парентеральное лекарственное (оба "убивающих фактора", а не "воздействующих фактора") не используют при оценке среды для культивирования. Воздействие на темп роста детально наилучшим образом представлено посредством применения прямой линии и посредством сравнения угловых коэффициентов. Уменьшение углового коэффициента показано для всех микробиологических штаммов в выбранном диапазоне. Примеры,представленные в настоящем документе, представляют собой Е.coli, S. aureus, С. albicans и В. pumilus. В случае Е.coli уменьшение углового коэффициента роста приблизительно в течение 3 ч означает, что этому микроорганизму необходимо около 3 ч для восстановления (фиг. 7).S. aureus показал уменьшение углового коэффициента роста в течение времени около 4 ч (фиг. 8). Дрожжевые грибы С. albicans показали даже более длительное противостояние воздействию. Угловой коэффициент роста оставался уменьшенным на протяжении более 8 ч, в течение ночи подвергнутая воздействию культура восстановила нормальный угловой коэффициент роста (фиг. 9). Для грамположительных спорообразующих бактерий термическая обработка невозможна. Поскольку другие воздействующие факторы - УФ-излучение и разведение в парентеральном лекарственном средстве не показали эффективного воздействия на микроорганизмы, следует найти другие воздействия для спорообразующих бактерий. Для Bacilli и Clostridia вызвано содержание наивысшего количества спор в бактериальной суспензии и представлено ОП-измерение (фиг. 10). Образование спор достигали посредством истощения питательных веществ и хранения разросшейся микробной культуры при температуре от 2 до 8 С более чем 6 суток. Описанным способом исследовали все микроорганизмы. Трудности наблюдали только в трех случаях. Плесневые грибы Penicillium и Aspergillus росли в виде мицелия в жидкой среде, таким образом,точное ОП-измерение не представлялось возможным. Так как данные доступны для С. albicans и для всех исследуемых микроорганизмов, можно предположить, что Penicillium и Aspergillus ведут себя сходным образом. Таким образом, исследуемые параметры брали для оценки среды для культивирования. В другом случае для Propionibacterium acnes (этот штамм лучше растет на ТПС) параметры для уменьшения 50%, определяемые посредством определения количества микроорганизмов посевом на чашках Петри,не воспроизвели в эксперименте ОП-измерения. Время задержки роста наблюдали только при непринятии в расчет более продолжительного интервала времени в сравнении с параметрами уменьшения 50% продолжительности эксперимента. Р. acnes, возможно, показали различные результаты при ОПизмерении во время максимального кислородного воздействия. Для ОП-измерения аликвотные пробы забирали каждый час, проводя постоянное кислородное воздействие P. acnes. Полученные результаты изучения факторов воздействия суммированы в табл. 2. Таблица 2 Перечень микроорганизмов, включая их заданные параметры воздействия Таким образом, такие параметры воздействия, как тепло и истощение питательных веществ, использовали при оценке среды для культивирования. Выбранные способы воздействия, возможно, напоминают способ получения стерильных лекарственных средств. В. Изучение стимуляции роста. Среды для культивирования исследуют с засеянными микроорганизмами (в состоянии, подвергнутом и не подвергнутом воздействию) в приблизительном количестве 10-100 КОЕ. Эксперимент проводили, используя 5 дубликатов для каждого параметра инкубации (параметры инкубации: аэробная инкубация при 20-25 и 30-35 С, анаэробная инкубация при 30-35). Результаты подсчитывали визуально через 2-7 суток инкубации. Результаты первичных данных сгруппировали в 6 групп для каждого микроорганизма: 1) аэробная инкубация при 20-25 С - подвергнутые воздействию микроорганизмы,2) аэробная инкубация при 20-25 С - не подвергнутые воздействию микроорганизмы,3) аэробная инкубация при 30-35 С - подвергнутые воздействию микроорганизмы,4) аэробная инкубация при 30-35 С - не подвергнутые воздействию микроорганизмы,- 10021339 5) анаэробная инкубация при 30-35 С - подвергнутые воздействию микроорганизмы,6) анаэробная инкубация при 30-35 С - не подвергнутые воздействию микроорганизмы. Исследуемые питательные среды группировали вместе в подгруппы. Перечень однородных питательных сред для предварительного отбора (активация роста исследована с 10 штаммами, не подвергнутыми воздействию): ТПС-А (тиогликолятная питательная среда, содержащая добавление агара 10 г/л, приводящее к конечной концентрации 1,075% агар, Amimed, Allschwil, Швейцария; СМВ (агар с сердечно-мозговой вытяжкой, -облученный, Heipha, Eppelheim, Германия; дрожжевой анаэробный агар Difco, -облученный, Heipha, Eppelheim, Германия;Caso-Агар ICR (триптический соевый агар), -облученный, Heipha, Eppelheim, Германия; агар колумбийский с 5% кровью, BioMerieux, Франция; агар анаэробный CDC с добавлением крови, -облученный, Heipha, Eppelheim, Германия. Перечень однородных питательных сред для финального изучения (активация роста исследована с 22 штаммами, не подвергнутыми и подвергнутыми воздействию): дрожжевой анаэробный агар Difco, -облученный, Heipha, Eppelheim, Германия; агар Шедлера с добавлением крови, -облученный, Heipha, Eppelheim, Германия;Caso-Агар ICR (триптический соевый агар), -облученный, Heipha, Eppelheim, Германия; агар анаэробный CDC с добавлением крови, -облученный, Heipha, Eppelheim, Германия. Все -облученные среды дополнили таким образом, чтобы поддерживать процесс облучения. Оценка питательных сред. Оценку исследуемых параметров питательных сред выполняли в 2 части: первый предварительный отбор (активация роста исследована с 10 штаммами, не подвергнутыми воздействию, исследование на восьми агарах) привел к уменьшению количества сред до четырех, где только эти среды предназначены для внимательного рассмотрения. ТПС-А агар, СМВ агар, R2A агар и колумбийский агар с 5% кровью исключили в этом предварительном отборе. При оценке питательных сред следующие четыре среды тестировали детально: триптический соевый агар, агар анаэробный CDC с добавлением крови, агар Шедлера с добавлением крови и дрожжевой анаэробный агар Difco. Полученные данные для каждого из 22 штаммов и в подвергнутом воздействию,и в не подвергнутом воздействию состоянии группировали и статистически анализировали с использованием анализа ANOVA. Три параметра инкубации аэробная инкубация при 20-25 и 30-35 С и анаэробная инкубация при 30-35 С и два различных состояния воздействия (подвергнутые и не подвергнутые воздействию) привели к образованию 6 групп для каждого из микроорганизмов (размноженные посредством 22 штаммов). Каждой из этих групп проводили анализ ANOVA, для каждого из 22 микроорганизмов для каждого агара суммировали баллы за качества хорошей активации. Один бал давали группе/агару за достижение максимального количества. Группа/агар Groups/агар без значимого отличия от этого максимального значения также получала один балл. При аэробной инкубации при 20-25 С - группа агара Шедлера с добавлением крови набрала 30 баллов, агар анаэробный CDC с добавлением крови - 27 баллов, триптический соевый агар набрал 24, а дрожжевой анаэробный агар Difco - 17 баллов (табл. 3 А и 3 В). P. acnes и Cl. sporogenes не набрали баллов, так как они не растут в аэробных условиях. Подвергнутые воздействию А. niger, В. pumilis, В.sphaericus и В. idriensis получили 0 баллов вследствие низкого количества на всех исследуемых агарах (05 КОЕ). Таблица 3 А Общее количество баллов для не подвергнутых воздействию микроорганизмов,культивируемых в аэробных условиях при 20-25 С Таблица 3 В Общее количество баллов для подвергнутых воздействию микроорганизмов,культивируемых в аэробных условиях при 20-25 С При аэробной инкубации при 30-35 С - группа агара Шедлера с добавлением крови набрала 28 баллов, триптический соевый агар набрал 28 баллов, агар анаэробный CDC с добавлением крови - 27 баллов,а дрожжевой анаэробный агар Difco - 24 балла (табл. 4 А и 4 В). P. acnes и Cl. sporogenes не набрали баллов, так как они растут в аэробных условиях. Подвергнутые воздействию В. idriensis и М. osloensis получили 0 баллов вследствие низкого количества на всех исследуемых агарах (0-5 КОЕ). Таблица 4 А Общее количество баллов для подвергнутых воздействию микроорганизмов,культивируемых при 30-35 С Таблица 4 В Общее количество баллов для не подвергнутых воздействию микроорганизмов,культивируемых при 30-35 С При анаэробной инкубации при 30-35 С - агар анаэробный CDC с добавлением крови набрал 25 баллов, агар Шедлера с добавлением крови - 25 баллов, триптический соевый агар - 21, а дрожжевой анаэробный агар Difco набрал 17 баллов (табл. 5 А и 5 В). Подвергнутая воздействию В. idriensis получила 0 баллов вследствие низкого количества на всех исследуемых агарах (0-5 КОЕ). Таблица 5 А Общее количество баллов для не подвергнутых воздействию микроорганизмов,культивируемых в анаэробных условиях при 30-35 С. Не все микроорганизмы растут в анаэробных условиях, таким образом, проводили подсчет не всех микроорганизмов Таблица 5 В Общее количество баллов для не подвергнутых воздействию микроорганизмов,культивируемых в анаэробных условиях при 30-35 С. Не все микроорганизмы растут в анаэробных условиях, таким образом, проводили подсчет не всех микроорганизмов Данные показали, что агар Шедлера с добавлением крови имеет наилучшие качества активации роста в аэробных условиях, в анаэробных условиях он получил такое же количество баллов, что и агар анаэробный с добавлением крови. Таким образом, агар Шедлера с добавлением крови выбрали в качестве подходящего агара для исследования 22 штаммов и трех исследуемых параметров инкубации. Композиция агара Шедлера с добавлением крови (13) (произведенная Heipha, Eppelheim, Германия) представляет собой следующее: 10 г казеинового пептона, 1 г пептона соевой муки, 2 г мясного пептона, 1 г мясной вытяжки, 5 г экстракта дрожжей, 2 г глюкозы, 5 г хлорида натрия, 2,5 г дикалиевого фосфата водорода,14 г агара бактериологического улучшенного, 50 мл крови овцы, аминокислоты, буфер, гемин, витамин К, гамма-облучение: 9-20 кГр. Различия между аэробной инкубацией при 20-25 С и при 30-35 С. Т-тест проводили с использованием данных оценки питательных сред, показывающих выявление значимого отличия между инкубацией при температуре 20-25 С и 30-35 С (аэробная инкубация). Т-тест провели на 40 группах, состоящих из всех аэробных микроорганизмов (без Cl. sporugeloes иP. acnes) в состоянии, подвергнутом воздействию, и состоянии, не подвергнутом воздействию. В 11 группах из 40 выявили значимое отличие. 5 раз параметр инкубации 30-35 С выявил повышение количества колониеобразующих единиц (исходящих из одного посевного материала) в сравнении с группой при 20-25 С. Группа при 20-25 С продуцировала максимальные значения в шести случаях. Т-тест показал наличие значимого отличия между температурами. Так как различие было значимым в 11 из 40 случаев,необходимо утвердить обе инкубационные температуры при скоростном испытании на стерильность. Эти результаты воздействия обеих температур инкубации важны не только для традиционного испытания на стерильность, но также для скоростного испытания на стерильность. Статистический анализ данных. Для статистического анализа первичных данных использовали следующие способы, выполняемые статистическим программным обеспечением Minitab Release 14,20.ANOVA (дисперсионный анализ) использовали для сравнения значений. ANOVA представляет собой анализ, сходный с регрессионным анализом, поэтому его применяют для исследования модели отношений между зависимой переменной и одной или несколькими независимыми переменными (между группами). Его используют для проверки гипотез, т.е. проверяют нулевую гипотезу. Результат ANOVA выражают в значении р. р-Значение обозначает вероятность возникновения ошибки типа 1, или отклонения нулевой гипотезы, когда она соответствует действительности. Порог значения, равный 0,05 - отклонение от нулевой гипотезы, когда р-значение менее 0,05 соответствует доверительному интервалу 95%. Необходимыми условиями для использования анализа ANOVA являются нормальное распределение в четырех подгруппах (питательные среды), р-значение 0,05; проверка на равные дисперсии с использованием критерия Бартлета: р-значение 0,05; критерий Левена: р-значение 0,05. При анализе ANOVA р-значение 0,05 означает отсутствие значимых отличий между подгруппами/агарами, р-значение 0,05 значимое отличие между подгруппами/агарами. Каждый агар, показавший отсутствие значимых отличий по максимальному значению (включая содержащий максимальное значение), оценивали в 1 балл. Агару, показавшему значимое отличие максимального значения, не присваивали баллов. Анализ резко выделяющихся значений проводили с использованием критерия Диксона. (W.J.States Pharmacopeial Convention, Inc.). Для этого значения множества наблюдений N, включенные в анализ, располагали в порядке возрастания: XiX2 XN-. Затем рассчитывали Q-значение (Qexp) статистического эксперимента. Это значение рассчитывали как разность между предполагаемым значением и его ближайшим значением, разделенную диапазоном значений (Q: коэффициент отклонения). Таким образом, для проверки xi или XN (как возможного предполагаемого значения) применяли следующие значения Qexp. Полученное значение Qexp сравнивали с критическим значением Q (Qcrit), найденным в таблице. Если QexpQcrit, допустимое значение характеризовали как предполагаемое и отклоняли. Если нет, допустимое значение сохраняли и использовали во всех последующих подсчетах. Другие способы, способствующие проведению анализа ANOVA, заключались в следующем: исключали подгруппы (четыре питательные среды внутри группы), не соответствующие нормальному распределению и достоверно меньшие, чем другие подгруппы, так как они не применимы при анализе ANOVA. Если КОЕ-значение в подгруппах внутри групп было слишком низким (0-5 КОЕ), как окончательный результат 4 раз, присваивали 0 баллов. Во всех других случаях проводили перепроверку. Т-тест (также используемый статистическим программным обеспечением Minitab Release 14,20) применяли для сравнения значений двух образцов;t-тест сравнивает фактическое различие между двумя значениями в отношении к изменению данных(выражается как стандартное отклонение различий между значениями). С. Общее описание системы микробиологического выявления Millipore Milliflex Rapid. Образцы, подвергаемые проверке (разведенные в 100 мл смывочной жидкости для обеспечения адекватного распределения микроорганизмов на мембране), фильтруют через фильтр Milliflex Rapid,используя насос Mifliflex PLUS, возможные загрязнения осаждают на мембранном фильтре (размер пор: 0,45 мкм). Вслед за фильтрацией фильтр располагают на однородные питательные среды, используя системуMilliflex, где стерильный фильтр Milliflex защелкивают на кассете Milliflex и резко прекращают вытяжку. При этом система Milliflex передает мембрану на питательную среду, что снижает или ведет к полному исчезновению риска повторного заражения через контакт мембраны с руками. Так как кассеты закрыты плотно, риск вторичного заражения во время инкубации низкий. Посредством инкубации фильтров на кассетах Milliflex начинают рост потенциально загрязненного вещества(в). По окончании времени инкубации фильтры отделяют от кассет Milliflex и располагают на автораспыляющей станции внутри вытяжного шкафа с ламинарным потоком. Этапы после инкубации не являются критическими этапами касаемо вторичного заражения, так как микроколонии, выявляемые в Milliflex Rapid, должны быть определенного размера (приблизительно: 10-100 дрожжевых клеток, 1000 бактериальных клеток). Если экзогенные или полученные от оператора микроорганизмы добавляют на мембрану во время этапов после инкубации, их не выявляют при отсутствии инкубации и, таким образом, отсутствует определенное количество АТФ, необходимое для выявления. Автоматическая распыляющая станция распыляет АТФ-высвобождающий агент - и сразу после этого биолюминесцентный реагент на мембране. Химическая реакция, представленная здесь, представляет собой основу выявления The Milliflex(Mg2+ означает магний, АТФ аденозин трифосфат, АМФ аденозин монофосфат, hv высокоскоростной излученный фотон,длина волны) С целью захвата максимального количества излученных фотонов необходим быстрый перенос мембраны с распылителем из автоматической распыляющей станции в установку для выявления MilliflexRapid. Возможный световой сигнал выявляют при помощи ПСМ-камеры (полупроводниковая светочувствительная матрица) и алгоритма подсчета микроколоний программным обеспечением Milliflex,Rapid. В выявлении с помощью Milliflex Rapid отсутствует биолюминесцентный фон. Так как агар Шедлера с добавлением крови используют в микробиологической системе выявленияMilliflex Rapid, контроль проводили, установив, является ли эта среда причиной биолюминесцентного фона. Для этого кассеты со средой инкубировали с мембраной MXHVWP 124 (мембрана из поливинилиденфторида, размер пор равен 0,45 мкм), омытой либо 100 мл жидкости А, либо жидкости D. Температура инкубации составила 30-35 С, инкубация в течение 5 суток. На фиг. 11 представлено отсутствие биолюминесцентного фона от агара Шедлера с добавлением крови, означающее отсутствие повреждения АТФ в гамма-облученной питательной среде. Агар Шедлера с добавлением крови является пригодным для использования в системе Milliflex Rapid. Полные раскрытия всех цитируемых источников в настоящем документе включены в настоящее описание в качестве ссылки. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ контроля стерильности фармацевтической композиции, включающий:a) предоставление поддающейся фильтрации фармацевтической композиции, которую стерилизовали;b) фильтрование фармацевтической композиции для обеспечения по меньшей мере трех мембранных фильтров, на которые нанесена фильтруемая фармацевтическая композиция;c) расположение по меньшей мере трех мембранных фильтров на твердой среде для культивирования для получения по меньшей мере трех фильтруемых культур;d) культивирование i) по меньшей мере одной фильтруемой культуры в аэробных условиях при температуре 20-25 С; ii) по меньшей мере одной фильтруемой культуры в аэробных условиях при температуре 30-35 С; iii) по меньшей мере одной фильтруемой культуры в анаэробных условиях при температуре 30-35 С; при условии, что ни одну из фильтруемых культур не культивировали в течение периода более чем 13 суток; иe) выявление жизнеспособной клетки микроорганизма, микроколонии или колонии на мембране,где присутствие жизнеспособной клетки микроорганизма, микроколонии или колонии указывает на наличие жизнеспособного микроорганизма в фармацевтической композиции. 2. Способ по п.1, где b) дополнительно содержит фильтрование смывочного раствора после фильтрования фармацевтической композиции. 3. Способ по п.1 или 2, где мембрана представляет собой мембрану из поливинилиденфторида,мембрану из стекловолокна, поликарбонатную мембрану, мембрану из полиэтилентерефталата, смешанного целлюлозного эфира (целлюлоза ацетат и целлюлоза нитрат), мембрану из фосфоцеллюлозы, мембрану из диэтиламиноэтила, нейлоновую меш-мембрану или политетрафторэтиленовую мембрану. 4. Способ по п.1, где размер пор мембраны составляет приблизительно 0,45 мкм. 5. Способ по п.1, где твердая среда для культивирования выбрана из группы, состоящей из ТПС-А(тиогликолятная питательная среда, содержащая 1,075% агар (конечная концентрация, СМВ (агар с сердечно-мозговой вытяжкой), дрожжевого анаэробного агара Difco, агара R2A, агара Шедлера с добавлением крови, Caso-агара ICR (триптический соевый агар), агара колумбийского с 5% кровью и агара анаэробного CDC с добавлением крови. 6. Способ по п.1, где на стадии d) фильтруемые культуры культивируют в течение периода времени,достаточного для продукции выявляемого количества АТФ. 7. Способ по п.6, где фильтруемые культуры культивируют в течение периода приблизительно от 2 до приблизительно 7 суток. 8. Способ по п.1, где на стадии е) жизнеспособную клетку микроорганизма, микроколонию или колонию выявляют, используя люминесцентый анализ. 9. Способ по п.8, где люминесцентный анализ выявляет аденозин трифосфат (АТФ), продуцируемый жизнеспособной клеткой микроорганизма, микроколонией или колонией на мембране. 10. Способ по п.8, где люминесцентный анализ включает люциферазный анализ. 11. Способ по п.8, где люминесцентный анализ выявляет продукт гибридизации нуклеиновой кислоты, образованный между образцом и нуклеиновой кислотой, эндогенной к микроорганизму. 12. Способ по п.11, где люминесцентный анализ включает пероксидазную реакцию. 13. Способ по п.8, где люминесценцию выявляют, используя камеру с полупроводниковой светочувствительной матрицей и программное обеспечение для визуального анализа. 14. Способ по п.8, где подсчитывают жизнеспособные клетки микроорганизмов, жизнеспособные микроколонии микроорганизмов или жизнеспособные колонии микроорганизмов. 15. Способ по п.1, где фармацевтическая композиция представляет собой жидкую композицию. 16. Способ по п.15, где жидкая композиция представляет собой парентеральную композицию, пероральную композицию, назальную композицию или глазную композицию. 17. Способ по п.15, где жидкая композиция представляет собой вакцину. 18. Способ по п.17, где вакцина выбрана из группы, состоящей из вакцины против сибирской язвы; противотуберкулезной вакцины; вакцины против боррелиоза; вакцины из дифтерийного анатоксина и столбнячного токсина, вакцины из дифтерийного анатоксина и столбнячного токсина и коклюша; вакцины из дифтерийного анатоксина и столбнячного токсина и бесклеточного коклюша; конъюгат вакцины из дифтерийного анатоксина и столбнячного токсина и бесклеточного коклюша и Haemophilus influenzae типа b; конъюгат вакцины из дифтерийного анатоксина и столбнячного токсина и бесклеточного коклюша и Haemophilus influenzae типа b и инактивированного вируса полиомиелита; вакцины против вируса гепатита А; вакцины против вируса гепатита А и вируса гепатита В; вакцины против вируса гепатита В; вакцины против Helicobacter pylori; вакцины против Haemophilus influenzae типа b; вакцины против вируса гриппа; вакцины против вируса полимиелита; вакцины против менингококка (Neisseriameningitides); вакцины против вируса кори, вируса эпидемического паротита, вируса краснухи; вакцины против вируса кори, вируса эпидемического паротита, вируса краснухи и вируса ветряной оспы; вакцины против пневмококка (Streptococcus pneumoniae); антирабической вакцины; вакцины против респираторно-синцитиального вируса; противооспенной вакцины; вакцины против токсоплазмоза (Toxoplasmgondii); тифозной вакцины (Salmonella typhi); противотуберкулезной вакцины (Mycobacterium туберкулез) и вакцины против ветряной оспы (ветрянки, вирус varicella zoster). 19. Способ по п.17, где указанная вакцина представляет собой вакцину против птичьего гриппа или вакцину против свиного гриппа. 20. Способ контроля стерильности фармацевтической композиции, включающий: а) предоставление поддающейся фильтрации фармацевтической композиции, которую стерилизовали;b) фильтрование фармацевтической композиции для обеспечения по меньшей мере трех мембранных фильтров, на которых нанесена фильтруемая фармацевтическая композиция;c) расположение по меньшей мере трех фильтров/мембран на твердой среде для культивирования для получения по меньшей мере трех фильтруемых культур;d) культивирование i) по меньшей мере одной фильтруемой культуры в аэробных условиях при температуре 20-25 С; ii) по меньшей мере одной фильтруемой культуры в аэробных условиях при температуре 30-35 С; iii) по меньшей мере одной фильтруемой культуры в анаэробных условиях при температуре 30-35 С; при условии, что ни одну из фильтруемых культур не культивировали в течение периода более чем приблизительно 13 суток;e) выявление аденозин трифосфата (АТФ) на мембране, где присутствие АТФ на мембране указывает на наличие жизнеспособного микроорганизма в фармацевтической композиции.